蒺藜總皂苷對LPS 誘導的巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2、NO 的影響和機制①

朱克春 馬 萍

（成都中醫(yī)藥大學，成都611130）

炎癥是一個復雜的過程，是機體對組織損傷或感染而產生的防御反應，炎癥反應的發(fā)生與機體內炎癥相關細胞有關，并伴隨多種化學物質的合成和釋放[1］。研究表明，多種疾病如心臟病、關節(jié)炎、糖尿病、膿毒癥等都與炎癥有關[2］。炎癥反應過程中，巨噬細胞作用廣泛，巨噬細胞是一種固有免疫細胞，其可以通過模式識別受體介導天然免疫應答，影響宿主相關炎癥因子如IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2和炎癥介質NO 的分泌，促進NO 合酶誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達[3］。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是細胞內毒素的有效成分，是激活機體炎癥反應的重要誘導因子[4］。蒺藜又名白蒺藜、刺蒺藜，是植物蒺藜的干燥成熟果實，其含有多種有效成分，其中以皂苷類研究最多[5］。蒺藜總皂苷有抗衰老、調節(jié)血脂、抗腫瘤等功效[6］。研究顯示，蒺藜總皂苷還具有消炎作用，其可以抑制心肌缺血再灌注、動脈粥樣硬化等疾病發(fā)生中炎癥因子的釋放[7］。Toll 樣受體4（toll-like receptor-4，TLR4）是一個與炎癥有關的調控因子，其是LPS激活誘導的炎癥信號轉導受體，TLR4表達水平升高后促進炎癥反應[8］。目前對蒺藜總皂苷在LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子釋放中的作用還不十分明確。本次實驗以巨噬細胞RAW264.7 作為實驗對象，探討蒺藜總皂苷對LPS 條件下巨噬細胞炎癥反應中的作用和機制，為明確蒺藜總皂苷抗炎作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen；巨噬細胞RAW264.7 購自上海復祥生物科技有限公司；蒺藜總皂苷購自西安昌岳生物科技有限公司；IL-6 檢測試劑盒、IL-1β 檢測試劑盒購自深圳市科潤達生物工程有限公司；pcDNA3.1-TLR4 由漢恒生物科技（上海）有限公司構建；TNF-α檢測試劑盒、IL-2 檢測試劑盒購自廣東體必康生物科技有限公司；LPS 購自北京索萊寶科技有限公司；NO 含量檢測試劑盒購自上海索橋生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CCK-8 方法檢測蒺藜總皂苷對巨噬細胞增殖活性影響 巨噬細胞按照1×106個/孔接種到96孔細胞培養(yǎng)板內，每個孔內添加100 μl 的細胞懸浮液，培養(yǎng)2 h 后，把上清溶液棄掉，加入含有蒺藜總皂苷濃度為0、10、20、40、80、160 μg/ml 的細胞培養(yǎng)液各100 μl，放在37℃的培養(yǎng)箱內孵育培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板，在每個孔內分別加入10 μl的CCK-8溶液，放在37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h。酶標儀測定450 nm的OD 值。計算細胞存活率。細胞存活率（%）=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.2 實驗分組處理 巨噬細胞分成Control、LPS、GSTT-L、GSTT-M、GSTT-H 組，Control 組為空白對照細胞；LPS 組在實驗開始時用含有LPS 濃度為1 μg/ml 的細胞培養(yǎng)液處理培養(yǎng)；CCK-8 結果表明，10、20、40 μg/ml濃度的蒺藜總皂苷對巨噬細胞無毒性，因此選擇10、20、40 μg/ml濃度的蒺藜總皂苷處理巨噬細胞。GSTT-L、GSTT-M、GSTT-H組細胞在實驗開始時以含有蒺藜總皂苷濃度為10、20、40 μg/ml和LPS濃度為1 μg/ml的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.2.3 ELISA 法檢測IL-1β、IL-6、TNF- α、IL-2 水平 取已經培養(yǎng)24 h 后的Control、LPS、GSTT-L、GSTT-M、GSTT-H組細胞，連同培養(yǎng)液一起轉移到離心管內，以4℃、12000 g離心10 min，收集上清溶液，用ELISA方法檢測培養(yǎng)液上清中IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-2 含量，步驟完全參照IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-2 檢測試劑盒說明書進行。

