糙皮側(cè)耳對(duì)秸稈木質(zhì)纖維素降解能力的研究*

龔 娜，陳 珣，劉國(guó)麗，肖 軍

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，遼寧 沈陽(yáng) 110161）

食用菌產(chǎn)業(yè)是我國(guó)的朝陽(yáng)產(chǎn)業(yè)，在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)中的地位日趨重要[1]。食用菌栽培的主要原料有棉籽殼、木屑，隨著食用菌產(chǎn)業(yè)的不斷擴(kuò)大，傳統(tǒng)原料供應(yīng)緊張，價(jià)格持續(xù)上漲，不僅增加了生產(chǎn)成本，還造成了“菌林矛盾”。因此，亟需尋找新型替代基質(zhì)，以降低闊葉木屑的大量消耗，有效地保護(hù)森林資源，緩解食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展與林業(yè)資源的矛盾[1]。中國(guó)是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國(guó)，農(nóng)作物秸稈資源儲(chǔ)量巨大，秸稈中含有食用菌栽培原料最主要的碳源。在物質(zhì)循環(huán)過(guò)程中，食用菌通過(guò)菌絲體分泌的水解酶及氧化酶降解和利用秸稈中的大分子物質(zhì)，如木質(zhì)素、纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)、多糖等，通過(guò)食用菌菌絲的生長(zhǎng)的利用子實(shí)體形成將其轉(zhuǎn)化為優(yōu)質(zhì)、味美的蛋白質(zhì)[2-4]。

糙皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus） 分類(lèi)上屬于擔(dān)子菌門(mén) （Basidiomycota） 層菌綱 （Agaricomycetes） 傘菌目 （Agaricales） 側(cè)耳科 （Pleurotaceae） 側(cè)耳屬（Pleurotus），是現(xiàn)在全球栽培面積和消費(fèi)量最大的食用菌之一[5]，其適應(yīng)性廣，多種農(nóng)作物秸稈均可作為栽培基質(zhì)[6]。玉米秸稈資源豐富，可替代木屑、棉籽殼，且價(jià)格便宜，可作為栽培糙皮側(cè)耳的主要原料[7-8]，既能減少對(duì)林業(yè)資源的破壞，又能為實(shí)現(xiàn)農(nóng)作物秸稈的就地轉(zhuǎn)化和綜合利用提供有效途徑。

為了更好地了解各糙皮側(cè)耳菌株對(duì)玉米秸稈的利用能力，篩選獲得高效利用纖維素、半纖維和木質(zhì)素的菌株是解決玉米秸稈降解利用問(wèn)題的關(guān)鍵。對(duì)不同糙皮側(cè)耳菌株降解利用纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的能力進(jìn)行初步探究，快速篩選適合秸稈栽培的優(yōu)勢(shì)糙皮側(cè)耳菌株。為推廣玉米秸稈應(yīng)用于食用菌栽培提供一定的研究依據(jù)，這對(duì)未來(lái)食用菌生物轉(zhuǎn)化農(nóng)業(yè)廢棄物的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

18個(gè)糙皮側(cè)耳菌株由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所試驗(yàn)室引種并保存，菌種信息見(jiàn)表1。

表1 糙皮側(cè)耳供試菌株Tab.1 Tested strains of the Pleurotus ostreatus

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1、瓊脂粉 15 g·L-1，去離子水 1 000 mL。

液體種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、馬鈴薯200 g·L-1，去離子水 1 000 mL。

羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基（CMC-Na培養(yǎng)基）[9]：羧甲基纖維素鈉 2.0 g·L-1、蛋白胨 2.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.88 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、瓊脂粉15 g·L-1，去離子水 1 000 mL，pH 7.0。

木聚糖培養(yǎng)基：木聚糖 10.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、蛋白胨 1.0 g·L-1、硫酸銨 4.0 g·L-1、瓊脂粉 15 g·L-1，去離子水 1 000 mL。

PDA-Bavendamm顯色反應(yīng)培養(yǎng)基[10]：在1 000 mL PDA培養(yǎng)基中加入0.14 mmol·L-1鞣酸。

木質(zhì)素降解培養(yǎng)基[11]：木質(zhì)磺酸鈉20.0 g·L-1、葡萄糖 0.5 g·L-1、豆粕 2.0 g·L-1、KH2PO43.0 g·L-1、MgSO41.5 g·L-1、CuSO40.375 g·L-1。

1.2 方法

1.2.1 菌種制備

將供試的糙皮側(cè)耳菌株接入PDA培養(yǎng)基及液體種子培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株活化，每個(gè)菌種接種3支，待菌絲活性恢復(fù)后備用。

