貞芪扶正顆粒輔助奧沙利鉑治療H22 移植瘤小鼠的療效及其對(duì)Bax、Bcl?2 表達(dá)的影響

周熙祥伍志偉*張錄梅金 華劉永琦 薛 娜顏春魯孫文平

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州730000； 2.甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000； 3.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州730000； 4.甘肅省腫瘤醫(yī)院腹外二科，甘肅 蘭州 730000）

肝癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率位居世界癌癥死亡率的第4 位，在男性癌癥死亡率中位居第2 位，肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是原發(fā)性肝癌中的主要亞型，約占75%～85%［1］。目前，肝癌的臨床治療多采用外科切除和放化療措施，但外科切除常因多發(fā)灶及轉(zhuǎn)移的發(fā)生導(dǎo)致HCC 患者的死亡率較高，放化療后可出現(xiàn)中性粒減少、貧血、腹瀉、手足皮膚反應(yīng)等不良癥狀，從而導(dǎo)致患者的生存質(zhì)量降低［2?3］。

奧沙利鉑（L?OHP）為一類(lèi)具有體外細(xì)胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性的廣譜抗癌藥物，但在臨床治療過(guò)程中產(chǎn)生的多種不良反應(yīng)嚴(yán)重制約了其應(yīng)用。已有研究表明，中醫(yī)藥辨證施治、扶正祛邪、陰平陽(yáng)秘等整體理念與西醫(yī)的局部治療理論互補(bǔ)，在增強(qiáng)西藥療效、降低毒副作用、提高機(jī)體免疫力等方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)［4?6］。因此，中西醫(yī)聯(lián)合治療肝癌或許能達(dá)到優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)和標(biāo)本兼治的效果，對(duì)提升患者的生存率和改善生存質(zhì)量有重要意義。本實(shí)驗(yàn)選用貞芪扶正顆粒與奧沙利鉑聯(lián)合，經(jīng)常規(guī)觀察、瘤體檢測(cè)、病理檢查等方法進(jìn)行療效分析，全自動(dòng)蛋白電泳和qPCR 檢測(cè)Bax、Bcl?2 腫瘤相關(guān)分子，這將為揭示聯(lián)合用藥治療肝癌的分子機(jī)制、拓展該中成藥的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與藥物 貞芪扶正顆粒（甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司，批號(hào)K20180536）；注射用奧沙利鉑（齊魯制 藥有限公司，批 號(hào)2A2E16120138）；Bcl?2 鼠源性一抗（美國(guó)Imuno Way 公司，批號(hào)B4101）；Bax 兔源性一抗（美國(guó)GeneTex 公司，批號(hào)39988）；GAPDH 兔源性一抗（美國(guó)GeneTex 公司，批號(hào)42977）；EZ Standard PACK 1（美國(guó)Proteinsimple 公司，批號(hào)88335）；Anti?Rabbit Detection Module（美國(guó)proteinsimple 公司，批號(hào)17404）；Jes／Wes Separation 12?230kDa（美國(guó)proteinsimple 公司，批號(hào)20933）；Jess／Wes Separation 12?230kDa（美國(guó)proteinsimple 公司，批號(hào)20933）；10× Sample Buffer（美國(guó)proteinsimple公司，批號(hào) 86719）；Wash Buffer（美國(guó)proteinsimple 公司，批號(hào)86532）；Real Time qPCR試劑盒（日本TaKaRa 公司，批號(hào)AI82513A）；TRIzol（美國(guó) ambion 公司，批號(hào)175702）；Nuclease?Free Water（美國(guó)Promega 公司，批號(hào)0000070302）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega 公司，批號(hào)0000366052）。

1.2 儀器 BX61 光學(xué)顯微鏡（日本Olympus 公司）；1?14K 高速低溫冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma 公司）；DW?86L626 超低溫冰箱（青島海爾電器有限公司）；CP214 精密電子天平（美國(guó)奧豪斯儀器有限公司）；WS?2932 proteinsimple Wes（美國(guó)Santa Clara 公司）；S1000TM 逆轉(zhuǎn)錄儀、BIOMATE 3S 核酸蛋白測(cè)定儀、iMARK 酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio?Rad 公司）；EG1150 石蠟包埋機(jī)、CM3050 組織切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）。

