生地?黃連藥對對LPS誘導大鼠抑郁樣行為的影響

張 優(yōu)，趙 權，李 瑤，孫 紅，陳 影，井 汶，居文政

（南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

黃連為毛茛科植物黃連Coptis chinensisFranch.、三角葉黃連Coptis deltoidea C.Y.Cheng et Hsiao 或云連Copti teetaWall.的干燥根莖，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效，其主要成分生物堿類具有降糖調脂、抗心律失常、抗菌、抗炎和抗腫瘤等作用［1］。生地為玄參科多年生草本植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的塊根，具有清熱涼血，益陰生津之功效，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)生地化學成分環(huán)烯醚萜及其苷類具有調節(jié)血糖、抗胃潰瘍、抗腫瘤、抗衰老、提高免疫力等作用［2］。有很多經(jīng)典方中都含有黃連和生地這兩味藥，如清胃散、朱砂安神丸、黃連丸等。并且已有研究報道單味藥黃連及其組分和復方以及含生地的復方有抗抑郁的作用，而黃連發(fā)揮抗抑郁作用主要有效成分鹽酸小檗堿生物利用度較低，同時在實驗前期，我們研究發(fā)現(xiàn)大劑量的生地的加入能增加黃連中鹽酸小檗堿的溶出率，這與有關文獻所述一致［3］。故本實驗通過建立大鼠抑郁模型，探討生地對黃連改善LPS 誘導的大鼠抑郁樣行為的影響及可能的相關機制研究。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 黃連（貴州同德藥業(yè)有限公司，批號20190701?01），生地（安徽協(xié)和成藥業(yè)飲片有限公司，批號19071817），均由江蘇省中醫(yī)院藥學部副主任中藥師張倩鑒定為正品。艾司西酞普蘭（大連美侖生物技術有限公司，批 號 S0610A）；LPS（美國 sigma公司，批號019M4009V）；TNF?α（批號 20200221）、IL?1β（批號20200216）、IL?6 ELISA（批號20200216）試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，批號P0010）；髓樣分化因子88（MyD88）（批號4283）、核轉錄因子?κB（NF?κB）（批號8242）、磷酸化核轉錄因子?κB（p?NF?κB）（批號3036）抗體（美國CST 公司）；Toll 樣受體4（TLR4）抗體（批號AF7017）、山羊抗兔二抗（批號S0001）、山羊抗鼠二抗（批號S0002）、甘油醛?3?磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體（批號AF7021）、ECL 型超敏發(fā)光液（批號KF001）（美國Affinity 公司）。

1.2 動物 54 只SPF 級SD 雄性大鼠，體質量160～180 g，購自南通大學動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2019?0001。

1.3 藥物制備 分別精密稱定黃連、生地藥材各170 g，混合后第1 次用10 倍量的70%乙醇回流提取45 min，第2次用8 倍量的70%乙醇回流提取30 min，提取液用4 層紗布過濾，合并兩次提取液，減壓濃縮至170 mL，即得黃連生地合提取液（1 ∶1）（1 mL 提取液含生藥量2 g）。黃連提取液以及黃連生地合提取液（1 ∶8）的制備方法同上（1 mL 提取液含生藥量2 g）。各藥物組的黃連量相同，均為170 g。

1.4 儀器 低溫離心機（美國Thermo 公司）；精密天平（日本島津有限公司）；全波長酶標儀（美國Thermo 公司）；電泳及轉膜系統(tǒng)（美國Bio?Rad 公司）；凝膠成像系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；PH 值檢測儀（上海儀電科學儀器股份有限公司）；高通道組織勻漿機（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.5 方法

1.5.1 大鼠抑郁模型建立及給藥 SD 雄性大鼠適應性飼養(yǎng)1 周，將54 只大鼠根據(jù)體質量和糖水偏好率分為空白組、模型組、艾司西酞普蘭組6.3 mg／（kg·d）、黃連組1.67 g／（kg·d）、黃連?生地1 ∶1 組3.34 g／（kg·d）、黃連?生地1 ∶8 組15.03 g／（kg·d）［5］。模型組腹腔注射LPS 0.5 mg／（kg·2 d）［4］，空白組同樣每兩天腹腔注射1 次0.9%氯化鈉，注射容量為5 mL／kg。造模3 周后，糖水試驗結果顯示造模成功，艾司西酞普蘭組按5 mL／kg 腹腔注射給藥，其余5 組灌胃給藥，其中空白組和模型組灌胃等容量的蒸餾水，灌胃容量均為10 mL／kg，連續(xù)灌胃2 周，給藥期間仍需進行造模給藥。

