川射干指紋圖譜建立

劉曉鳳 王 姚周思敏曾 堯王 晨劉 濤*

（1.西藏大學(xué)，西藏 拉薩850000； 2.四川天一學(xué)院，四川 綿竹618200； 3.成都大學(xué)，四川 成都 610106）

川射干屬于鳶尾科植物鳶尾Iris tectorumMaxi.的干燥根莖［1］，主產(chǎn)于廣西、廣東、四川等地區(qū)，為四川的道地藥材，氣微，味甘、苦，歸肺經(jīng)，具有清熱解毒、消痰利咽的功效，主治咽喉腫痛、痰咳氣喘?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，川射干在臨床上還具有神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、抑菌等作用［2?5］，具有良好的臨床利用潛力。

2020 年版《中國藥典》 一部收載川射干質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為用HPLC 法測定射干苷含量。據(jù)文獻(xiàn)報道，川射干中還含有鳶尾甲苷A、鳶尾甲苷B、野鳶尾苷、鳶尾苷元、鳶尾甲黃素A、鳶尾甲黃素B 等多種異黃酮成分［6］，具有保護(hù)心肌細(xì)胞、抗炎、抗腫瘤等功效［7?8］，因此，選擇單一的指標(biāo)成分檢測難以判別藥材的優(yōu)劣。本研究建立了川射干HPLC、UV、IR 指紋圖譜，以期對該藥材內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行有效表征、綜合評價和全面控制。

1 材料

P230Ⅱ型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；TU?1810PC 型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Perkin Elmer 公司）；FA2004 分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；101?1?S 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（成都雅源科技有限公司）；PS?40 型超聲波清洗器（深圳得康清潔設(shè)備有限公司）。

川射干均購自四川逢春制藥有限公司，經(jīng)成都大學(xué)劉濤研究員鑒定為鳶尾科植物鳶尾的干燥根莖，批號分別為170102、170108、170114、170123、170127、170206、170211、170221、170325、170331、170602、170608、170611、170615、170621、170708、170715、170723、170728、170813，分別編號為S1～S20，其中S3～S10、S15～S18 產(chǎn)自阿壩金川縣，其他批次產(chǎn)自四川廣元青川縣。射干苷對照品，批號wkq16070103，純度≥98%，購自四川省維克奇生物科技有限公司。甲醇和乙腈為色譜純；其余試劑均為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Global Chromatography C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，20%～24%A；15～25 min，24%～26%A；25～36 min，26%～30% A；36～50 min，30%～32% A；50～70 min，32%～20% A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液制備 取射干苷對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成質(zhì)量濃度為43 μg／mL 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取川射干（過3 號篩）約0.5 g，精密稱定，具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 甲醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（240 W、40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足，搖勻，濾過，取續(xù)濾液l mL，置5 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣6 次，測得各共有峰相對保留時間RSD均小于0.5%，各共有峰相對峰面積RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.5%，相對峰面積RSD 均小于3.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，于0、2、4、6、8、12 h 在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣，測得各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.3%，相對峰面積RSD 均小于4.5%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 圖譜采集 取10 批樣品，按“2.1.2”項下方法平行制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣，結(jié)果見圖1。

2.1.6 圖譜生成 采用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）”，對10 批樣品的指紋圖譜進(jìn)行分析，生成對照指紋圖譜。取射干苷對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下測定，共確定7 個共有峰，1 號峰為射干苷，結(jié)果見圖1。

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.1.7 共有峰相對保留時間及相對峰面積 在HPLC 指紋圖譜中，1 號峰在各批樣品中均有出現(xiàn)，分離度良好，峰面積大，故選作參照峰，將其保留時間和峰面積記為1.000 0，其他共有峰相對保留時間、相對峰面積分別見表1～2。

表1 10 批樣品共有峰的相對保留時間

表2 10 批樣品共有峰的相對峰面積

2.1.8 相似度評價 采用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）”，將10 批樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果分別為0.990、0.997、0.999、0.999、1.000、0.998、0.999、1.000、0.997、0.999，平均值0.998。將相似 度平均 值80%～120%作為相似度變異可接受范圍，擬規(guī)定兩者相似度應(yīng)大于0.798。

