• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    miR-100-5p對胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的作用及機制研究

    2021-09-27 02:26:30李紹軍胥錢平杜麗英
    臨床誤診誤治 2021年9期
    關(guān)鍵詞:奧沙利細(xì)胞系試劑盒

    雷 益,李紹軍,胥錢平,馮 成,杜麗英

    胃癌是常見惡性腫瘤,為與腫瘤相關(guān)死亡的第三大原因,2018年估計有783 000例胃癌患者死亡[1]?;?、放療和胃切除術(shù)是治療胃癌的主要方法,盡管近年這些治療方法的實施取得了長足進步,但胃癌晚期患者總體5年生存率仍不到30%[2]。目前,晚期轉(zhuǎn)移和化療耐藥仍是胃癌患者治療的主要障礙[3]。因此,胃癌分子機制研究是探討胃癌新治療策略的重要途徑。miRNA是非編碼RNA之一,雖然不具備編碼功能,但是其在腫瘤等疾病中的作用逐漸被挖掘[4]。miR-100-5p是與腫瘤密切相關(guān)的miRNA之一,可發(fā)揮抑癌作用和促癌作用。有研究顯示,miR-100-5p在前列腺癌、肝細(xì)胞肝癌和非小細(xì)胞肺癌等腫瘤中表達(dá)異常,不僅與腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),還可調(diào)控腫瘤細(xì)胞耐藥[5-7]。Chen等[8]報道m(xù)iR-100-5p通過抑制mTOR信號通路參與長鏈非編碼RNA HAGLROS促進胃癌惡性進展,但是miR-100-5p在胃癌中的表達(dá)及發(fā)揮的具體生物學(xué)功能現(xiàn)仍未知。因此,本研究探討miR-100-5p對胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥的作用及機制,旨在獲得miR-100-5p抗胃癌治療的潛在分子靶點。

    1 材料與方法

    1.1一般資料 選取2017年1月—2019年6月于四川大學(xué)華西醫(yī)院眉山醫(yī)院行根治性手術(shù)的胃癌患者標(biāo)本,收集經(jīng)病理檢查證實的胃癌組織和癌旁組織(距離腫瘤5 cm的非胃癌組織),患者術(shù)前未接受過任何形式治療并簽署相關(guān)知情同意書,共納入70例。70例中男37例,女33例;年齡≤60歲28例,>60歲42例;腫瘤直徑:<5 cm 50例,≥5 cm 20例;分化程度:高分化12例,中分化15例,低分化43例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移:有39例,無31例;Duke分期:Ⅰ期18例,Ⅱ期20例,Ⅲ期24例,Ⅳ期8例?;颊咝g(shù)后進行以鉑類為主的一線化療,化療方案為奧沙利鉑第1天和第7天100 mg/m2靜脈滴注2 h,7 d為1個療程,共化療5個療程。隨訪追蹤患者治療后效果,主要包括復(fù)發(fā)和疾病進展,70例中化療有效37例,無效33例。

    1.2試劑和材料 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司,RNA提取試劑盒和qRT-PCR試劑盒購自北京百奧萊博科技有限公司,miR-100-5p和內(nèi)參U6引物由上海生工試劑公司合成,胰蛋白酶、細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Hyclone公司,胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫,miR-100-5p mimic購自廣州瑞博生物試劑有限公司,MTS試劑和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物試劑有限公司,Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)有限公司,RIPA裂解液購自上海貝博生物科技公司,PVDF膜購自美國Bio-Rad,ERK1/2、pERK1/2和GAPDH抗體購自美國Cell Signaling公司,ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上?;鄯f生物科技有限公司。

    1.3qRT-PCR 在胃癌組織和癌旁組織中加入Trizol裂解液于研缽中研磨裂解,采用RNA提取試劑盒提取組織中總的RNA。采用UltraRT One-step RT-PCR試劑盒進行RNA逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR,其體系為10X One Step RT-PCR Buffer 1 μl、上下游引物各0.4 μl、RNA 0.2 μg、RNase mimic 0.1 μl、AMV RT 0.1 μl、Taq DNA polymerase和無RNA酶的雙蒸水補足10 μl。反應(yīng)條件為逆轉(zhuǎn)錄45 ℃20 min、94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s 30個循環(huán),72 ℃終延伸10 min。miR-100-5p引物F:5'-GAACCCGTAGATCCGAACT-3',R:5'-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3';U6引物F:5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3',R:5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。按照2-ΔΔCt公式以U6為內(nèi)參計算miR-100-5p的相對表達(dá)量。