1.5.2 糖水偏好實驗 在進行第1 次糖水實驗之前，先對所有大鼠進行糖水適應，第1 天上午9 點，在每個籠子上放置2 瓶2%蔗糖水；第2 天同樣時間，更換為1 瓶含2%蔗糖水和1 瓶純水；第3 天同樣時間撤掉所有水瓶，禁水禁食24 h；第4 天9 點開始正式進行糖水偏好實驗，給予每只大鼠1 瓶2%蔗糖水和1 瓶純水，測3 h 的糖水偏好，中間1.5 h 時兩水瓶換一下位置。此后糖水偏好實驗不需進行糖水適應，但仍需禁水禁食24 h，糖水偏好率＝（糖水消耗量／總液體消耗量）×100%。

1.5.3 強迫游泳實驗 將大鼠放入高50 cm、直徑20 cm的游泳玻璃容器中，水溫為常溫，水的高度25 cm 左右，保證大鼠爪不觸及容器底面并且不會跳出容器外。游泳時間為5 min，后4 min 記錄大鼠不動時間，以大鼠漂浮在水面無掙扎為不動標準。

1.5.4 敞箱實驗 進行敞箱實驗時，每只大鼠在同一位置放入50 cm×50 cm×50 cm 實驗箱，同時對大鼠活動進行攝像，記錄5 min 內大鼠的水平、垂直活動和修飾次數(shù)，每只大鼠測試完之后清理干凈排泄物并用75%酒精擦拭，以穿越格數(shù)（3 爪以上立在1 格）計水平得分，以直立數(shù)（大鼠兩前肢離地）計垂直得分，以理毛或洗臉數(shù)計修飾得分，計分標準均為1 次1 分。

1.5.5 ELISA 檢測 取大鼠前額皮質和血清，參照ELISA試劑盒說明書檢測TNF?α、IL?1β 及IL?6。

1.5.6 Western blot 檢測 稱取大鼠前額皮質適量，加入10 倍體積的勻漿介質提取蛋白，8 000 r ／min 離心20 min，并按照BCA 蛋白濃度測定試劑盒說明書測定組織勻漿上清液中蛋白濃度為0.5 μg／μL。配置10% 分離膠，先80 V電泳20 min，再用120 V 電泳1 h。200 mA 恒流轉膜70 min。封閉液封閉1 h，分別搖床孵育一抗（TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 稀釋比均為（1 ∶1 000）及GAPDH（1 ∶3 000），4 ℃過夜。TBST 沖洗3 次，10 min／次，孵育二抗（稀釋比1 ∶5 000）1 h，TBST 沖洗3 次，10 min／次，ECL發(fā)光并進行相應的圖像采集處理。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 19.0 軟件進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)均用（）表示，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 對糖水偏好率的影響 與正常組比較，模型組糖水偏好率降低（P＜0.01）；與模型組比較，艾司西酞普蘭組、黃連組以及黃連?生地1 ∶8 組糖水偏好率升高（P＜0.05，P＜0.01），以艾司西酞普蘭組最為顯著（P＜0.01），黃連?生地1 ∶1 組無變化（P＞0.05）。見表1。

2.2 對強迫游泳不動時間的影響 與正常組比較，模型組游泳不動時間增加（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組游泳不動時間均減少（P＜0.05，P＜0.01），艾司西酞普蘭組和黃連?生地1 ∶8 組差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.3 對敞箱得分的影響 與正常組比較，模型組在敞箱實驗中總分降低（P＜0.01）；與模型組比較，艾司西酞普蘭組、黃連組及其與生地配伍組均可提高敞箱實驗總分（P＜0.01），其中黃連組和黃連?生地1 ∶1 組作用相當。見表1。

表1 生地對黃連抗LPS 抑郁大鼠行為學的影響（， n＝9）

表1 生地對黃連抗LPS 抑郁大鼠行為學的影響（， n＝9）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.4 對血清和前額皮質中TNF?α、IL?1β 及IL?6 的影響與正常組比較，模型組血清和前額皮質中TNF?α、IL?1β 和IL?6 的水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃連組、黃連?生地1 ∶8 組以及艾司西酞普蘭組能夠抑制血清和前額皮質 中TNF?α、IL?1β 和IL?6 的分泌（P＜0.05，P＜0.01）；黃連?生地1 ∶1 組血清和前額皮質中IL?6 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），血清中TNF?α 水平下降（P＜0.01）。見表2。

