• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-100-5p對胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的作用及機制研究

    2021-09-27 02:26:30李紹軍胥錢平杜麗英
    臨床誤診誤治 2021年9期
    關(guān)鍵詞:奧沙利細(xì)胞系試劑盒

    雷 益,李紹軍,胥錢平,馮 成,杜麗英

    胃癌是常見惡性腫瘤,為與腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因,2018年估計有783 000例胃癌患者死亡[1]?;?、放療和胃切除術(shù)是治療胃癌的主要方法,盡管近年這些治療方法的實施取得了長足進步,但胃癌晚期患者總體5年生存率仍不到30%[2]。目前,晚期轉(zhuǎn)移和化療耐藥仍是胃癌患者治療的主要障礙[3]。因此,胃癌分子機制研究是探討胃癌新治療策略的重要途徑。miRNA是非編碼RNA之一,雖然不具備編碼功能,但是其在腫瘤等疾病中的作用逐漸被挖掘[4]。miR-100-5p是與腫瘤密切相關(guān)的miRNA之一,可發(fā)揮抑癌作用和促癌作用。有研究顯示,miR-100-5p在前列腺癌、肝細(xì)胞肝癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中表達(dá)異常,不僅與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),還可調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥[5-7]。Chen等[8]報道m(xù)iR-100-5p通過抑制mTOR信號通路參與長鏈非編碼RNA HAGLROS促進胃癌惡性進展,但是miR-100-5p在胃癌中的表達(dá)及發(fā)揮的具體生物學(xué)功能現(xiàn)仍未知。因此,本研究探討miR-100-5p對胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的作用及機制,旨在獲得miR-100-5p抗胃癌治療的潛在分子靶點。

    1 材料與方法

    1.1一般資料 選取2017年1月—2019年6月于四川大學(xué)華西醫(yī)院眉山醫(yī)院行根治性手術(shù)的胃癌患者標(biāo)本,收集經(jīng)病理檢查證實的胃癌組織和癌旁組織(距離腫瘤5 cm的非胃癌組織),患者術(shù)前未接受過任何形式治療并簽署相關(guān)知情同意書,共納入70例。70例中男37例,女33例;年齡≤60歲28例,>60歲42例;腫瘤直徑:<5 cm 50例,≥5 cm 20例;分化程度:高分化12例,中分化15例,低分化43例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有39例,無31例;Duke分期:Ⅰ期18例,Ⅱ期20例,Ⅲ期24例,Ⅳ期8例?;颊咝g(shù)后進行以鉑類為主的一線化療,化療方案為奧沙利鉑第1天和第7天100 mg/m2靜脈滴注2 h,7 d為1個療程,共化療5個療程。隨訪追蹤患者治療后效果,主要包括復(fù)發(fā)和疾病進展,70例中化療有效37例,無效33例。

    1.2試劑和材料 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,RNA提取試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司,miR-100-5p和內(nèi)參U6引物由上海生工試劑公司合成,胰蛋白酶、細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司,胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,miR-100-5p mimic購自廣州瑞博生物試劑有限公司,MTS試劑和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑有限公司,Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司,RIPA裂解液購自上海貝博生物科技公司,PVDF膜購自美國Bio-Rad,ERK1/2、pERK1/2和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司,ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上?;鄯f生物科技有限公司。

    1.3qRT-PCR 在胃癌組織和癌旁組織中加入Trizol裂解液于研缽中研磨裂解,采用RNA提取試劑盒提取組織中總的RNA。采用UltraRT One-step RT-PCR試劑盒進行RNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR,其體系為10X One Step RT-PCR Buffer 1 μl、上下游引物各0.4 μl、RNA 0.2 μg、RNase mimic 0.1 μl、AMV RT 0.1 μl、Taq DNA polymerase和無RNA酶的雙蒸水補足10 μl。反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄45 ℃20 min、94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s 30個循環(huán),72 ℃終延伸10 min。miR-100-5p引物F:5'-GAACCCGTAGATCCGAACT-3',R:5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3';U6引物F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',R:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按照2-ΔΔCt公式以U6為內(nèi)參計算miR-100-5p的相對表達(dá)量。