1.2.4 Griess 法檢測NO 含量 取已經培養(yǎng)24 h 后的Control、LPS、GSTT-L、GSTT-M、GSTT-H 組細胞，連同培養(yǎng)液一起轉移到離心管內，以4℃、12000 g離心10 min，收集上清溶液，按照NO 含量檢測試劑盒測定NO的含量。

1.2.5 Western blot 檢測iNOS、TLR4 蛋白表達 取已經培養(yǎng)24 h 后的Control、LPS、GSTT-L、GSTT-M、GSTT-H 組細胞，在細胞內添加RIPA 試劑（含有PMSF），12000 g 離心10 min，吸取上清用于BCA 蛋白定量檢測。按照20 μg/孔的蛋白上樣量進行SDS-PAGE 電泳，選擇10% 的分離膠以及5% 的濃縮膠進行電泳，首先以90 V 的電壓電泳約30 min 后，此時可觀察到溴酚藍染料進入到分離膠，把電壓調整為110 V 繼續(xù)電泳，肉眼觀察溴酚藍進入到凝膠的底部以后，關閉電源。取出分離膠，將NC 膜裁剪成合適大小，浸泡在轉移緩沖液中平衡10 min。以50 V 的電壓轉膜，轉膜放在冰上進行。將NC 膜取出，放在5% 脫脂奶粉溶液中封閉2 h，然后將NC 膜置于TBST 溶液中漂洗3 次，放在一抗稀釋液（iNOS抗體以1∶800 稀釋，TLR4 抗體以1∶1000 稀釋）中，在4℃過夜反應，經TBST 漂洗以后，放在1∶2000 稀釋的二抗溶液中，室溫結合2 h。ECL顯色試劑盒顯色，以ScnImage 分析條帶的灰度值。GAPDH 作為參照，分析計算iNOS、TLR4蛋白表達水平。

1.2.6 TLR4對蒺藜總皂苷影響LPS條件下巨噬細胞分泌炎癥因子和NO 的作用檢測 巨噬細胞密度為60% 時，用Lipofectamine 2000將pcDNA3.1-TLR4和pcDNA3.1分別轉染到細胞內，以含有蒺藜總皂苷濃度為20 μg/ml 和LPS 濃度為1 μg/ml 的細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，命名為GSTT-M+TLR4和GSTT-M+Vector組。細胞培養(yǎng)24 h后，CCK-8檢測增殖，ELISA法測定IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2 水平，Griess 法檢測NO 含量，Western blot 檢 測iNOS、TLR4 蛋 白 表 達，步 驟 同1.2.5。

1.3 統(tǒng)計學分析 實驗數據用SPSS21.0 軟件分析，計量資料用±s表示，兩組數據間比較用t檢驗，多組差異比較用單因素方差，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 蒺藜總皂苷對巨噬細胞增殖活性影響 見表1，與0 μg/ml 蒺藜總皂苷處理的細胞比較，10、20、40 μg/ml 的蒺藜總皂苷處理后巨噬細胞存活率無顯著性變化；80、160 μg/ml 蒺藜總皂苷處理后的巨噬細胞存活率降低。綜合考慮，選擇對巨噬細胞無毒性的蒺藜總皂苷作后續(xù)實驗，因此選擇10、20、40 μg/ml濃度的蒺藜總皂苷處理巨噬細胞。

表1 蒺藜總皂苷處理后巨噬細胞存活率變化（±s，μg/ ml，%）Tab.1 Changes of survival rate of macrophages treated with gross saponins of tribulus terrestris （±s，μg/ ml，%）

表1 蒺藜總皂苷處理后巨噬細胞存活率變化（±s，μg/ ml，%）Tab.1 Changes of survival rate of macrophages treated with gross saponins of tribulus terrestris （±s，μg/ ml，%）

Note：Compared with 0 μg/ ml，1）P<0.05.

