基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討知柏地黃湯治療前列腺癌的作用機(jī)制

房立源 李慧杰 王志鵬 李秀榮

摘要：目的? 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討知柏地黃湯治療前列腺癌的作用機(jī)制。方法? 利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）和UniProt數(shù)據(jù)庫獲取知柏地黃湯有效成分及作用靶點(diǎn)，通過OMIM和CTD數(shù)據(jù)庫篩選前列腺癌的相關(guān)靶點(diǎn)，將有效成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)用String數(shù)據(jù)庫繪制交集靶點(diǎn)的蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)拓?fù)浞治稣页鲫P(guān)鍵靶點(diǎn)，并進(jìn)行GO和KEGG富集分析，運(yùn)用分子對接技術(shù)對主要有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接。結(jié)果? 共獲得知柏地黃湯有效成分107個，作用于150個靶點(diǎn)，前列腺癌靶點(diǎn)825個，知柏地黃湯和前列腺癌交集靶點(diǎn)65個，主要有效成分有谷甾醇、槲皮素和山柰酚，關(guān)鍵靶點(diǎn)包括JUN、TP53、MAPK1、TNF和MAPK14。GO功能富集得到1668個條目，包括生物過程1527個、分子功能102個、細(xì)胞組分39個，KEGG通路富集得到134條通路，主要涉及癌癥途徑和PI3K-Akt信號通路等。分子對接結(jié)果顯示，化合物和靶點(diǎn)之間具有較好的結(jié)合性。結(jié)論? 知柏地黃湯治療前列腺癌具有多成分、多靶點(diǎn)、多通路的特點(diǎn)，可為進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);分子對接;知柏地黃湯;前列腺癌;作用機(jī)制

中圖分類號：R273;R285.5??? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A??? 文章編號：2095-5707（2021）05-0006-07

DOI： 10.3969/j.issn.2095-5707.2021.05.002? ??????開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Exploring the Mechanism of Zhibai Dihuang Decoction in Treating Prostate Cancer Based on Network Pharmacology

FANG Li-yuan¹， LI Hui-jie²， WANG Zhi-peng²， LI Xiu-rong^2*

（1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China; 2. Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250014， China）

Abstract： Objective To explore the material basis and mechanism of Zhibai Dihuang Decoction in the treatment of prostate cancer based on network pharmacology. Methods TCMSP database and UniProt database were used to screen out the active components and target genes of Zhibai Dihuang Decoction. The target genes of prostate cancer were screened out through OMIM and CTD databases. Cytoscape 3.7.1 software was used to construct the TCM component-target network; String database was used to construct the protein interaction （PPI） network diagram of Zhibai Dihuang Decoction to treat prostate cancer， and it was found the core target through topological analysis. The R database was used for GO analysis and KEGG analysis. Finally， the core?active components were docked with the key targets through molecular docking technology. Results There were 107 active components， 150 gene targets， and 825 prostate cancer disease targets in Zhibai Dihuang Decoction， and 65 intersection targets in Zhibai Dihuang Decoction and prostate cancer. The more effective components were： sitosterol， quercetin and kaempferol， and the key core targets were： JUN， TP53， MAPK1， TNF and MAPK14. GO biological process and KEGG enrichment analysis showed that there were 1668 GO pathways and 134 KEGG pathways involved in cancer pathway and PI3K-Akt signaling pathway. Molecular docking results showed that the core components had good binding energy with the key targets. Conclusion Zhibai Dihuang Decoction has the characteristics of multi-component， multi-target and multi-pathway in the treatment of prostate cancer， which provides a theoretical basis for further studies.

Key words： network pharmacology; molecular docking; Zhibai Dihuang Decoction; prostate cancer; mechanism

前列腺癌是老年男性常見的泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，2018年全球前列腺癌新發(fā)患者約127萬，位居新發(fā)腫瘤第3位，死亡人數(shù)約36萬^[1]。根據(jù)我國癌癥中心發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2015年我國新發(fā)前列腺癌患者7.2萬人，位居男性腫瘤新發(fā)人數(shù)第6位，且新發(fā)患者中70%是中晚期，五年生存率為66.4%。美國及歐洲各國新發(fā)前列腺癌患者81%處于早期，且五年生存率為99.5%^[2]。前列腺癌早期臨床表現(xiàn)無特異性，多為尿頻、尿急、排尿中斷、尿痛、血尿等，中晚期則以下尿路梗阻、轉(zhuǎn)移性骨痛、脊髓壓迫神經(jīng)癥狀和病理性骨折等表現(xiàn)為主^[3]。