    1.4細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1,并放置在37 ℃含有5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中。采用胰酶消化進行細(xì)胞傳代。細(xì)胞長滿時收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA。采用qRT-PCR檢測各細(xì)胞中miR-100-5p的表達(dá)。選取miR-100-5p表達(dá)最低的細(xì)胞系進行細(xì)胞接種,以每孔2×105個細(xì)胞接種至6孔板中,分為NC組和miR-100-5p mimic組,細(xì)胞貼壁12 h后進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,NC組轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體2000與對照mimic混合液,miR-100-5p mimic組轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體2000與miR-100-5p mimic混合液,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后采用qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-100-5p的表達(dá)。

    1.5MTS實驗檢測細(xì)胞增殖能力 NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞以每孔2000個接種至96孔板中,每組設(shè)置6個重復(fù)孔,分別在貼壁0、24、48和72 h時,每孔更換100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTS試劑,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,采用全波長掃描儀檢測細(xì)胞在490 nm處的OD值。

    NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞以每孔2000個接種至96孔板中,每組設(shè)置6個重復(fù)孔,細(xì)胞貼壁后分別加入不同劑量的奧沙利鉑(0、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)處理細(xì)胞48 h。每孔更換100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTS試劑,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,采用全波長掃描儀檢測細(xì)胞在490 nm處的OD值。細(xì)胞增殖率=miR-100-5p mimic組平均OD值/NC組平均OD值×100%。

    1.6Transwell實驗檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞胰酶消化后,無血清培養(yǎng)基洗3次,以每孔1×105個接種至24孔板Transwell小室膜中,24孔板Transwell下室中加入含有500 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基,每組設(shè)置3個重復(fù)孔,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h,細(xì)胞可穿過Transwell小室膜貼在膜下室面,終止細(xì)胞培養(yǎng)。膜下室面細(xì)胞經(jīng)PBS洗3次、甲醇固定及吉姆薩染色后在顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)目。

    1.7流式細(xì)胞凋亡實驗檢測細(xì)胞凋亡率 NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞經(jīng)無EDTA的胰酶消化后,PBS洗3次,以每管5×105個收集到流式細(xì)胞管中,按照凋亡染色試劑盒說明書,加入500 μl染色緩沖液、5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI細(xì)胞重懸混勻。常溫孵育10 min進行染色,流式細(xì)胞儀上機檢測細(xì)胞凋亡率。

    NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞經(jīng)奧沙利鉑不同濃度處理48 h后,經(jīng)無EDTA的胰酶消化后,PBS洗3次,以每管5×105個收集到流式細(xì)胞管中,按照凋亡染色試劑盒說明書,加入500 μl染色緩沖液、5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI細(xì)胞重懸混勻。常溫孵育10 min進行染色,流式細(xì)胞儀上機檢測細(xì)胞凋亡率。

    1.8Western blotting檢測ERK1/2和pERK1/2蛋白表達(dá) NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞收集后加入RIPA裂解液,于冰上裂解細(xì)胞30 min,14 000 r/min 4 ℃離心30 min后,獲得細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液混勻后煮沸變性。蛋白80 V凝膠電泳2 h、350 mA濕轉(zhuǎn)2 h、5%封閉液室溫封閉1 h,與ERK1/2和pERK1/2一抗(稀釋度均為1∶500)4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h,采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進行蛋白條帶曝光。

    2 結(jié)果

    2.1胃癌組織和癌旁組織中miR-100-5p表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,miR-100-5p在胃癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為1.05±0.36和1.69±0.72,miR-100-5p的相對表達(dá)量胃癌組織低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖1。