1.3 細(xì)胞 H22肝癌細(xì)胞株，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.4 動(dòng)物 SPF 級(jí)KM 雄性小鼠72 只，體質(zhì)量（20±2）g，購(gòu)自甘肅中醫(yī)藥大學(xué)科研動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（甘）2015?0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（甘）2015?0005，飼養(yǎng)于相對(duì)濕度45%～55%，溫度21～25 ℃的環(huán)境中，以標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料及無(wú)菌水飼養(yǎng)。

1.5 方法

1.5.1 模型構(gòu)建 參照文獻(xiàn)［7］ 報(bào)道，將體外增殖的H22肝癌細(xì)胞以無(wú)菌PBS 稀釋至1×105／mL，取200 μL 經(jīng)腹腔注射接種于小鼠體內(nèi)；馴化培養(yǎng)后抽取腹水細(xì)胞，無(wú)菌生理鹽水稀釋至2×106／mL；抽取細(xì)胞懸液100 μL，采用皮下注射法接種于小鼠前肢右側(cè)腋下。

1.5.2 分組與給藥 72 只SPF 級(jí)KM 種小鼠在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d 后，隨機(jī)分為空白組、模型組、奧沙利鉑組、奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組、奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中劑量組、奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒低劑量組。除空白組外，其余各組按“1.5.1”項(xiàng)下方法建立H22移植瘤小鼠模型。待瘤體達(dá)到100～300 mm3（植瘤第3 天）后開(kāi)始給藥。取貞芪扶正顆粒溶于無(wú)菌水中，奧沙利鉑凍干粉溶于葡萄糖水注射液中，空白組正常飼養(yǎng)，模型組以0.1 mL／10 g 無(wú)菌水灌胃（1 次／d），并以0.1 mL／10 g 葡萄糖注射液腹腔注射（1 次／2 d），奧沙利鉑組和奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組以10 mg／kg 腹腔注射奧沙利鉑（1 次／2 d），奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組同時(shí)分別以0.026、0.013、0.007 g／kg 貞芪扶正顆粒溶液灌胃（1 次／d）。

1.5.3 體質(zhì)量測(cè)定 造模完成后，于給藥前及給藥后5、10 d 固定時(shí)間段內(nèi)，分別稱取小鼠體質(zhì)量，計(jì)算其變化。

1.5.4 瘤體測(cè)量、抑瘤率測(cè)定 游標(biāo)卡尺測(cè)量給藥前及給藥后5、10 d 各組小鼠瘤體長(zhǎng)徑a（mm）和短徑b（mm），以公式V＝ab2／2 計(jì)算腫瘤體積（V）。末次給藥24 h 后處死小鼠，剝離瘤體組織，稱重并計(jì)算藥物抑瘤率，公式為抑瘤率＝ ［（對(duì)照組平均瘤質(zhì)量－治療組平均瘤質(zhì)量）／對(duì)照組平均瘤質(zhì)量］ ×100%。

1.5.5 脾臟質(zhì)量及指數(shù)測(cè)定 末次給藥24 h 后處死小鼠，剝離脾臟組織，生理鹽水漂洗、稱重，計(jì)算脾臟指數(shù)，公式為脾臟指數(shù)＝脾臟質(zhì)量／小鼠體質(zhì)量。

1.5.6 瘤體Bcl?2、Bax 免疫組化分析 石蠟切片經(jīng)脫蠟與水化、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶清除、抗原修復(fù)、一抗與二抗孵育、DAB 顯色等過(guò)程后，具體參照文獻(xiàn)［8］，置于200 倍光鏡下檢測(cè)，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)黃褐色者為陽(yáng)性。