前列腺癌屬中醫(yī)學(xué)“淋證”“癃閉”等范疇，病位在腎與膀胱，病機(jī)主要為肝腎陰虛，膀胱濕熱，《諸病源候論·諸淋病候》曰：“諸淋者，由腎虛膀胱熱故也?！敝嗅t(yī)通過辨病與辨證相結(jié)合，把握前列腺癌的病機(jī)特點(diǎn)，靈活處方用藥，隨癥加減，在提高患者生存質(zhì)量、減輕不良反應(yīng)方面顯示出確切療效。張亞強(qiáng)認(rèn)為前列腺癌的病機(jī)為本虛邪盛，本虛為氣血虧虛、脾腎兩虛，邪盛為熱、毒、瘀、濕、痰互結(jié)，且多為虛實(shí)夾雜^[4]。郭軍認(rèn)為腎氣虧虛是本病發(fā)生的根本原因，因虛致實(shí)^[5]。如《黃帝內(nèi)經(jīng)》所言：“邪之所湊，其氣必虛?！敝氐攸S湯出自清代醫(yī)家吳謙所著《醫(yī)宗金鑒》，以六味地黃丸為基礎(chǔ)方，合知母、黃柏而成，具有滋陰降火功效，是治療陰虛火旺的代表方，主治陰虛火旺而致骨蒸勞熱、虛煩盜汗、腰脊酸痛、遺精等證。王曄等^[6]運(yùn)用知柏地黃湯聯(lián)合化療治療腎陰虛型前列腺癌患者80例，結(jié)果顯示，聯(lián)合治療組患者臨床癥狀顯著改善，精子質(zhì)量提高。劉華等^[7]運(yùn)用知柏地黃湯加減聯(lián)合內(nèi)分泌治療晚期前列腺癌患者，經(jīng)過3個月治療后，聯(lián)合治療組患者潮熱不適等不良感覺明顯改善。近年來，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的興起和發(fā)展為中藥現(xiàn)代化研究提供了新思路，本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，深入探討知柏地黃湯治療前列腺癌的潛在作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究知柏地黃湯治療前列腺癌的藥理機(jī)制提供依據(jù)，并為臨床應(yīng)用提供參考。

1? 研究方法

1.1? 知柏地黃湯有效成分和作用靶點(diǎn)篩選

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）和UniProt數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org/uniprot/）獲取知柏地黃湯有效成分和作用靶點(diǎn)，設(shè)置篩選條件為口服生物利用度（Oral Bioavailability，OB）≥30%、類藥性（Drug Likeness，DL）≥0.18。

1.2? 前列腺癌相關(guān)靶點(diǎn)獲取

以關(guān)鍵詞“Prostate Cancer”在OMIM（https：// www.omim.org/）、CTD（https：//ctdbase.org/）數(shù)據(jù)庫檢索前列腺癌相關(guān)靶點(diǎn)，并通過查閱文獻(xiàn)進(jìn)行補(bǔ)充，最后導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶點(diǎn)名稱標(biāo)準(zhǔn)化處理，利用Venny 2.1在線工具篩選知柏地黃湯有效成分和前列腺癌的交集靶點(diǎn)，并繪制韋恩圖。

1.3? 藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將知柏地黃湯組成藥物、有效成分、交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)表示藥物、有效成分、交集靶點(diǎn)及疾病，連線表示節(jié)點(diǎn)間的相互作用。

1.4? 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），選擇物種為“homo sapiens”（人源），最低相互作用閾值設(shè)為“highest confidence=0.9”，得到蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)。

1.5? 知柏地黃湯治療前列腺癌關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

應(yīng)用Cytoscape 3.7.1軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)整體的中介中心性（Betweenness Centrality，BC）、接近中心性（Closeness Centrality，CC）和點(diǎn)度中心性（Degree Centrality，DC），選取BC、CC和DC均大于平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，明確PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.6? 交集靶點(diǎn)富集分析

通過R語言將交集靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換為entrez ID，并運(yùn)行BiocManager、clusterProfiler等程序包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為條件獲得GO功能和KEGG通路富集分析氣泡圖。最后運(yùn)用Perl語言將entrez ID轉(zhuǎn)換為原始基因靶點(diǎn)。根據(jù)功能分析和通路富集結(jié)果對知柏地黃湯治療前列腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測。

1.7? 主要有效成分與核心靶點(diǎn)的分子對接

選取知柏地黃湯中5個主要有效成分（豆甾醇、槲皮素、山柰酚、異谷葵堿和β-谷甾醇）與3個關(guān)鍵靶點(diǎn)（TP53、ESR1和JUN）進(jìn)行分子對接。從PDB數(shù)據(jù)庫（https：//www.rcsb.org）中下載靶點(diǎn)蛋白的3D結(jié)構(gòu)，從TCMSP數(shù)據(jù)庫中下載有效成分的3D結(jié)構(gòu)并保存為mol2格式。利用PYMOL軟件對靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行除水除配體，利用AutoDock 1.5.6軟件將有效成分及靶點(diǎn)蛋白的格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式，最后運(yùn)行AutoDock Vina進(jìn)行分子對接，使用PYMOL軟件對結(jié)果進(jìn)行可視化。一般認(rèn)為，有效成分和靶點(diǎn)的結(jié)合自由能<-5 kcal/mol表示具有較好的結(jié)合性。