Action concentration of gross saponins of tribulus terrestris 010204080160 F P Survival rate 100.00±10.2399.52±9.6197.85±8.3295.23±8.7180.01±6.761）61.15±6.201）30.540<0.001

2.2 蒺藜總皂苷對LPS 條件下巨噬細胞增殖活性影響 見表2，與Control 組比較，LPS 組巨噬細胞存活率下降（P<0.05）；與LPS組比較，GSTT-L、GSTT-M、GSTT-H 組巨噬細胞存活率逐漸升高（P<0.05）。蒺藜總皂苷提高LPS條件下巨噬細胞增殖活性。

表2 蒺藜總皂苷處理后LPS 條件下巨噬細胞存活率（±s，%）Tab.2 Survival rate of macrophages treated with gross saponins of tribulus terrestris induced by LPS（±s，%）

表2 蒺藜總皂苷處理后LPS 條件下巨噬細胞存活率（±s，%）Tab.2 Survival rate of macrophages treated with gross saponins of tribulus terrestris induced by LPS（±s，%）

Note：Compared with control，1）P<0.05；compared with LPS，2）P<0.05；compared with GSTT-L，3）P<0.05；compared with GSTTM，4）P<0.05.

Groups Control LPS GSTT-L GSTT-M GSTT-H F P Survival rate 100.00±9.6256.35±5.721）68.94±6.332）80.65±4.202）3）93.51±6.682）3）4）62.506<0.001

2.3 蒺藜總皂苷對LPS 條件下巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2 影響 見表3，與Control 組比較，LPS 組巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2水平升高（P<0.05）；與LPS組比較，GSTT-L、GSTTM、GSTT-H組巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2水平逐漸降低（P<0.05）。蒺藜總皂苷抑制LPS條件下巨噬細胞分泌炎癥因子。

表3 蒺藜總皂苷處理后LPS條件下巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2水平（±s，pg/ ml）Tab.3 Levels of IL-1β，IL-6，TNF-α and IL-2 secreted by macrophages under LPS condition after treatment with gross saponins of tribulus terrestris（±s，pg/ ml）

表3 蒺藜總皂苷處理后LPS條件下巨噬細胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2水平（±s，pg/ ml）Tab.3 Levels of IL-1β，IL-6，TNF-α and IL-2 secreted by macrophages under LPS condition after treatment with gross saponins of tribulus terrestris（±s，pg/ ml）

Note：Compared with control，1）P<0.05；compared with LPS，2）P<0.05；compared with GSTT-L，3）P<0.05；compared with GSTT-M，4）P<0.05.

Groups Control LPS GSTT-L GSTT-M GSTT-H F P TNF-α 128.62±12.54246.53±15.581）193.51±12.032）163.87±12.912）3）135.22±10.462）3）4）127.552<0.001 IL-1β 203.61±20.87376.98±22.691）301.78±20.132）256.30±15.472）3）211.34±16.832）3）4）122.738<0.001 IL-635.20±2.69120.84±11.631）89.67±7.222）62.95±5.202）3）40.16±2.252）3）4）254.178<0.001 IL-28.25±0.9635.14±3.201）26.54±2.252）17.46±1.362）3）9.87±0.942）3）4）307.176<0.001

2.4 蒺藜總皂苷對LPS條件下巨噬細胞iNOS和NO水平影響 見圖1和表4，與Control組比較，LPS組巨噬細胞NO含量和iNOS蛋白水平均升高（P<0.05）；與LPS組比較，GSTT-L、GSTT-M、GSTT-H組巨噬細胞NO含量和iNOS蛋白水平逐漸降低（P<0.05）。蒺藜總皂苷抑制LPS條件下巨噬細胞合成NO。

圖1 Western blot檢測蒺藜總皂苷對LPS條件下巨噬細胞中iNOS蛋白表達影響Fig.1 Western blot was used to detect effect of gross sapo?nins of tribulus terrestris on iNOS protein expres?sion in macrophages under LPS condition

表4 蒺藜總皂苷處理后LPS條件下巨噬細胞NO含量和iNOS蛋白水平（±s）Tab.4 Contents of NO and iNOS protein in macrophages treated with gross saponins of tribulus terrestris（±s）

表4 蒺藜總皂苷處理后LPS條件下巨噬細胞NO含量和iNOS蛋白水平（±s）Tab.4 Contents of NO and iNOS protein in macrophages treated with gross saponins of tribulus terrestris（±s）

Note：Compared with control，1）P<0.05；compared with LPS，2）P<0.05；compared with GSTT-L，3）P<0.05；compared with GSTTM，4）P<0.05.