1.5.7 瘤體Bcl?2、BaxmRNA 表達(dá)檢測(cè) 稱取0.1 g 瘤體組織，應(yīng)用TRIzol 法提取RNA，微量分光光度法檢測(cè)RNA 含量與純度，qPCR 法檢測(cè)瘤體組織中Bcl?2、BaxmRNA 表達(dá)，具體操作參照日本 TaKaRa公司qPCR 試劑盒說(shuō)明書(shū)。以GAPDH 為內(nèi)參，采用2—△△Ct法計(jì)算Bcl?2 和Bax基因mRNA 的相對(duì)水平，每組設(shè)4 個(gè)重復(fù)，6 個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。引物由杭州科寶生物科技有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.5.8 瘤體Bcl?2、Bax 蛋白表達(dá)檢測(cè) 稱取瘤體組織0.1 g，剪碎，加入組織裂解液，勻漿，4 ℃靜置15 min，每5 min 渦旋振蕩30 s，離心后取上清分裝，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，具體操作參照BCA 試劑盒說(shuō)明書(shū)。Wes 全自動(dòng)蛋白分析系統(tǒng)檢測(cè)瘤體組織中Bcl?2、Bax 蛋白表達(dá)，具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)；以GAPDH 為內(nèi)參，應(yīng)用Image J軟件測(cè)算灰度值，對(duì)比分析瘤體組織中Bcl?2 和Bax 蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.5.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)SPSS 18.0 軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以（）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用One way ANOVA 中的LSD 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量 給藥后5、10 d，模型組小鼠體質(zhì)量增速明顯高于奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組（P＜0.05），5 d 增幅大于10 d；空白組較模型組增重緩慢（P＞0.05）；奧沙利鉑組與奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒低劑量組間及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組與奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中劑量組間體質(zhì)量增幅無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量（， n＝12）Tab.2 Body weights of mice in various groups（， n＝12）

表2 各組小鼠體質(zhì)量（， n＝12）Tab.2 Body weights of mice in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，*P＜0.05。

2.2 瘤體體積 給藥后5 d，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組較模型組瘤體體積增速慢（P＜0.05），與奧沙利鉑組比較，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組體積較?。≒＜0.05）。給藥后10 d，奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組小鼠瘤體體積明顯小于模型組（P＜0.05），其中奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組小鼠瘤體體積小于奧沙利鉑組（P＜0.05）；藥物組瘤體體積依次為奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒低劑量組＞奧沙利鉑組＞奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中劑量組＞奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組，見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠瘤體體積（， n＝12）Tab.3 Tumor volume of mice in various groups（， n＝12）

表3 各組小鼠瘤體體積（， n＝12）Tab.3 Tumor volume of mice in various groups（， n＝12）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，＃P＜0.05。

2.3 瘤體質(zhì)量、抑瘤率 奧沙利鉑組，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組瘤體質(zhì)量低于模型組（P＜0.05）；奧沙利鉑組瘤體質(zhì)量高于奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組（P＜0.05）；奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組抑瘤率均高于奧沙利鉑組，見(jiàn)表4。

表4 各組小鼠瘤體質(zhì)量、抑瘤率（， n＝12）Tab.4 Tumor weights and tumor inhibition rates of mice in various groups（， n＝12）

表4 各組小鼠瘤體質(zhì)量、抑瘤率（， n＝12）Tab.4 Tumor weights and tumor inhibition rates of mice in various groups（， n＝12）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，＃P＜0.05。

2.4 脾臟質(zhì)量及指數(shù) 空白組，奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組脾臟質(zhì)量和脾臟指數(shù)低于模型組（P＜0.01）；空白組與奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；奧沙利鉑組，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組比較，依次為奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組＞奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中劑量組＞奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒低劑量組＞奧沙利鉑組，但組間無(wú)明顯變化（P＞0.05），見(jiàn)表5。

表5 各組小鼠脾臟質(zhì)量及指數(shù)（， n＝12）Tab.5 Spleen weights and indices of mice in various groups（， n＝12）