表2 各組大鼠血清和前額皮質中TNF?α、IL?1β 及IL?6 水平（， n＝9）

表2 各組大鼠血清和前額皮質中TNF?α、IL?1β 及IL?6 水平（， n＝9）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.5 對前額皮質中TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 蛋白表達的影響 與正常組比較，模型組前額皮質中TLR4、MyD88、NF?κB 的磷酸化水平均升高（P＜0.01）；與模型組比較，黃連?生地1 ∶1 組可降低前額皮質中TLR4 及NF?κB 的磷酸化的蛋白表達（P＜0.05，P＜0.01）；黃連組、黃連?生地1 ∶8 組以及艾司西酞普蘭組能夠下調前額皮質中TLR4 和MyD88 的蛋白表達及NF?κB 的磷酸化水平（P＜0.05，P＜0.01），其中以艾司西酞普蘭組和黃連組最為顯著。見表3、圖1。

圖1 LPS 大鼠前額皮質中TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 蛋白表達電泳

表3 各組大鼠前額皮質中TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 蛋白表達（， n＝3）

表3 各組大鼠前額皮質中TLR4、MyD88、NF?κB 及p?NF?κB 蛋白表達（， n＝3）

注：與正常組比較，＃＃P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 討論

目前，關于抑郁癥的神經(jīng)和分子機制主要有單胺遞質假說、炎癥免疫假說、氧化應激假說以及神經(jīng)營養(yǎng)因子假說［6］。基于炎癥免疫假說，通過注射LPS 誘導抑郁炎癥模型已有很多相關報道［4，7?8］。同時有文獻［5］基于黃連和生地能抑制細胞的凋亡和炎癥因子的表達來研究黃連和生地不同配伍比例時黃連丸對鏈脲佐菌素糖尿病的影響，其中黃連?生地1 ∶8 為綜合藥理作用最好的配伍比例。而LPS誘導抑郁炎癥模型和通過注射鏈脲佐菌素致糖尿病在炎癥因子上有一定共性，故本實驗通過黃連、經(jīng)典方黃連丸中黃連和生地配伍比例1 ∶1 以及文獻報道治療糖尿病藥效最強的配伍比例1 ∶8 來考察生地對黃連抗LPS 誘導的抑郁作用的影響。

糖水偏好率、敞箱得分、強迫游泳不動時間是抑郁模型常用的主要評價指標，即體現(xiàn)抑郁癥快感缺失、運動不能及行為絕望等特點。TNF?α、IL?1β、IL?6 等促炎性細胞因子相較于其它炎性細胞因子與抑郁癥的關系更為密切［9?11］。TLR4 是Toll 樣天然免疫受體家族中重要成員之一，參與免疫細胞和上皮細胞等的宿主防御功能的表達［12］。NF?κB 是介導炎癥反應及其相關的炎癥因子釋放的核心因子，由P50 和P65 兩個亞基組成二聚體并與其抑制蛋白（Iκ?B）以無活性狀態(tài)存在于胞液當中，當受到外界因素刺激時，Iκ?B 發(fā)生磷酸化，促使NF?κB 二聚體解離，NF?κB p65 入核并激活炎癥相關基因的表達，促進炎癥因子的釋放［13?14］。My D88 既是TLR4 的一個重要的下游轉接蛋白，同時也是NF?κB 信號通路中的一個關鍵性蛋白［15］。故本實驗通過對大鼠腹腔注射LPS 建立大鼠炎癥抑郁模型，TLR4 識別出LPS 發(fā)生活化并經(jīng)My D88 依賴性信號轉導途徑促使NF?κB p65 入核并磷酸化，進而誘導TNF?α、IL?1β、IL?6 等促炎性因子的表達和大鼠抑郁樣行為來研究黃連及其與生地配伍的抗抑郁作用。

本實驗結果表明，與正常組比較，模型組大鼠糖水偏好率和敞箱實驗總分下降，游泳不動時間延長，這提示LPS 誘導作為經(jīng)典抑郁模型成功建立。各給藥組可以改善LPS 誘導的大鼠抑郁樣行為，抑制大鼠血清和前額皮質中TNF?α、IL?1β、IL?6 的分泌 并下調 前額皮質中TLR4、MyD88、NF?κB 的磷酸化水平，其中黃連組抗抑郁綜合療效最顯著，黃連和生地配比1 ∶8 次之。這與文獻報道的相比單味黃連，黃連和生地配比1 ∶8 為治療糖尿病效果最優(yōu)結果不完全一致，考慮可能是由于兩實驗造模給藥以及造模模型不相同所致。所以黃連可以發(fā)揮抗抑郁作用，這可能與TLR4／MyD88／NF?κB 介導的抗抑郁的作用機制有關，但生地的加入對于單味黃連抗抑郁作用無協(xié)同增效作用。