    圖1 qRT-PCR檢測胃癌組織和癌旁組織中miR-100-5p相對表達(dá)量

    2.2miR-100-5p表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系 miR-100-5p表達(dá)與胃癌患者性別、年齡、腫瘤直徑和分化程度無關(guān)(P>0.05);與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和化療效果相關(guān)(P<0.05或P<0.01),見表1。

    表1 miR-100-5p表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系

    2.3胃癌細(xì)胞系及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系中miR-100-5p表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,miR-100-5p在胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1中的相對表達(dá)量分別為1.31±0.14、1.34±0.15、0.39±0.07和2.94±0.29。miR-100-5p相對表達(dá)量胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);miR-100-5p相對表達(dá)量胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1和MKN45均低于人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

    圖2 qRT-PCR檢測胃癌細(xì)胞系及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系中miR-100-5p相對表達(dá)量

    2.4miR-100-5p mimic轉(zhuǎn)染效果 miR-100-5p mimic轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN45,qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞中miR-100-5p相對表達(dá)量分別為1.00±0.06和5.42±0.27。細(xì)胞中miR-100-5p相對表達(dá)量miR-100-5p mimic組高于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

    圖3 qRT-PCR檢測miR-100-5p mimic轉(zhuǎn)染效果

    2.5miR-100-5p對MKN45細(xì)胞增殖能力影響 MTS實驗檢測結(jié)果顯示,MKN45細(xì)胞增殖能力miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

    圖4 MTS實驗檢測miR-100-5p對MKN45細(xì)胞增殖能力影響

    2.6miR-100-5p對MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響 Transwell實驗檢測結(jié)果顯示,MKN45細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)NC組和miR-100-5p mimic組分別為(49.33±7.35)個和(21.67±5.84)個,MKN45細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)miR-100-5p mimic組少于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖5。

    圖5 Transwell實驗檢測miR-100-5p對MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響(吉姆薩染色×100)

    2.7miR-100-5p對MKN45細(xì)胞奧沙利鉑化療敏感性影響 NC組和miR-100-5p mimic組MKN45細(xì)胞經(jīng)不同濃度奧沙利鉑處理,培養(yǎng)48 h后MTS實驗檢測結(jié)果顯示在同一奧沙利鉑濃度處理下,細(xì)胞增殖率miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞凋亡實驗檢測結(jié)果顯示,NC組細(xì)胞凋亡率為(2.14±0.15)%,miR-100-5p mimic組細(xì)胞凋亡率為(7.06±0.27)%。MKN45細(xì)胞對奧沙利鉑化療敏感性miR-100-5p mimic組較NC組增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

    圖6 miR-100-5p對MKN45細(xì)胞奧沙利鉑化療敏感性影響

    2.8miR-100-5p對MKN45細(xì)胞ERK1/2信號通路影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示,NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞中ERK1/2蛋白比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);細(xì)胞中pERK1/2蛋白表達(dá)miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖7。

    圖7 miR-100-5p對MKN45細(xì)胞ERK1/2信號通路影響

    3 討論

    胃癌是一種侵襲性疾病,性質(zhì)具有多樣性[1]。在過去的幾十年中,胃癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率有所下降,但在我國人群中卻在上升,我國胃癌的發(fā)病率和病死率位居所有腫瘤第2位[9]。因此,尋求胃癌有效治療方法至關(guān)重要。手術(shù)切除是早期無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部區(qū)域轉(zhuǎn)移胃癌患者最有效治療方法。然而,對于晚期胃癌患者,即使完全切除腫瘤并進行輔助化療,但由于轉(zhuǎn)移和化療耐藥導(dǎo)致預(yù)后也很差[2]。目前,幽門螺桿菌感染、高鹽攝入和吸煙被認(rèn)為是胃癌發(fā)生和發(fā)展的主要危險因素[10],但是胃癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)分子機制現(xiàn)尚未完全明確。因此,闡明胃癌轉(zhuǎn)移和化療耐藥等腫瘤惡性進展的分子機制非常迫切。