    1.4細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 采用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1,并放置在37 ℃含有5%CO2的全濕度培養(yǎng)箱中。采用胰酶消化進行細(xì)胞傳代。細(xì)胞長滿時收集細(xì)胞,提取細(xì)胞總RNA。采用qRT-PCR檢測各細(xì)胞中miR-100-5p的表達(dá)。選取miR-100-5p表達(dá)最低的細(xì)胞系進行細(xì)胞接種,以每孔2×105個細(xì)胞接種至6孔板中,分為NC組和miR-100-5p mimic組,細(xì)胞貼壁12 h后進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染,NC組轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體2000與對照mimic混合液,miR-100-5p mimic組轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體2000與miR-100-5p mimic混合液,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)48 h后采用qRT-PCR檢測細(xì)胞中miR-100-5p的表達(dá)。

    1.5MTS實驗檢測細(xì)胞增殖能力 NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞以每孔2000個接種至96孔板中,每組設(shè)置6個重復(fù)孔,分別在貼壁0、24、48和72 h時,每孔更換100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTS試劑,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,采用全波長掃描儀檢測細(xì)胞在490 nm處的OD值。

    NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞以每孔2000個接種至96孔板中,每組設(shè)置6個重復(fù)孔,細(xì)胞貼壁后分別加入不同劑量的奧沙利鉑(0、5、10、20、40、80、160和320 μmol/L)處理細(xì)胞48 h。每孔更換100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTS試劑,繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,采用全波長掃描儀檢測細(xì)胞在490 nm處的OD值。細(xì)胞增殖率=miR-100-5p mimic組平均OD值/NC組平均OD值×100%。

    1.6Transwell實驗檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力 NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞胰酶消化后,無血清培養(yǎng)基洗3次,以每孔1×105個接種至24孔板Transwell小室膜中,24孔板Transwell下室中加入含有500 μl 10%胎牛血清的培養(yǎng)基,每組設(shè)置3個重復(fù)孔,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 h,細(xì)胞可穿過Transwell小室膜貼在膜下室面,終止細(xì)胞培養(yǎng)。膜下室面細(xì)胞經(jīng)PBS洗3次、甲醇固定及吉姆薩染色后在顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞穿膜數(shù)目。

    1.7流式細(xì)胞凋亡實驗檢測細(xì)胞凋亡率 NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞經(jīng)無EDTA的胰酶消化后,PBS洗3次,以每管5×105個收集到流式細(xì)胞管中,按照凋亡染色試劑盒說明書,加入500 μl染色緩沖液、5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI細(xì)胞重懸混勻。常溫孵育10 min進行染色,流式細(xì)胞儀上機檢測細(xì)胞凋亡率。

    NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞經(jīng)奧沙利鉑不同濃度處理48 h后,經(jīng)無EDTA的胰酶消化后,PBS洗3次,以每管5×105個收集到流式細(xì)胞管中,按照凋亡染色試劑盒說明書,加入500 μl染色緩沖液、5 μl Annexin V-FITC 和5 μl PI細(xì)胞重懸混勻。常溫孵育10 min進行染色,流式細(xì)胞儀上機檢測細(xì)胞凋亡率。

    1.8Western blotting檢測ERK1/2和pERK1/2蛋白表達(dá) NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞收集后加入RIPA裂解液,于冰上裂解細(xì)胞30 min,14 000 r/min 4 ℃離心30 min后,獲得細(xì)胞總蛋白。采用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測蛋白濃度,加入蛋白上樣緩沖液混勻后煮沸變性。蛋白80 V凝膠電泳2 h、350 mA濕轉(zhuǎn)2 h、5%封閉液室溫封閉1 h,與ERK1/2和pERK1/2一抗(稀釋度均為1∶500)4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h,采用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進行蛋白條帶曝光。

    2 結(jié)果

    2.1胃癌組織和癌旁組織中miR-100-5p表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,miR-100-5p在胃癌組織和癌旁組織中的相對表達(dá)量分別為1.05±0.36和1.69±0.72,miR-100-5p的相對表達(dá)量胃癌組織低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖1。