2.1.9 驗證試驗 另取10 批樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進(jìn)樣。運(yùn)用中國藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2004A 版）”，將10 批樣品的指紋圖譜與對照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，結(jié)果分別為0.995、0.997、1.000、0.999、1.000、0.999、0.999、1.000、0.999、1.000，符合上述規(guī)定，相對保留時間、相對峰面積分別見表3～4。

表3 10 批樣品（驗證）共有峰的相對保留時間

表4 10 批樣品（驗證）共有峰的相對峰面積

2.2 紫外指紋圖譜建立

2.2.1 光譜掃描條件 以95%乙醇為空白調(diào)整基線，扣除基底影響。光譜掃描條件為光度模式，光譜帶寬2.00 nm，掃描范圍200.00～800.00 nm，掃描間隔1.0 nm，快速掃描。

由于川射干主要成分為黃酮類，其吸光度在紫外光區(qū)，故對照指紋圖譜及相似度均以200～400 nm 處的吸光度為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行建立并計算。

2.2.2 供試品溶液制備 取藥粉約0.5 g，精密稱定，具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 95%乙醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（240 W，40 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，補(bǔ)足，搖勻，濾過（續(xù)濾液稀釋312.5 倍時，圖譜吸光度均處于0.2～0.8 之間），搖勻，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 精密度考察 取同一供試品溶液，在“2.2.1”項條件下連續(xù)掃描6 次，得210、240、266 nm 處紫外吸光度RSD 分別為0.08%、0.52%、0.30%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.2 重復(fù)性考察 取同一批樣品，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.2.1”項條件下進(jìn)行掃描，測得210、240、266 nm 處紫外吸光度RSD 分別為2.95%、2.74%、3.20%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性考察 取同一供試品溶液，于0、0.5、1、1.5、2、3 h 在“2.2.1”項條件下進(jìn)行掃描，測得210、240、266 nm 處紫外吸光度RSD 分別為2.06%、2.02%、3.07%，表明溶液在3 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.4 圖譜采集 取10 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下測定，紫外光譜疊加圖見圖2。

圖2 10 批樣品紫外指紋圖譜

2.2.5 圖譜生成 將“2.2.4”項下紫外圖譜各波長下的吸光度取平均值，并以其建立對照指紋圖譜［9］，見圖3。

圖3 紫外對照指紋圖譜

2.2.6 相似度分析 將10 批樣品的紫外指紋圖譜與對照紫外指紋圖譜經(jīng)IBM SPSS statistics 軟件中雙變量相關(guān)“Kendall 的tau?b”分析計算相似度［10］。結(jié)果，相似度分別為0.991、0.995、0.993、0.996、0.998、0.996、0.990、0.996、0.994、0.995，平均值 為0.994，將其平 均值的80%～120%作為變異可接受范圍，擬規(guī)定兩者相似度應(yīng)大于0.795。

2.2.7 驗證試驗 另取10 批樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項條件下掃描，所得紫外圖譜與對照指紋圖譜各波長下吸光度經(jīng)數(shù)據(jù)處理軟件IBM SPSS statistics 中雙變量相關(guān)“Kendall 的tau?b 分析”計算相似 度。結(jié)果，相似度 分別為0.960、0.961、0.959、0.956、0.956、0.960、0.959、0.960、0.957、0.957、0.957，符合上述規(guī)定。

2.3 紅外指紋圖譜建立

2.3.1 供試品溶液制備 取藥材約0.5 g，精密稱定，具塞錐形瓶中，精密加入25 mL 95%乙醇，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（240 W、40 kHz）處理30 min，放冷，補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過。精密移取0.2 mL 續(xù)濾液于瑪瑙研缽中，吹干溶劑，與約0.1 g 干燥KBr 粉末研磨均勻，于14 MPa真空環(huán)境中壓片1.5 min，即得。