    miRNA是一類長度為17~25 nt的非編碼RNA,可通過靶基因與3' -UTR互補結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA,參與各種生理和病理過程。高度保守的miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等腫瘤進程中發(fā)揮重要作用[4]。越來越多的研究表明,miRNA失調(diào)在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要意義[11]。miR-100-5p是miRNA家族的重要成員,位于11q24.1號染色體上,具有高度保守性。有研究報道m(xù)iR-100-5p高表達(dá)是口腔鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后不良的分子標(biāo)志物[12]。在腎細(xì)胞癌中miR-100-5p表達(dá)上調(diào),并促進腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[13]。然而,有學(xué)者報道m(xù)iR-100-5p在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)與患者預(yù)后較差有關(guān)[6]。上述研究表明miR-100-5p具有腫瘤異質(zhì)性,在不同腫瘤中具有不同功能。miR-100-5p在胃癌中的表達(dá)情況以往文獻(xiàn)未見報道,本文采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-100-5p相對表達(dá)量胃癌組織低于癌旁組織,胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45均低于人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1;并且miR-100-5p表達(dá)與胃癌細(xì)胞患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和化療效果相關(guān)。提示miR-100-5p表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示,MKN45細(xì)胞增殖能力及MKN45細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)miR-100-5p mimic組低于或少于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明miR-100-5p在胃癌中發(fā)揮抑癌作用。

    化療抵抗是腫瘤治療受阻的重要原因之一[3]。有研究報道m(xù)iR-100-5p在腫瘤細(xì)胞化療耐藥過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-100-5p在非小細(xì)胞肺癌中促進腫瘤耐藥細(xì)胞對克唑替尼和洛拉替尼耐藥,為耐藥性的治療靶標(biāo)[14]。然而,另一項研究表明,miR-100-5p可促進肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[7]。奧沙利鉑是鉑類化合物中的一種,比順鉑具有更顯著的抗腫瘤作用,被廣泛應(yīng)用于胃腸道腫瘤的治療,但對其耐藥性極大影響了患者預(yù)后[15]。本文對miR-100-5p是否在胃癌細(xì)胞對奧沙利鉑耐藥過程發(fā)揮重要作用進行了研究,結(jié)果顯示MKN45細(xì)胞對奧沙利鉑化療敏感性miR-100-5p mimic組較NC組增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明過表達(dá)miR-100-5p的胃癌細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性增加。本研究發(fā)現(xiàn)miR-100-5p抑制胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥,但是其具體作用機制仍需進一步探討。ERK1/2信號通路對包括胃癌在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥生物過程具有重要調(diào)控作用,pERK1/2促進腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥[16]。本研究Western blotting檢測結(jié)果顯示,NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞中ERK1/2蛋白比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;細(xì)胞中pERK1/2蛋白表達(dá)miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明miR-100-5p可能通過下調(diào)ERK1/2信號通路抑制胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和對奧沙利鉑耐藥。

    綜上所述,miR-100-5p在胃癌細(xì)胞中低表達(dá),并與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及化療效果相關(guān)。miR-100-5p可能通過調(diào)控ERK1/2信號通路抑制胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和對奧沙利鉑化療耐藥,是治療胃癌的潛在靶標(biāo)。