    圖1 qRT-PCR檢測胃癌組織和癌旁組織中miR-100-5p相對表達(dá)量

    2.2miR-100-5p表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系 miR-100-5p表達(dá)與胃癌患者性別、年齡、腫瘤直徑和分化程度無關(guān)(P>0.05);與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和化療效果相關(guān)(P<0.05或P<0.01),見表1。

    表1 miR-100-5p表達(dá)與胃癌患者臨床病理參數(shù)關(guān)系

    2.3胃癌細(xì)胞系及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系中miR-100-5p表達(dá) qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,miR-100-5p在胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1中的相對表達(dá)量分別為1.31±0.14、1.34±0.15、0.39±0.07和2.94±0.29。miR-100-5p相對表達(dá)量胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);miR-100-5p相對表達(dá)量胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1和MKN45均低于人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

    圖2 qRT-PCR檢測胃癌細(xì)胞系及人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系中miR-100-5p相對表達(dá)量

    2.4miR-100-5p mimic轉(zhuǎn)染效果 miR-100-5p mimic轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞MKN45,qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞中miR-100-5p相對表達(dá)量分別為1.00±0.06和5.42±0.27。細(xì)胞中miR-100-5p相對表達(dá)量miR-100-5p mimic組高于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

    圖3 qRT-PCR檢測miR-100-5p mimic轉(zhuǎn)染效果

    2.5miR-100-5p對MKN45細(xì)胞增殖能力影響 MTS實驗檢測結(jié)果顯示,MKN45細(xì)胞增殖能力miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖4。

    圖4 MTS實驗檢測miR-100-5p對MKN45細(xì)胞增殖能力影響

    2.6miR-100-5p對MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響 Transwell實驗檢測結(jié)果顯示,MKN45細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)NC組和miR-100-5p mimic組分別為(49.33±7.35)個和(21.67±5.84)個,MKN45細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)miR-100-5p mimic組少于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),見圖5。

    圖5 Transwell實驗檢測miR-100-5p對MKN45細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力影響(吉姆薩染色×100)

    2.7miR-100-5p對MKN45細(xì)胞奧沙利鉑化療敏感性影響 NC組和miR-100-5p mimic組MKN45細(xì)胞經(jīng)不同濃度奧沙利鉑處理,培養(yǎng)48 h后MTS實驗檢測結(jié)果顯示在同一奧沙利鉑濃度處理下,細(xì)胞增殖率miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。流式細(xì)胞凋亡實驗檢測結(jié)果顯示,NC組細(xì)胞凋亡率為(2.14±0.15)%,miR-100-5p mimic組細(xì)胞凋亡率為(7.06±0.27)%。MKN45細(xì)胞對奧沙利鉑化療敏感性miR-100-5p mimic組較NC組增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖6。

    圖6 miR-100-5p對MKN45細(xì)胞奧沙利鉑化療敏感性影響

    2.8miR-100-5p對MKN45細(xì)胞ERK1/2信號通路影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示,NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞中ERK1/2蛋白比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);細(xì)胞中pERK1/2蛋白表達(dá)miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖7。

    圖7 miR-100-5p對MKN45細(xì)胞ERK1/2信號通路影響

    3 討論

    胃癌是一種侵襲性疾病,性質(zhì)具有多樣性[1]。在過去的幾十年中,胃癌在全球范圍內(nèi)發(fā)病率有所下降,但在我國人群中卻在上升,我國胃癌的發(fā)病率和病死率位居所有腫瘤第2位[9]。因此,尋求胃癌有效治療方法至關(guān)重要。手術(shù)切除是早期無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或局部區(qū)域轉(zhuǎn)移胃癌患者最有效治療方法。然而,對于晚期胃癌患者,即使完全切除腫瘤并進行輔助化療,但由于轉(zhuǎn)移和化療耐藥導(dǎo)致預(yù)后也很差[2]。目前,幽門螺桿菌感染、高鹽攝入和吸煙被認(rèn)為是胃癌發(fā)生和發(fā)展的主要危險因素[10],但是胃癌的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)分子機制現(xiàn)尚未完全明確。因此,闡明胃癌轉(zhuǎn)移和化療耐藥等腫瘤惡性進展的分子機制非常迫切。