表5 各組小鼠脾臟質(zhì)量及指數(shù)（， n＝12）Tab.5 Spleen weights and indices of mice in various groups（， n＝12）

注：與空白組比較，＃P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01。

2.5 瘤體Bax、Bcl?2 蛋白表達(dá) 如圖1～2 所示，與模型組比較，奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒中、低劑量組均上調(diào)（P＜0.05）；奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組上調(diào)極明顯（P＜0.01）。Bcl?2 在奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組瘤體組織中表達(dá)均較模型組低，其中奧沙利鉑組和奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組更明顯（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠瘤體Bax 蛋白表達(dá)（IHC，×200）Fig.1 Bax expressions in tumor tissues of mice in various groups（IHC，×200）

2.6 瘤體Bax、Bcl?2 mRNA 表達(dá) 與模型組比較，奧沙利鉑組及奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組瘤體組織中Bcl?2 mRNA 表達(dá)下降（P＜0.05）；與奧沙利鉑組比較，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中劑量組瘤體組織Bcl?2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05），而B(niǎo)ax的mRNA 表達(dá)在奧沙利鉑組，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中、低劑量組中升高（P＜0.05），見(jiàn)表6。

表6 各組小鼠瘤體Bcl?2、 Bax mRNA 表達(dá)（， n＝12）Tab.6 Bcl?2 and Bax mRNA expressions in tumor tissues of mice in various groups（， n＝12）

表6 各組小鼠瘤體Bcl?2、 Bax mRNA 表達(dá)（， n＝12）Tab.6 Bcl?2 and Bax mRNA expressions in tumor tissues of mice in various groups（， n＝12）

注：與模型組比較，*P＜0.05；與奧沙利鉑組比較，＃P＜0.05。

圖2 各組小鼠瘤體Bcl?2 蛋白表達(dá)（IHC，×200）Fig.2 Bcl?2 expressions in tumor tissues of mice in various groups（IHC，×200）

2.7 瘤體Bax、Bcl?2 蛋白表達(dá) 與模型組比較，各治療組瘤體組織中Bcl?2 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；與奧沙利鉑組比較，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高劑量組瘤體組織中Bcl?2 蛋白表達(dá)下降（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；與奧沙利鉑組比較，奧沙利鉑＋貞芪扶正顆粒高、中劑量組瘤體組織中Bax 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3，與“2.6”項(xiàng)下結(jié)果一致。

圖3 各組小鼠瘤體Bcl?2、Bax 蛋白表達(dá)Fig.3 Bcl?2 and Bax protein expressions in tumor tissues of mice in various groups

3 討論

在中醫(yī)理論中，肝癌病因多樣，病機(jī)復(fù)雜。根據(jù)其臨床癥狀，可將肝癌歸納于“積聚”的范疇。積者有形，《醫(yī)宗必讀》 中說(shuō)：“積之成者，正氣不足，而后邪氣距之?！逼洳C(jī)為臟腑正氣不足，內(nèi)被七情所困，外有六淫所擾，多種病因交相互結(jié)，致氣滯痰凝，熱毒痰蘊(yùn)，進(jìn)而導(dǎo)致陰陽(yáng)失調(diào)，氣血逆亂，日久成積，化成腫瘤。此說(shuō)正如《內(nèi)經(jīng)》 中“正氣存內(nèi)，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”的觀點(diǎn)。肝臟體陰用陽(yáng)，邪氣耗傷肝中陰液，導(dǎo)致肝風(fēng)化熱，熱熾津傷，煉液成痰，痰凝日久，積而成瘤。有現(xiàn)代醫(yī)家提出了“陰虛癌毒”的假說(shuō)［9］，根據(jù)癌細(xì)胞過(guò)度異常增生的屬性將癌毒歸于陽(yáng)亢的范疇，陰虛不能制約亢陽(yáng)，輕陽(yáng)壅盛，蘊(yùn)久而化為癌毒。貞芪扶正顆粒由女貞子、黃芪2 味藥組成，可以扶助人體正氣，符合金元大家張?jiān)氐摹梆B(yǎng)正積自除”的思想。女貞子最先記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其性涼，味甘、苦，歸肝、腎經(jīng)，有益肝腎之陰的功效?！恫荼窘?jīng)疏》 中說(shuō)：“女貞子氣味俱陰”，是補(bǔ)陰要品。黃芪在《神農(nóng)本草經(jīng)》 中被列為“上品”，明代醫(yī)家李時(shí)珍稱其為“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”。其性微溫，味甘，歸肺、脾經(jīng)，有補(bǔ)氣升陽(yáng)，益氣固表，利水消腫，脫瘡生肌的功效。二藥相須為用，有益氣滋陰的功效。本研究以此為理論指導(dǎo)，選擇滋陰扶正類(lèi)中藥——貞芪扶正顆粒與具有體外細(xì)胞毒性和體內(nèi)抗腫瘤活性的奧沙利鉑聯(lián)合，以增強(qiáng)奧沙利鉑的抗腫瘤活性和減少其骨髓抑制等毒副作用。通過(guò)常規(guī)觀察、小鼠體質(zhì)量、脾臟質(zhì)量、瘤體體積、抑瘤率等相關(guān)指標(biāo)分析，提示在H22肝癌模型小鼠實(shí)驗(yàn)中貞芪扶正顆粒具有輔助奧沙利鉑增效減毒的作用。