    猜你喜歡
    奧沙利細(xì)胞系試劑盒
    吳茱萸堿逆轉(zhuǎn)人胃癌BGC-823/L-OHP細(xì)胞對奧沙利鉑耐藥
    耐奧沙利鉑人胃癌SGC-7901細(xì)胞具有高侵襲轉(zhuǎn)移性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征
    雷替曲塞聯(lián)合奧沙利鉑治療晚期結(jié)直腸癌患者的療效觀察
    STAT3對人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系增殖與凋亡的影響
    GlobalFiler~? PCR擴增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗證
    抑制miR-31表達(dá)對胰腺癌Panc-1細(xì)胞系遷移和侵襲的影響及可能機制
    E3泛素連接酶對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
    七葉皂苷鈉與化療藥聯(lián)合對HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞系的作用
    久久久久久久久久久久大奶| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 久久久久国产一级毛片高清牌| 在线观看免费高清a一片| 97精品久久久久久久久久精品| 国产在线观看jvid| 俄罗斯特黄特色一大片| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 午夜福利影视在线免费观看| av线在线观看网站| 91成年电影在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 久久久久精品国产欧美久久久 | 精品亚洲成a人片在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 免费人妻精品一区二区三区视频| 淫妇啪啪啪对白视频 | 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 在线观看免费午夜福利视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 99国产精品免费福利视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美另类亚洲清纯唯美| 老司机在亚洲福利影院| 国产免费av片在线观看野外av| 国产成人精品久久二区二区91| 亚洲精品乱久久久久久| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产在线一区二区三区精| 岛国毛片在线播放| 国产麻豆69| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 动漫黄色视频在线观看| 国产在线视频一区二区| 一进一出抽搐动态| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 电影成人av| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产免费视频播放在线视频| 97在线人人人人妻| 国产伦人伦偷精品视频| www.精华液| 精品福利观看| 黄片小视频在线播放| 这个男人来自地球电影免费观看| 黄色a级毛片大全视频| 日韩一区二区三区影片| 国产伦理片在线播放av一区| tocl精华| 丝袜美足系列| 一个人免费看片子| 亚洲欧美精品自产自拍| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 色综合欧美亚洲国产小说| svipshipincom国产片| 国产人伦9x9x在线观看| 欧美成人午夜精品| 久久久水蜜桃国产精品网| 制服诱惑二区| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品久久久久久精品古装| 人妻一区二区av| 超色免费av| 国产精品一区二区在线不卡| 悠悠久久av| 成年人免费黄色播放视频| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| netflix在线观看网站| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 男女免费视频国产| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 少妇 在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 久9热在线精品视频| 久久热在线av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产精品九九99| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 精品高清国产在线一区| 亚洲精品在线美女| 精品国产一区二区三区四区第35| 免费少妇av软件| 亚洲少妇的诱惑av| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 一区二区av电影网| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲精品中文字幕在线视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 国产精品欧美亚洲77777| 少妇 在线观看| 午夜福利,免费看| 久久久国产成人免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 亚洲 国产 在线| 90打野战视频偷拍视频| 国产成人啪精品午夜网站| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产一区二区三区综合在线观看| 日韩有码中文字幕| av电影中文网址| 国产真人三级小视频在线观看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 久久性视频一级片| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产野战对白在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品国产乱子伦一区二区三区 | 