    miRNA是一類長度為17~25 nt的非編碼RNA,可通過靶基因與3' -UTR互補結(jié)合在轉(zhuǎn)錄后水平抑制mRNA,參與各種生理和病理過程。高度保守的miRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲和凋亡等腫瘤進程中發(fā)揮重要作用[4]。越來越多的研究表明,miRNA失調(diào)在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中具有重要意義[11]。miR-100-5p是miRNA家族的重要成員,位于11q24.1號染色體上,具有高度保守性。有研究報道m(xù)iR-100-5p高表達(dá)是口腔鱗狀細(xì)胞癌預(yù)后不良的分子標(biāo)志物[12]。在腎細(xì)胞癌中miR-100-5p表達(dá)上調(diào),并促進腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡[13]。然而,有學(xué)者報道m(xù)iR-100-5p在肝細(xì)胞癌中表達(dá)下調(diào)與患者預(yù)后較差有關(guān)[6]。上述研究表明miR-100-5p具有腫瘤異質(zhì)性,在不同腫瘤中具有不同功能。miR-100-5p在胃癌中的表達(dá)情況以往文獻(xiàn)未見報道,本文采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-100-5p相對表達(dá)量胃癌組織低于癌旁組織,胃癌細(xì)胞系GES-1、MKN1、MKN45均低于人正常胃黏膜上皮細(xì)胞系RGM-1;并且miR-100-5p表達(dá)與胃癌細(xì)胞患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和化療效果相關(guān)。提示miR-100-5p表達(dá)與胃癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果還顯示,MKN45細(xì)胞增殖能力及MKN45細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)miR-100-5p mimic組低于或少于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明miR-100-5p在胃癌中發(fā)揮抑癌作用。

    化療抵抗是腫瘤治療受阻的重要原因之一[3]。有研究報道m(xù)iR-100-5p在腫瘤細(xì)胞化療耐藥過程發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-100-5p在非小細(xì)胞肺癌中促進腫瘤耐藥細(xì)胞對克唑替尼和洛拉替尼耐藥,為耐藥性的治療靶標(biāo)[14]。然而,另一項研究表明,miR-100-5p可促進肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性[7]。奧沙利鉑是鉑類化合物中的一種,比順鉑具有更顯著的抗腫瘤作用,被廣泛應(yīng)用于胃腸道腫瘤的治療,但對其耐藥性極大影響了患者預(yù)后[15]。本文對miR-100-5p是否在胃癌細(xì)胞對奧沙利鉑耐藥過程發(fā)揮重要作用進行了研究,結(jié)果顯示MKN45細(xì)胞對奧沙利鉑化療敏感性miR-100-5p mimic組較NC組增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。說明過表達(dá)miR-100-5p的胃癌細(xì)胞對奧沙利鉑的敏感性增加。本研究發(fā)現(xiàn)miR-100-5p抑制胃癌細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥,但是其具體作用機制仍需進一步探討。ERK1/2信號通路對包括胃癌在內(nèi)的腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥生物過程具有重要調(diào)控作用,pERK1/2促進腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和化療耐藥[16]。本研究Western blotting檢測結(jié)果顯示,NC組和miR-100-5p mimic組細(xì)胞中ERK1/2蛋白比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;細(xì)胞中pERK1/2蛋白表達(dá)miR-100-5p mimic組低于NC組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。表明miR-100-5p可能通過下調(diào)ERK1/2信號通路抑制胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和對奧沙利鉑耐藥。

    綜上所述,miR-100-5p在胃癌細(xì)胞中低表達(dá),并與胃癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及化療效果相關(guān)。miR-100-5p可能通過調(diào)控ERK1/2信號通路抑制胃癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和對奧沙利鉑化療耐藥,是治療胃癌的潛在靶標(biāo)。