1.2.2 降解利用纖維素菌株的篩選

采用直徑0.5 cm×0.5 cm的打孔器對(duì)已經(jīng)活化好的菌種平板進(jìn)行打孔后，用無(wú)菌鑷子將菌餅接入直徑為9 cm的羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基平板中央，置于25℃條件的生化培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。當(dāng)菌落直徑長(zhǎng)到培養(yǎng)皿直徑的2/3時(shí)，采用剛果紅溶液進(jìn)行染色，30 min后清除染液，然后采用NaCl溶液進(jìn)行脫色，再用清水沖洗培養(yǎng)基。采用游標(biāo)卡尺以“十字劃線法”量取菌落直徑以及水解圈直徑大小，通過(guò)比較水解圈直徑與菌落直徑大小的比值及水解圈大小、清晰程度，確定初篩菌株[12]，每組設(shè)置 3個(gè)重復(fù)。酶指數(shù)（EI）的計(jì)算公式為：

式中：D為水解圈直徑（mm）；d為菌落直徑（mm）。

1.2.3 降解利用半纖維素菌株的篩選

半纖維素主要成分為五碳和六碳的單糖構(gòu)成的異質(zhì)多聚體，其中木聚糖是最主要的成分[12]。故主要通過(guò)比較各菌株菌絲在木聚糖上生長(zhǎng)情況來(lái)評(píng)價(jià)各糙皮側(cè)耳菌株對(duì)木聚糖的利用能力。采用直徑為0.5 cm的打孔器對(duì)已經(jīng)活化好的菌種平板進(jìn)行打孔，然后將菌餅接入到木聚糖培養(yǎng)基平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。每日觀察菌絲生長(zhǎng)情況，培養(yǎng)8 d后以“十字劃線法”量取菌落直徑，比較各菌株菌絲的生長(zhǎng)情況。每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 降解利用木質(zhì)素菌株的篩選

1）木質(zhì)素利用測(cè)定

采用直徑為0.5 cm的打孔器對(duì)已經(jīng)活化好的各菌種平板進(jìn)行打孔，接種于PDA-Bavendamm培養(yǎng)基的平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。觀察并記錄菌落周?chē)欠裼凶睾稚兩Ξa(chǎn)生，有棕褐色變色圈者記為“+”，記錄顯色的時(shí)間以及變色的程度，“+”“++”“+++”“++++”表示顯色反應(yīng)逐漸加強(qiáng)。

2） 木質(zhì)素降解率的測(cè)定

首先配制濃度為 0、0.025 g·L-1、0.050 g·L-1、0.075 g·L-1、0.100 g·L-1、0.150 g·L-1、0.200 g·L-1的木質(zhì)素磺酸鈉溶液，并測(cè)定各濃度溶液在280 nm波長(zhǎng)下吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。

將活化好的不同菌株種子液按2%接種量接種至木質(zhì)素降解培養(yǎng)基中，置于25℃下恒溫?fù)u床中避光培養(yǎng)9 d，設(shè)置轉(zhuǎn)速為120 r·min-1。待培養(yǎng)結(jié)束后，將發(fā)酵液10 000 r·min-1離心10 min后取上清液，經(jīng)稀釋后測(cè)定OD280值，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算上清液中木質(zhì)素磺酸鈉含量[14]。木質(zhì)素降解率（P1，%）計(jì)算公式為：

式中：C為發(fā)酵后木質(zhì)素磺酸鈉的含量（g·L-1）。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS軟件檢驗(yàn)差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同糙皮側(cè)耳對(duì)纖維素利用潛力的定性分析

不同糙皮側(cè)耳菌株在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表2。

由表2可知，通過(guò)比較不同糙皮側(cè)耳菌株在羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，評(píng)價(jià)不同菌株對(duì)纖維素利用能力。試驗(yàn)表明，不同菌株菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)生透明圈的情況存在明顯的差異，說(shuō)明不同糙皮側(cè)耳菌株均具有一定的纖維素酶活性。在菌絲平均生長(zhǎng)速率方面，菌株P(guān)8、P4、P5、P6具有較好的表現(xiàn)且其水解圈直徑也較大。酶指數(shù)方面，菌株P(guān)10和P8表現(xiàn)最好。菌株P(guān)10雖然平均生長(zhǎng)速率和透明圈生成情況并不最突出，但酶指數(shù)最高，說(shuō)明菌株P(guān)10纖維素利用能力高于其他菌株，降解纖維素的能力最強(qiáng)。

表2 不同糙皮側(cè)耳菌株在羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀態(tài)Tab.2 The growth of different Pleurotus ostreatus strains of CMC-Na media

2.2 不同糙皮側(cè)耳對(duì)半纖維素利用潛力的定性分析

不同糙皮側(cè)耳菌株在木聚糖中的生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。

由表3可知，各菌株在木聚糖培養(yǎng)基上的菌絲直徑存在明顯的差異，菌絲生長(zhǎng)速率差異顯著。其中，菌株P(guān)16、菌株P(guān)3、菌株P(guān)14和菌株P(guān)4菌絲生長(zhǎng)速度相對(duì)較慢。菌株P(guān)10、菌株P(guān)8的生長(zhǎng)速度最快，分別為0.99 cm·d-1和0.97 cm·d-1。說(shuō)明在半纖維素利用方面，菌株P(guān)10和菌株P(guān)8的利用能力較強(qiáng)。