国产男人的电影天堂91| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 90打野战视频偷拍视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 97精品久久久久久久久久精品| 亚洲国产精品999| 日本av免费视频播放| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 99久久人妻综合| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 成人三级做爰电影| 欧美 日韩 精品 国产| 久久国产精品大桥未久av| 精品久久蜜臀av无| 欧美日韩黄片免| av有码第一页| 亚洲欧洲日产国产| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 亚洲三区欧美一区| 天天添夜夜摸| 国产高清国产精品国产三级| 嫩草影视91久久| 精品免费久久久久久久清纯 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| a 毛片基地| 免费在线观看完整版高清| 99热国产这里只有精品6| 国产在视频线精品| 美女中出高潮动态图| 国产黄色免费在线视频| 久久精品国产综合久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 色精品久久人妻99蜜桃| 99国产精品99久久久久| 欧美黑人精品巨大| 在线观看免费午夜福利视频| 午夜福利影视在线免费观看| 亚洲,欧美精品.| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 一区福利在线观看| 中文欧美无线码| 久久 成人 亚洲| 丝袜喷水一区| 中文欧美无线码| 精品国产国语对白av| 青春草视频在线免费观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品高清国产在线一区| 欧美午夜高清在线| 国产成人免费观看mmmm| 一区二区三区激情视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久国产精品人妻蜜桃| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲成人手机| 亚洲精品一二三| 国产国语露脸激情在线看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 丝袜美腿诱惑在线| 我的亚洲天堂| 丝袜喷水一区| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品久久久久久精品电影小说| 午夜福利,免费看| 老司机午夜十八禁免费视频| 午夜两性在线视频| 一个人免费在线观看的高清视频 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 久久久久国内视频| 亚洲av片天天在线观看| 久久毛片免费看一区二区三区| 最黄视频免费看| av不卡在线播放| 亚洲av美国av| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品中文字幕在线视频| av网站免费在线观看视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 两性夫妻黄色片| 一本久久精品| 欧美午夜高清在线| 中文字幕色久视频| 国产高清视频在线播放一区 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产三级黄色录像| 美女扒开内裤让男人捅视频| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 一区二区三区精品91| 黑人操中国人逼视频| 国产av一区二区精品久久| 99精品久久久久人妻精品| 99国产精品一区二区三区| 午夜福利,免费看| 首页视频小说图片口味搜索| 久久久久久久国产电影| 久久久久久久久久久久大奶| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲第一青青草原| 午夜久久久在线观看| 超碰97精品在线观看| 老司机影院毛片| av一本久久久久| 丰满饥渴人妻一区二区三| 十八禁网站免费在线| 免费人妻精品一区二区三区视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 新久久久久国产一级毛片| 人成视频在线观看免费观看| 免费av中文字幕在线| 999精品在线视频| 国产精品一区二区在线观看99| 国产精品久久久久成人av| 又紧又爽又黄一区二区| 国产免费现黄频在线看| 青青草视频在线视频观看| 国产成人系列免费观看| 99久久国产精品久久久| 999久久久精品免费观看国产| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 黄片播放在线免费| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| bbb黄色大片| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 视频区欧美日本亚洲| 多毛熟女@视频| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 日韩高清综合在线| 香蕉久久夜色| 久久香蕉国产精品| 淫妇啪啪啪对白视频| 午夜福利欧美成人| 午夜老司机福利片| 午夜视频精品福利| 给我免费播放毛片高清在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 天天添夜夜摸| 99国产精品99久久久久| 男女床上黄色一级片免费看| 成人18禁在线播放| 美女午夜性视频免费| 可以在线观看的亚洲视频| 麻豆成人av在线观看| 叶爱在线成人免费视频播放| 脱女人内裤的视频| 免费电影在线观看免费观看| www.精华液| 日韩欧美国产一区二区入口| 欧美日韩一级在线毛片| 在线观看www视频免费| 亚洲av熟女| 亚洲中文日韩欧美视频| 久久中文看片网| 成年女人毛片免费观看观看9| 一区二区三区高清视频在线| 高清毛片免费观看视频网站| 午夜激情av网站| 丝袜美腿诱惑在线| 9191精品国产免费久久| 国产午夜精品久久久久久| 免费看日本二区| 好男人电影高清在线观看| 男人的好看免费观看在线视频 | 大型av网站在线播放| 久久久久久久久中文| 五月玫瑰六月丁香| 最近最新中文字幕大全电影3| 美女午夜性视频免费| 免费在线观看成人毛片| 97碰自拍视频| 可以在线观看的亚洲视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| av视频在线观看入口| netflix在线观看网站| 老汉色av国产亚洲站长工具| 成人18禁在线播放| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国产69精品久久久久777片 | 久久中文字幕人妻熟女| 免费一级毛片在线播放高清视频| 九色成人免费人妻av| www.