    猜你喜歡
    奧沙利細(xì)胞系試劑盒
    吳茱萸堿逆轉(zhuǎn)人胃癌BGC-823/L-OHP細(xì)胞對奧沙利鉑耐藥
    耐奧沙利鉑人胃癌SGC-7901細(xì)胞具有高侵襲轉(zhuǎn)移性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化特征
    雷替曲塞聯(lián)合奧沙利鉑治療晚期結(jié)直腸癌患者的療效觀察
    STAT3對人肝內(nèi)膽管癌細(xì)胞系增殖與凋亡的影響
    GlobalFiler~? PCR擴增試劑盒驗證及其STR遺傳多態(tài)性
    GoldeneyeTM DNA身份鑒定系統(tǒng)25A試劑盒的法醫(yī)學(xué)驗證
    抑制miR-31表達(dá)對胰腺癌Panc-1細(xì)胞系遷移和侵襲的影響及可能機制
    E3泛素連接酶對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3/DDP順鉑耐藥性的影響
    牛結(jié)核病PCR診斷試劑盒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究
    七葉皂苷鈉與化療藥聯(lián)合對HT-29 結(jié)腸癌細(xì)胞系的作用
    久久国产精品影院| 黄色丝袜av网址大全| 长腿黑丝高跟| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久中文看片网| 欧美三级亚洲精品| 啦啦啦韩国在线观看视频| 美女 人体艺术 gogo| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 一级毛片高清免费大全| 女人被狂操c到高潮| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 999久久久精品免费观看国产| 成人欧美大片| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲五月婷婷丁香| 国产三级黄色录像| 在线观看一区二区三区| 日本成人三级电影网站| 午夜福利成人在线免费观看| 俺也久久电影网| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产一级毛片七仙女欲春2 | 成人三级黄色视频| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜免费鲁丝| 国产精华一区二区三区| 亚洲激情在线av| 不卡av一区二区三区| 久久九九热精品免费| 香蕉av资源在线| 久久久久久免费高清国产稀缺| 免费在线观看黄色视频的| 自线自在国产av| 看片在线看免费视频| 99热6这里只有精品| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 国产亚洲精品第一综合不卡| av电影中文网址| 国产片内射在线| 麻豆一二三区av精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产在线精品亚洲第一网站| 免费观看人在逋| 精品国产乱码久久久久久男人| 人成视频在线观看免费观看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 夜夜爽天天搞| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 脱女人内裤的视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 国产精品亚洲一级av第二区| 老汉色∧v一级毛片| 黄色丝袜av网址大全| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成人一区二区视频在线观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 大型av网站在线播放| 久久亚洲精品不卡| 日本免费一区二区三区高清不卡| 校园春色视频在线观看| 国产精品二区激情视频| 香蕉久久夜色| 欧美日韩一级在线毛片| 国产在线观看jvid| 亚洲美女黄片视频| 身体一侧抽搐| 国产亚洲精品一区二区www| 成人午夜高清在线视频 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 又黄又粗又硬又大视频| 色av中文字幕| 国产又黄又爽又无遮挡在线| av电影中文网址| 黄片播放在线免费| 久久午夜综合久久蜜桃| 一级毛片精品| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 色婷婷久久久亚洲欧美| 欧美性长视频在线观看| 国产乱人伦免费视频| 97碰自拍视频| 国产精品久久久av美女十八| 欧美在线黄色| 一本久久中文字幕| 在线免费观看的www视频| 日韩免费av在线播放| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久人妻av系列| 黄片小视频在线播放| 观看免费一级毛片| 国产一区二区在线av高清观看| 黄色 视频免费看| 亚洲精品国产区一区二| 久久香蕉精品热| 91国产中文字幕| 十八禁网站免费在线| 99精品欧美一区二区三区四区| av在线播放免费不卡| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 中文在线观看免费www的网站 | 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲专区中文字幕在线| 黄色成人免费大全| 美女国产高潮福利片在线看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 欧美国产日韩亚洲一区| xxxwww97欧美| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 国产黄色小视频在线观看| 亚洲精品色激情综合| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 成人亚洲精品一区在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 