2.3.2 光譜掃描條件 取按“2.3.1”項下方法制備的供試品薄片，放入傅里葉變換紅外光譜儀中掃描，并扣除空氣干擾，掃描范圍4 000～400 cm－1。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 精密度試驗 取藥材粉末約0.5 g，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項條件下連續(xù)掃描6 次。取圖譜中吸收強(qiáng)度最強(qiáng)的10 個峰作為特征峰，測得特征峰波數(shù)RSD［11］均小于0.02%，表明儀器精密度良好。

2.3.3.2 重復(fù)性試驗 取同一批樣品，按“2.3.1”項下方法平行制備供試品溶液6 份，在“2.3.2”項條件下掃描，測得特征峰波數(shù)RSD 均小于0.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3.3 穩(wěn)定性試驗 取藥材粉末約0.5 g，按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項條件下于0、0.5、1、1.5、2、3 h 掃描，測得特征峰波數(shù)RSD 均小于0.02%，表明溶液在3 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 圖譜生成 將20 批樣品按“2.3.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.3.2”項條件下掃描，紅外光譜疊加圖見圖4，各批次吸收峰的波數(shù)見表5。

表5 20 批樣品紅外吸收峰波數(shù)（cm－1）

續(xù)表5

圖4 20 批樣品紅外指紋圖譜

2.3.5 共有峰確定 若組內(nèi)吸收峰的波數(shù)最大差異顯著小于與其相鄰組之間的平均波數(shù)差，就確定該組峰是一組共有峰，反之為變異峰［12?13］。

2.3.6 雙指標(biāo)序列分析法鑒定指標(biāo) 雙指標(biāo)序列為以某一批次樣品作參考，計算其他樣品紅外指紋圖譜的共有峰率和變異峰率，并依次排列而成的序列。

2.3.7 雙指標(biāo)序列分析 對20 批樣品進(jìn)行雙指標(biāo)序列分析，結(jié)果表明，紅外指紋圖譜共有峰率65.22%～100.00%，變異峰率0～27.78%。其中，產(chǎn)自阿壩金川縣的樣品之間共有峰率78.26%～100.00%，變異峰率0～22.22%；產(chǎn)自四川廣元青川縣的樣品間共有峰率73.91%～100.00%，變異峰率0～16.67%，表明同一產(chǎn)地樣品之間共有峰率高，變異峰率低。

3 討論

現(xiàn)有對川射干在質(zhì)量控制方面的研究，多采用HPLC方法測定一種或者多種有效成分含量，方法較為繁瑣，且中藥化學(xué)成分復(fù)雜，測定單一指標(biāo)成分并不能完全代表該藥材的品質(zhì)。而指紋圖譜就是研究以反映中藥的整體化學(xué)特征為立論依據(jù)，對藥品質(zhì)量進(jìn)行整體評價的方法。HPLC指紋圖譜是在確定中藥化學(xué)成分的基礎(chǔ)上對中藥進(jìn)行整體控制，廣泛應(yīng)用于中藥材及中成藥的真?zhèn)蝺?yōu)劣鑒別［14?17］。紫外指紋圖譜可反映中藥中具有不飽和化學(xué)鍵及其共軛體系基本物質(zhì)的吸收情況，并以此控制中藥質(zhì)量［18?19］。紅外指紋圖譜可反映中藥中多種化合物成分飽和鍵的吸收，并確定該中藥中的各種化學(xué)基團(tuán)，以此控制中藥質(zhì)量［11?13］。

本實驗建立了HPLC、UV、IR 指紋圖譜，其中HPLC、UV、IR 指紋圖譜特征均有一定差異，故將多種分析方法聯(lián)合或許能夠減少單一檢測分析方式在某些方面的不足而造成的誤差，使川射干藥材能得到簡便、可靠、完整、健全的質(zhì)量控制。但此方法不能確定藥材中的化學(xué)成分及藥理活性的關(guān)系，有待進(jìn)一步研究。