課題組對(duì)黃芪活性成分進(jìn)行了大量的研究。已有研究表明，黃芪多糖可以上調(diào)白介素IL?1α、IL?2、IL?6、Bax 等的表達(dá)和下調(diào)IL?10、Bcl?2 等的表達(dá)，提高脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，對(duì)H22肝癌小鼠有明顯的抗腫瘤作用［7］；黃芪甲苷可抑制HCC 細(xì)胞的上皮?間質(zhì)轉(zhuǎn)化和遷移，下調(diào)lncRNA?ATB 表達(dá)使IL?11／STAT3 信號(hào)失活，從而誘導(dǎo)HCC 細(xì)胞發(fā)生凋亡［10］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，女貞子補(bǔ)腎陰，具有抗骨髓抑制的功效，其活性成分紅景天苷、多糖、齊墩果酸等具有抗腫瘤的功能［11］，其乙醇提取物通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl?2、Bax、caspase?3（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶）、TIMP2（組織抑制因子）、基質(zhì)金屬蛋白酶MMP?2 及MMP?9 的表達(dá)來(lái)抑制細(xì)胞的遷移和侵襲，亦可通過(guò)PTEN（磷酸酶基因）的DNA 去甲基化來(lái)抑制PI3K／Akt 磷酸化，從而抑制肝癌的生長(zhǎng)［12］。Bcl?2 和Bax 具有控制線粒體膜的通透性從而調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡的作用［13?14］，二者功能相互對(duì)立，如同中醫(yī)理論中的正氣與邪氣——正氣存內(nèi)，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與奧沙利鉑組比較，貞芪扶正顆粒與奧沙利鉑聯(lián)合用藥后的抑瘤效果顯著，其中高劑量組抑瘤效果最為明顯，提示貞芪扶正顆粒可以輔助提高奧沙利鉑的療效，且貞芪扶正顆粒的劑量越大，抑瘤效果越明顯。在奧沙利鉑治療后，小鼠的體質(zhì)量下降，脾臟功能也受到損傷，而貞芪扶正顆粒對(duì)小鼠的體質(zhì)量、脾臟有明顯保護(hù)的作用，且與給藥劑量呈正相關(guān)。此外，貞芪扶正顆?？梢燥@著下調(diào)Bcl?2 的蛋白基因表達(dá)，上調(diào)Bax 的蛋白基因表達(dá)，同樣與給藥劑量呈正相關(guān)性，提示奧沙利鉑聯(lián)合貞芪扶正顆?？赡芡ㄟ^(guò)改善Bcl?2 與Bax 的表達(dá)來(lái)提升正氣，從而抵抗邪氣，最終達(dá)到抑制肝癌的效果。