久久久久久人人人人人| 精品卡一卡二卡四卡免费| 免费一级毛片在线播放高清视频| 成人三级做爰电影| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲成人国产一区在线观看| 久久久久久大精品| 亚洲七黄色美女视频| 国产精品日韩av在线免费观看| 一二三四社区在线视频社区8| 淫秽高清视频在线观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 免费高清在线观看日韩| 日韩欧美一区视频在线观看| 久久国产乱子伦精品免费另类| 草草在线视频免费看| 在线视频色国产色| 妹子高潮喷水视频| av天堂在线播放| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 亚洲欧美日韩无卡精品| 国产精品野战在线观看| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产99久久九九免费精品| 午夜福利视频1000在线观看| 国产av又大| 欧美性猛交黑人性爽| 国产亚洲欧美在线一区二区| 国产亚洲精品第一综合不卡| 国产三级在线视频| 精品不卡国产一区二区三区| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 麻豆一二三区av精品| 久久热在线av| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美成人免费av一区二区三区| 久久人妻av系列| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 午夜福利视频1000在线观看| 青草久久国产| 久9热在线精品视频| 国产成人欧美在线观看| 正在播放国产对白刺激| 国产高清videossex| 最近最新免费中文字幕在线| av在线天堂中文字幕| 色播亚洲综合网| 日韩大码丰满熟妇| 久久这里只有精品19| 欧美中文日本在线观看视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 色老头精品视频在线观看| 亚洲成人久久性| 村上凉子中文字幕在线| 色综合亚洲欧美另类图片| 他把我摸到了高潮在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 一级片免费观看大全| 亚洲国产精品成人综合色| 男人的好看免费观看在线视频 | 12—13女人毛片做爰片一| 老汉色∧v一级毛片| 国产视频一区二区在线看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 亚洲五月色婷婷综合| 午夜激情av网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 在线观看舔阴道视频| 亚洲国产精品合色在线| 一级a爱视频在线免费观看| 一二三四在线观看免费中文在| 久久草成人影院| 国产真实乱freesex| 欧美成狂野欧美在线观看| 满18在线观看网站| 免费高清在线观看日韩| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 国产一区在线观看成人免费| 久久久水蜜桃国产精品网| 国产精品av久久久久免费| 男女之事视频高清在线观看| 日本一区二区免费在线视频| 国产亚洲欧美98| www.精华液| 久久久久久久久中文| 国产精品99久久99久久久不卡| 麻豆成人av在线观看| 午夜免费成人在线视频| 精品久久久久久,| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲,欧美精品.| 宅男免费午夜| 久久久水蜜桃国产精品网| 嫩草影院精品99| 久久亚洲真实| 日韩有码中文字幕| 亚洲av电影不卡..在线观看| 欧美大码av| 久久精品国产综合久久久| 国产精品一区二区免费欧美| 中文资源天堂在线| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久精品人妻少妇| avwww免费| 午夜两性在线视频| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 色播在线永久视频| 日韩欧美国产在线观看| 成人一区二区视频在线观看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 欧美成人午夜精品| 久久国产精品影院| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 精品国产美女av久久久久小说| 久久久久久国产a免费观看| 大香蕉久久成人网| 美女 人体艺术 gogo| 午夜福利成人在线免费观看| 可以在线观看毛片的网站| 欧美乱色亚洲激情| 老司机靠b影院| 国产三级在线视频| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美性猛交黑人性爽| 国产伦人伦偷精品视频| 99在线视频只有这里精品首页| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 99热6这里只有精品| 久久热在线av| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 成人精品一区二区免费| 午夜激情av网站| 嫩草影视91久久| 精品国产美女av久久久久小说| 久久久国产精品麻豆| 国内揄拍国产精品人妻在线 | 中文字幕人成人乱码亚洲影| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 国产精品精品国产色婷婷| 日韩视频一区二区在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 黄色视频不卡| 一夜夜www| 欧美日韩福利视频一区二区| 精品久久蜜臀av无| 人人澡人人妻人| 99国产精品一区二区三区| 不卡av一区二区三区| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 亚洲午夜理论影院| 日本免费一区二区三区高清不卡| av中文乱码字幕在线| 欧美性猛交黑人性爽| 色播亚洲综合网| 黄色片一级片一级黄色片| 91麻豆av在线| 