熟女人妻精品国产| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 成年免费大片在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 99精品欧美一区二区三区四区| 1024手机看黄色片| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲一区中文字幕在线| 美女大奶头视频| 床上黄色一级片| 久99久视频精品免费| 欧美日本视频| 男人舔女人下体高潮全视频| 亚洲精华国产精华精| 91大片在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 天堂√8在线中文| 男人的好看免费观看在线视频 | 午夜免费观看网址| 久久性视频一级片| 窝窝影院91人妻| 欧美+亚洲+日韩+国产| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久草成人影院| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久久久久久久久黄片| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 欧美乱码精品一区二区三区| 叶爱在线成人免费视频播放| 一本综合久久免费| 日本免费a在线| 亚洲午夜理论影院| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲av成人av| 免费在线观看日本一区| 国产午夜精品久久久久久| 久久久精品大字幕| АⅤ资源中文在线天堂| 久久午夜综合久久蜜桃| 黄片小视频在线播放| 精品久久久久久久久久久久久| 欧美黑人精品巨大| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 亚洲真实伦在线观看| bbb黄色大片| 久久久久久九九精品二区国产 | 美女大奶头视频| 国产69精品久久久久777片 | 日韩av在线大香蕉| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 一个人免费在线观看电影 | 国产成人系列免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲成人精品中文字幕电影| 精品欧美一区二区三区在线| avwww免费| 久久草成人影院| 亚洲国产精品999在线| 国产亚洲欧美98| 男女午夜视频在线观看| 国产97色在线日韩免费| 美女大奶头视频| 成年女人毛片免费观看观看9| 久久国产乱子伦精品免费另类| 桃色一区二区三区在线观看| 欧美av亚洲av综合av国产av| 老司机福利观看| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 成人三级做爰电影| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产高清videossex| 亚洲国产精品999在线| 成人av在线播放网站| 欧美精品亚洲一区二区| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 性欧美人与动物交配| 免费无遮挡裸体视频| 亚洲av电影在线进入| 99热这里只有精品一区 | 国产精品野战在线观看| ponron亚洲| 亚洲av第一区精品v没综合| 91大片在线观看| 国产99白浆流出| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 国产精品,欧美在线| 午夜老司机福利片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 床上黄色一级片| 久久草成人影院| 熟女电影av网| 亚洲精品美女久久av网站| 老司机福利观看| 妹子高潮喷水视频| av视频在线观看入口| 黑人操中国人逼视频| 久久中文字幕人妻熟女| 欧美激情久久久久久爽电影| 国模一区二区三区四区视频 | 国产精品一区二区三区四区久久| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 国产精品av久久久久免费| 无限看片的www在线观看| а√天堂www在线а√下载| 欧美性长视频在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 亚洲成人免费电影在线观看| 在线观看日韩欧美| 男女午夜视频在线观看| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 亚洲天堂国产精品一区在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 一级毛片精品| 叶爱在线成人免费视频播放| 手机成人av网站| 1024视频免费在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲成人久久爱视频| av天堂在线播放| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产高清视频在线观看网站| 波多野结衣巨乳人妻| 亚洲人成77777在线视频| 国产精品亚洲美女久久久| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 久久久久九九精品影院| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 性欧美人与动物交配| 一区福利在线观看| 淫妇啪啪啪对白视频| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产成+人综合+亚洲专区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品久久久久久久电影 | www.www免费av| 后天国语完整版免费观看| 999精品在线视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日本五十路高清| 