Groups Control LPS GSTT-L GSTT-M GSTT-H F P NO（μmol/L）12.04±1.0932.65±2.281）26.30±2.152）21.11±1.062）3）16.78±1.542）3）4）200.815<0.001 iNOS 0.20±0.030.75±0.071）0.46±0.052）0.33±0.042）3）0.21±0.032）3）4）215.208<0.001

2.5 蒺藜總皂苷對LPS條件下巨噬細胞中TLR4表達影響 見圖2和表5，與Control組比較，LPS組巨噬細胞TLR4蛋白水平升高（P<0.05）；與LPS組比較，GSTT-L、GSTT-M、GSTT-H組巨噬細胞TLR4蛋白水平逐漸降低（P<0.05）。蒺藜總皂苷抑制LPS條件下巨噬細胞中TLR4表達。

圖2 Western blot檢測蒺藜總皂苷對LPS條件下巨噬細胞中TLR4蛋白表達影響Fig.2 Western blot was used to detect effect of gross sapo?nins of tribulus terrestris on TLR4 protein expres?sion in macrophages under LPS condition

表5 蒺藜總皂苷處理后LPS條件下巨噬細胞TLR4蛋白水平（±s）Tab.5 TLR4 protein levels of macrophages treated with gross saponins of tribulus terrestris under LPS condition（±s）

表5 蒺藜總皂苷處理后LPS條件下巨噬細胞TLR4蛋白水平（±s）Tab.5 TLR4 protein levels of macrophages treated with gross saponins of tribulus terrestris under LPS condition（±s）

Note：Compared with control，1）P<0.05；compared with LPS，2）P<0.05；compared with GSTT-L，3）P<0.05；compared with GSTT-M，4）P<0.05.

Groups Control LPS GSTT-L GSTT-M GSTT-H F P TLR40.23±0.040.96±0.101）0.56±0.062）0.32±0.042）3）0.24±0.032）3）4）242.085<0.001

2.6 TLR4對蒺藜總皂苷影響LPS條件下巨噬細胞炎癥因子和NO合成作用 見圖3和表6，與GSTTM+Vector組比較，GSTT-M+TLR4組巨噬細胞TLR4、iNOS蛋白水平升高，細胞增殖活性下降，細胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2增多，細胞合成的NO增多（P<0.05）。TLR4逆轉蒺藜總皂苷對LPS條件下巨噬細胞炎癥因子和NO合成影響。

表6 蒺藜總皂苷處理后LPS條件下巨噬細胞存活率和分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2水平以及NO水平和TLR4、iNOS蛋白水平（±s）Tab.6 Survival rate and secretion levels of IL-1β，IL-6，TNF-α，IL-2，NO level and TLR4，iNOS protein levels with TLR4 up-regulated in gross saponins of tribulus terrestris treated macrophages under LPS condition（±s）

表6 蒺藜總皂苷處理后LPS條件下巨噬細胞存活率和分泌IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2水平以及NO水平和TLR4、iNOS蛋白水平（±s）Tab.6 Survival rate and secretion levels of IL-1β，IL-6，TNF-α，IL-2，NO level and TLR4，iNOS protein levels with TLR4 up-regulated in gross saponins of tribulus terrestris treated macrophages under LPS condition（±s）

Note：Compared with GSTT-M+Vector，1）P<0.05.

Groups GSTT-M+Vector GSTT-M+TLR4 t P Survival rate（%）100.00±11.2572.36±7.141）6.223<0.001 TNF-α（pg/ml）160.52±13.47210.59±16.721）6.996<0.001 IL-1β（pg/ml）258.94±17.78325.68±30.641）5.652<0.001 IL-6（pg/ml）63.05±4.4789.66±8.861）8.044<0.001 IL-2（pg/ml）18.94±1.5634.82±2.371）16.790<0.001 NO（μmol/L）22.04±1.1729.65±2.761）7.616<0.001 iNOS 0.38±0.060.77±0.081）11.700<0.001 TLR40.31±0.060.68±0.071）12.040<0.001