亚洲第一电影网av| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 99久久精品国产亚洲精品| 精品久久久久久成人av| 久久午夜综合久久蜜桃| 成人一区二区视频在线观看| aaaaa片日本免费| 最新在线观看一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲图色成人| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 直男gayav资源| 亚洲精品456在线播放app| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美色欧美亚洲另类二区| 五月伊人婷婷丁香| 男女边吃奶边做爰视频| 日韩亚洲欧美综合| 两个人视频免费观看高清| 亚洲国产精品成人综合色| 最近在线观看免费完整版| 久久精品夜色国产| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 内地一区二区视频在线| 白带黄色成豆腐渣| 国产男靠女视频免费网站| 亚洲精品国产成人久久av| 欧美zozozo另类| 99久国产av精品| 不卡一级毛片| 一夜夜www| av在线老鸭窝| 中文字幕av成人在线电影| 日日干狠狠操夜夜爽| 精品久久久噜噜| 亚洲精品成人久久久久久| 春色校园在线视频观看| 日韩成人伦理影院| 久久精品国产清高在天天线| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久久久久久久久成人| 久久中文看片网| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 国产黄片美女视频| 久久精品综合一区二区三区| 精品午夜福利视频在线观看一区| 婷婷亚洲欧美| 国产精品三级大全| 特大巨黑吊av在线直播| 日本黄大片高清| 狠狠狠狠99中文字幕| av在线老鸭窝| 午夜福利在线在线| 国产成人a∨麻豆精品| 美女被艹到高潮喷水动态| 国产伦精品一区二区三区视频9| 99久国产av精品国产电影| 最近最新中文字幕大全电影3| 白带黄色成豆腐渣| 一级a爱片免费观看的视频| 最近视频中文字幕2019在线8| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美另类亚洲清纯唯美| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 欧美+亚洲+日韩+国产| 看非洲黑人一级黄片| 欧美激情在线99| 国产精品永久免费网站| 日本黄色视频三级网站网址| 99热只有精品国产| 午夜免费激情av| 日韩欧美国产在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 男女下面进入的视频免费午夜| 中文字幕熟女人妻在线| 久久午夜亚洲精品久久| 真实男女啪啪啪动态图| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲美女黄片视频| 亚洲18禁久久av| 成人性生交大片免费视频hd| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本黄大片高清| 亚洲18禁久久av| 国产精品一区www在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲自偷自拍三级| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 久久久久精品国产欧美久久久| 在线国产一区二区在线| 又粗又爽又猛毛片免费看| 国产一区二区在线av高清观看| 51国产日韩欧美| 波多野结衣巨乳人妻| 日本色播在线视频| 69av精品久久久久久| 日本在线视频免费播放| 亚洲专区国产一区二区| 国产精品av视频在线免费观看| 天美传媒精品一区二区| 国产久久久一区二区三区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 国产一级毛片七仙女欲春2| 变态另类丝袜制服| 春色校园在线视频观看| 亚洲在线自拍视频| 99视频精品全部免费 在线| 五月伊人婷婷丁香| 成人漫画全彩无遮挡| 成人av在线播放网站| 日本一本二区三区精品| 永久网站在线| 国内揄拍国产精品人妻在线| 99riav亚洲国产免费| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 亚洲综合色惰| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 国产免费一级a男人的天堂| 六月丁香七月| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩欧美三级三区| 晚上一个人看的免费电影| 欧美日韩综合久久久久久| 五月玫瑰六月丁香| 麻豆乱淫一区二区| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产高清激情床上av| 老司机影院成人| 国产激情偷乱视频一区二区| 精品福利观看| 午夜福利在线在线| 国产成人91sexporn| 夜夜爽天天搞| 国产在视频线在精品| 三级经典国产精品| 国产成人91sexporn| 性插视频无遮挡在线免费观看| 校园春色视频在线观看| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 99在线人妻在线中文字幕| 秋霞在线观看毛片| 亚洲最大成人中文| 亚洲精品成人久久久久久| 91久久精品国产一区二区成人| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 特级一级黄色大片| 一级a爱片免费观看的视频| 国产精品久久久久久av不卡| 别揉我奶头 嗯啊视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲18禁久久av| 免费电影在线观看免费观看| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲熟妇熟女久久| 韩国av在线不卡| 日韩国内少妇激情av| 最好的美女福利视频网| 麻豆国产97在线/欧美| 99riav亚洲国产免费| 国产 