精品欧美一区二区三区在线| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲人成网站高清观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 国产午夜精品论理片| 免费人成视频x8x8入口观看| 999久久久精品免费观看国产| bbb黄色大片| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | av免费在线观看网站| 啪啪无遮挡十八禁网站| 又黄又爽又免费观看的视频| 91成年电影在线观看| netflix在线观看网站| 国产精品一区二区三区四区久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲精品色激情综合| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 午夜成年电影在线免费观看| 久久久久亚洲av毛片大全| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| av天堂在线播放| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 免费看a级黄色片| www国产在线视频色| 精品久久久久久,| 午夜免费成人在线视频| 午夜福利在线观看吧| 老司机深夜福利视频在线观看| 黄色视频不卡| 久久久久久久久免费视频了| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美日本亚洲视频在线播放| 精品熟女少妇八av免费久了| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 成人18禁在线播放| 999精品在线视频| 99国产精品一区二区蜜桃av| 一本大道久久a久久精品| 国产精品精品国产色婷婷| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 亚洲人成网站高清观看| 精品乱码久久久久久99久播| 国产精品永久免费网站| 国产主播在线观看一区二区| 成人亚洲精品av一区二区| 精华霜和精华液先用哪个| 成年免费大片在线观看| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 大型黄色视频在线免费观看| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲精品在线美女| 91国产中文字幕| 一区二区三区激情视频| 嫁个100分男人电影在线观看| 欧美成人午夜精品| 午夜免费激情av| av福利片在线观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲美女黄片视频| 制服人妻中文乱码| 国产精品日韩av在线免费观看| 一本大道久久a久久精品| 久久久久九九精品影院| 亚洲乱码一区二区免费版| 一本精品99久久精品77| 极品教师在线免费播放| 亚洲熟女毛片儿| 99精品久久久久人妻精品| 99re在线观看精品视频| 国产精品电影一区二区三区| cao死你这个sao货| 18禁观看日本| 欧美中文综合在线视频| 麻豆国产97在线/欧美 | a级毛片a级免费在线| 欧美精品亚洲一区二区| 美女 人体艺术 gogo| 婷婷六月久久综合丁香| 日韩欧美在线乱码| 又大又爽又粗| 国产男靠女视频免费网站| 中文字幕最新亚洲高清| 久久中文字幕一级| 久久久久久免费高清国产稀缺| 女人被狂操c到高潮| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 两性夫妻黄色片| 搡老岳熟女国产| 淫妇啪啪啪对白视频| 搡老妇女老女人老熟妇| 身体一侧抽搐| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲18禁久久av| 亚洲欧美日韩东京热| 久久香蕉激情| 欧美黑人精品巨大| 亚洲av片天天在线观看| 午夜免费激情av| 日韩成人在线观看一区二区三区| xxx96com| 两个人视频免费观看高清| 老汉色∧v一级毛片| 午夜福利成人在线免费观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产日本99.免费观看| 亚洲,欧美精品.| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产欧美日韩一区二区精品| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 一级毛片精品| 国产精品久久视频播放| av天堂在线播放| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 又粗又爽又猛毛片免费看| 天堂影院成人在线观看| 黄频高清免费视频| 12—13女人毛片做爰片一| 国产成人啪精品午夜网站| or卡值多少钱| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 在线看三级毛片| 欧美黑人欧美精品刺激| 岛国在线观看网站| 99久久国产精品久久久| 久久中文看片网| 亚洲欧美日韩东京热| 一进一出抽搐动态| 国产91精品成人一区二区三区| 搞女人的毛片| 亚洲成人久久爱视频| 欧美午夜高清在线| 超碰成人久久| 久久久国产成人免费| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产熟女xx| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 亚洲av成人一区二区三| 黄片大片在线免费观看| 亚洲国产看品久久| 一级毛片高清免费大全| 男插女下体视频免费在线播放| 精华霜和精华液先用哪个| 成人精品一区二区免费| 日本一二三区视频观看| av在线播放免费不卡| 亚洲中文日韩欧美视频| 青草久久国产| 日本 av在线| 一本综合久久免费| 精品熟女少妇八av免费久了| 香蕉av资源在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 黄片小视频在线播放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产日本99.免费观看| АⅤ资源中文在线天堂| 日本成人三级电影网站| 中出人妻视频一区二区| 色综合站精品国产| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美中文综合在线视频|