圖3 Western blot檢測上調TLR4對蒺藜總皂苷影響LPS條件下巨噬細胞中TLR4、iNOS蛋白表達作用Fig.3 Western blot analysis TLR4 and iNOS levels with TLR4 up-regulated in gross saponins of tribulus terrestris treated macrophages under LPS condition

3 討論

巨噬細胞參與人體免疫反應，其在受到外界因素刺激以后，可以產生并釋放大量的炎癥因子，這些炎癥因子參與機體免疫應答和炎癥反應過程，巨噬細胞本身具有多種功能，能夠影響各種感染性原因引起的炎癥性疾病，巨噬細胞通過引起免疫-炎癥反應將病原體排除，調控機體問題[9］。LPS是常見的炎癥誘導因子，其可以激活組織和細胞炎癥反應，誘導炎癥因子釋放[4］。NO是存在于機體內的炎癥介質，其在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[10］。iNOS是機體內合成NO的重要蛋白酶，主要在巨噬細胞中表達，當巨噬細胞受到LPS等刺激以后，iNOS水平會大大增加，進而合成大量的NO，介導炎癥反應[11］。研究表明，LPS處理以后的巨噬細胞增殖活性下降，細胞炎癥因子釋放水平增加[12-13］。本實驗結果顯示，LPS刺激以后的巨噬細胞增殖能力下降，細胞分泌的IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2增多，細胞合成的NO增多，細胞中iNOS水平增加，提示LPS誘導巨噬細胞炎癥損傷，這為后續(xù)實驗奠定基礎。

蒺藜被稱為“草中名藥”，是蒺藜科植物蒺藜的干燥果實，具有名目止癢、活血祛風等功效，蒺藜有多種活性成分，如生物堿、黃酮類、皂苷類、無機鹽、脂肪酸等等，其中皂苷類的研究最為廣泛[6］?，F代醫(yī)學研究發(fā)現，蒺藜總皂苷有心血管保護作用，其可以軟化血管、調節(jié)血脂，對動脈粥樣硬化有治療和預防作用[7］。蒺藜總皂苷還具有消炎、抗菌、抗氧化等功效[14］。蒺藜總皂苷處理后的腦缺血大鼠腦組織中炎癥因子表達水平明顯下降[15］。本實驗用蒺藜總皂苷處理LPS條件下巨噬細胞，結果發(fā)現，蒺藜總皂苷能夠提高LPS條件下巨噬細胞增殖活性，減少細胞釋放IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-2，抑制細胞產生NO，提示蒺藜總皂苷具有抗巨噬細胞炎癥的作用。

TLR4是Toll樣受體家族成員之一，其是Ⅰ型跨膜受體蛋白，包含胞內區(qū)、跨膜段、胞外區(qū)共3個部分，其基因定位在9q染色體上，在巨噬細胞、單核細胞、中性粒細胞等多種細胞中表達[16-17］。TLR4有多種生物學作用，與免疫反應、炎癥、細胞生長等有關，參與膿毒癥、糖尿病、腫瘤等多種疾病進展[18-20］。TLR4參與LPS介導的細胞炎癥，其是LPS激活信號的轉導受體，能夠調控TNF-α、IL-6等炎癥因子的表達[21-22］。本實驗顯示，LPS處理后的巨噬細胞中TLR4的表達水平升高，并且蒺藜總皂苷可以降低LPS條件下巨噬細胞中TLR4的表達水平，提示蒺藜總皂苷作用機制可能與TLR4有關。本課題組進一步通過細胞轉染的方式提高巨噬細胞中TLR4的表達，結果發(fā)現，上調TLR4可以逆轉蒺藜總皂苷對LPS條件下巨噬細胞炎癥因子分泌和NO合成的影響，這充分證明，蒺藜總皂苷通過下調TLR4的表達抑制LPS誘導的巨噬細胞炎癥因子表達。

總而言之，蒺藜總皂苷可以減輕LPS誘導的巨噬細胞炎癥，其通過下調TLR4的表達發(fā)揮抗炎癥作用，這為研究蒺藜總皂苷的藥理學作用提供了參考，為研究蒺藜總皂苷在炎癥反應中的作用機制提供了資料。后續(xù)會繼續(xù)研究蒺藜總皂苷的具體靶向調控機制。