一区 欧美 日韩| 在线天堂最新版资源| 国产精品三级大全| 99热这里只有精品一区| 国产男靠女视频免费网站| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 天堂动漫精品| 久久久久性生活片| 你懂的网址亚洲精品在线观看 | 国产精品一区二区性色av| 亚洲精品久久国产高清桃花| 国产毛片a区久久久久| 日韩欧美免费精品| 99久久中文字幕三级久久日本| 99riav亚洲国产免费| 免费av不卡在线播放| 精品免费久久久久久久清纯| 日韩成人伦理影院| 久久久久久国产a免费观看| 联通29元200g的流量卡| 久久久成人免费电影| 人妻久久中文字幕网| 色在线成人网| 久久精品夜色国产| 1000部很黄的大片| 99久久精品国产国产毛片| 一个人看的www免费观看视频| 亚洲熟妇熟女久久| 国产精品一区二区免费欧美| 国产伦精品一区二区三区视频9| 人妻久久中文字幕网| 成人三级黄色视频| 国产亚洲欧美98| 国产乱人视频| 好男人在线观看高清免费视频| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲五月天丁香| 欧美最新免费一区二区三区| 欧美zozozo另类| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲性夜色夜夜综合| 色5月婷婷丁香| 国产精品女同一区二区软件| 久久久a久久爽久久v久久| 国产成人91sexporn| 精品久久久久久成人av| 国产一区二区在线观看日韩| 一级av片app| 亚洲国产精品sss在线观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 久99久视频精品免费| 国产高清视频在线播放一区| 免费观看的影片在线观看| 国产高清不卡午夜福利| 中国美女看黄片| 亚洲经典国产精华液单| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 精品久久久久久久久av| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 国产伦精品一区二区三区视频9| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产精品无大码| 国产精品久久久久久久久免| 午夜福利18| 欧美成人免费av一区二区三区| av国产免费在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品人妻视频免费看| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲av中文av极速乱| 美女 人体艺术 gogo| 久久久午夜欧美精品| 国产中年淑女户外野战色| 久久欧美精品欧美久久欧美| 三级毛片av免费| 免费看a级黄色片| 麻豆av噜噜一区二区三区| 美女大奶头视频| 中文字幕免费在线视频6| 精华霜和精华液先用哪个| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲国产高清在线一区二区三| 美女cb高潮喷水在线观看| 免费av不卡在线播放| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产欧美日韩一区二区精品| 日本黄大片高清| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲欧美精品自产自拍| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 麻豆久久精品国产亚洲av| 免费观看的影片在线观看| 一本精品99久久精品77| 久久久久久久午夜电影| 中文在线观看免费www的网站| 国产私拍福利视频在线观看| 日本一本二区三区精品| 麻豆国产97在线/欧美| 国产精品不卡视频一区二区| 欧美一区二区亚洲| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 国产一区二区激情短视频| 麻豆一二三区av精品| 18禁在线播放成人免费| 一个人看视频在线观看www免费| 一个人免费在线观看电影| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 男女边吃奶边做爰视频| 成人精品一区二区免费| 国产黄色小视频在线观看| 欧美不卡视频在线免费观看| 亚洲五月天丁香| 久久精品91蜜桃| 亚洲国产精品成人久久小说 | 国产极品精品免费视频能看的| 国产亚洲精品久久久com| 国产乱人视频| 欧美3d第一页| 亚洲美女视频黄频| 国产大屁股一区二区在线视频| 久久中文看片网| 日韩一区二区视频免费看| 成人漫画全彩无遮挡| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 天美传媒精品一区二区| 免费av不卡在线播放| 老司机影院成人| 国产av在哪里看| 亚洲欧美精品综合久久99| 久久精品国产清高在天天线| 成人综合一区亚洲| 亚洲最大成人av| 久久久久国产网址| 最后的刺客免费高清国语| 国产高潮美女av| 国产精品一二三区在线看| 亚洲欧美成人综合另类久久久 | 狠狠狠狠99中文字幕| .国产精品久久| 精品欧美国产一区二区三| av在线观看视频网站免费| 亚洲人成网站在线播| 美女黄网站色视频| 美女被艹到高潮喷水动态| 俄罗斯特黄特色一大片| 三级经典国产精品| 久久久国产成人免费| 欧美日本亚洲视频在线播放| 亚洲不卡免费看| 五月玫瑰六月丁香| 国产在线男女| 岛国在线免费视频观看| 国产视频一区二区在线看| 国产黄色视频一区二区在线观看 | 国产色爽女视频免费观看| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 黄色配什么色好看| 毛片女人毛片| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 国产黄色视频一区二区在线观看 | 最近最新中文字幕大全电影3| 色综合站精品国产| 日韩精品中文字幕看吧| 国产亚洲av嫩草精品影院| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产亚洲av嫩草精品影院| 国产成人精品久久久久久| 夜夜夜夜夜久久久久|