2.3 不同糙皮側(cè)耳菌株對(duì)木質(zhì)素降解的能力

2.3.1 不同糙皮側(cè)耳對(duì)木質(zhì)素利用潛力的定性分析

利用PDA-Bavendamm培養(yǎng)基對(duì)不同糙皮側(cè)耳菌株降解木質(zhì)素能力進(jìn)行初步篩選，供試不同糙皮側(cè)耳菌株在PDA-Bavendamm培養(yǎng)基中顯色反應(yīng)的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同糙皮側(cè)耳菌株在PDA-Bavendamm中的生長(zhǎng)情況Tab.4 Growth condition of different Pleurotus ostreatus strains in the PDA-Bavendamm

由表4可知，供試菌株在PDA-Bavendamm培養(yǎng)基中的顯色反應(yīng)均呈陽(yáng)性，表示各菌株具有降解木質(zhì)素的能力，不同菌株在PDA-Bavendamm平板上顯色反應(yīng)不同。根據(jù)變色圈產(chǎn)生的顏色深淺判斷，所有供試菌株均能降解木質(zhì)素，菌株P(guān)10、P4降解木質(zhì)素能力最強(qiáng)，菌株P(guān)15降解能力較強(qiáng)，菌株P(guān)3、P11降解木質(zhì)素能力最弱。菌株P(guān)10菌落直徑和變色圈直徑均大于其他菌株，說(shuō)明菌株P(guān)10更能快速降解并利用木質(zhì)素。通過(guò)木質(zhì)素降解能力的比較，從中篩選出降解能力最強(qiáng)的菌株為P10。

2.3.2 不同糙皮側(cè)耳菌株的木質(zhì)素降解率

經(jīng)過(guò)計(jì)算，得到木質(zhì)素磺酸鈉濃度與OD280間的線性回歸方程為：

此線性回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.998。18種不同糙皮側(cè)耳菌株木質(zhì)素降解率統(tǒng)計(jì)見(jiàn)圖1。

圖1 不同糙皮側(cè)耳菌株木質(zhì)素降解率Fig.1 Lignin degradation rates of different Pleurotus ostreatus strains

由圖1可知，各菌株對(duì)木質(zhì)素磺酸鈉降解程度存在顯著差異，其中P10菌株木質(zhì)素降解率最高，達(dá)到47.13%，降解效果最好。

3 結(jié)論與討論

秸稈主要組分包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素。降解木質(zhì)纖維素能有效提高農(nóng)業(yè)廢棄物的利用，篩選纖維素和木質(zhì)素降解能力強(qiáng)的菌株是解決秸稈生物降解問(wèn)題的關(guān)鍵[15]。自然界中，許多微生物能產(chǎn)生相應(yīng)的酶類(lèi)降解木質(zhì)素纖維素，食用菌生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中碳源的主要來(lái)源就是木質(zhì)纖維素，具有極強(qiáng)木質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)降解能力和特殊代謝類(lèi)型的白腐真菌，被認(rèn)為是主要的木質(zhì)素降解微生物[16-17]。白腐菌在碳循環(huán)中處于核心地位，是目前為止已知的唯一一類(lèi)可以將木質(zhì)素徹底降解成H2O和CO2的真菌。依據(jù)此降解方式，糙皮側(cè)耳被劃分到白腐菌中[18]。篩選獲得具有高效纖維素降解能力的菌株是高效利用纖維素類(lèi)物質(zhì)的關(guān)鍵，而評(píng)價(jià)菌株降解纖維素能力的重要指標(biāo)主要依據(jù)纖維素酶活力[19]。優(yōu)勢(shì)糙皮側(cè)耳菌株是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)，能極大的提升栽培效益。

多年的食用菌生物降解秸稈的研究表明，不同菌株的降解能力相差較大，側(cè)耳類(lèi)降解木質(zhì)素纖維素功能較強(qiáng)，在食用菌生物降解秸稈體系中，糙皮側(cè)耳可以說(shuō)是該體系研究中的模式菌種。試驗(yàn)初步研究了糙皮側(cè)耳菌株對(duì)玉米秸稈利用能力，對(duì)各菌株對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的利用能力進(jìn)行初步的篩選，明晰不同糙皮側(cè)耳對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的利用能力，供試菌株通過(guò)木質(zhì)素降解率試驗(yàn)，確定了降解秸稈能力最強(qiáng)的菌株。試驗(yàn)研究結(jié)果表明，綜合各菌株對(duì)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的利用情況研究，P10菌株的能力最強(qiáng)，降解纖維素的能力中酶指數(shù)最高，為0.97，說(shuō)明P10菌株纖維素利用能力高于其他菌株，木聚糖培養(yǎng)基上的菌絲直徑菌株P(guān)10的生長(zhǎng)速度最快，為0.99 cm·d-1，說(shuō)明P10菌株半纖維素利用能力高于其他菌株，在木質(zhì)素的實(shí)驗(yàn)中降解率達(dá)到47.13%，降解效果最好。