2? 結(jié)果

2.1? 有效成分-疾病靶點(diǎn)篩選

篩選得到知柏地黃湯有效成分107個，作用靶點(diǎn)150個，前列腺癌靶點(diǎn)825個，知柏地黃湯作用靶點(diǎn)和前列腺癌交集靶點(diǎn)65個，韋恩圖見圖1。

2.2? 藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

采用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建藥物-有效成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，見圖2。該網(wǎng)絡(luò)中共有157個節(jié)點(diǎn)，包括作用于交集靶點(diǎn)的有效成分83個，靶點(diǎn)65個，760條相互作用連線。對知柏地黃湯有效成分進(jìn)一步分析，結(jié)果提示，知柏地黃湯治療前列腺癌的有效成分主要為生物堿類和甾醇類，其中度值排名前5位的有效成分為豆甾醇、槲皮素、山柰酚、異谷葵堿和β-谷甾醇。運(yùn)用Cytoscape 3.7.1軟件對活性成分進(jìn)一步分析，度值≥26的21個有效成分見表1。

2.3? PPI網(wǎng)絡(luò)

為研究各靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，將65個交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析。結(jié)果顯示52個靶點(diǎn)發(fā)生較強(qiáng)的相互作用，共產(chǎn)生148條相互作用連線，見圖3。

2.4? 關(guān)鍵靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

PPI網(wǎng)絡(luò)DC平均值為4.5，BC平均值為0.007，CC平均值為0.405，選取BC、CC、DC均大于平均值的靶點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)，共有關(guān)鍵靶點(diǎn)19個，關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)見圖4。主要包括JUN（轉(zhuǎn)錄因子AP-1）、TP53（腫瘤蛋白p53）、MAPK1（絲裂原活化蛋白激酶1）、TNF（腫瘤壞死因子）、MAPK14（絲裂原活化蛋白激酶14）、ESR1（雌激素受體1）、EGFR（表皮生長因子受體）等。

2.5? GO功能富集分析

對65個交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，包括分子功能（MF）、生物過程（BP）及細(xì)胞組分（CC）。共獲得1668條GO功能富集條目（P<0.05），其中BP條目最多，共有1527個，主要集中在細(xì)胞對化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to chemical stress）、對活性氧的反應(yīng)（response to reactive oxygen species）、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)（response to oxidative stress）和細(xì)胞對氧化應(yīng)激的反應(yīng)（cellular response to oxidative stress）。MF相關(guān)條目有102個，主要涉及血紅素結(jié)合（heme binding）、四吡咯結(jié)合（tetrapyrrole binding）和蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）。CC相關(guān)條目有39個，主要涉及囊泡腔（vesicle lumen）、細(xì)胞膜筏（membrane raft）和細(xì)胞膜微區(qū)（membrane microdomain）等。見圖5～圖7。

2.6? KEGG通路富集分析

對65個交集靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，共獲得134條通路（P<0.05）。主要涉及流體剪切應(yīng)力和動脈粥樣硬化（fluid shear stress and atherosclerosis）、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、前列腺癌（prostate cancer）等通路。見圖8。

2.7? 分子對接結(jié)果

知柏地黃湯主要有效成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對接結(jié)果見表2，具體示意圖見圖9。結(jié)果表明，豆甾醇、槲皮素、山柰酚、異谷葵堿和β-谷甾醇與關(guān)鍵靶點(diǎn)TP53、ESR1、JUN具有較好的結(jié)合性。

3? 討論

本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對知柏地黃湯治療前列腺癌的作用機(jī)制進(jìn)行初步研究，系統(tǒng)揭示了知柏地黃湯治療前列腺癌的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制。其中豆甾醇、槲皮素、山柰酚和β-谷甾醇在網(wǎng)絡(luò)中的度值較大，可能是治療前列腺癌的主要有效成分。研究發(fā)現(xiàn)，上述成分可抑制多種癌細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，如肝癌細(xì)胞^[8-9]、胃癌細(xì)胞^[10-11]、前列腺癌細(xì)胞^[12]、結(jié)腸癌細(xì)胞^[13]、肺癌細(xì)胞^[14]、膠質(zhì)瘤細(xì)胞^[15]及乳腺癌細(xì)胞^[16]等。

對知柏地黃湯與前列腺癌的交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI映射，并構(gòu)建關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)，關(guān)鍵靶點(diǎn)主要有JUN、TP53、MAPK1、TNF等，可能是知柏地黃湯治療前列腺癌的潛在靶點(diǎn)。TP53基因位于人類第17號染色體上，研究表明，超過50%的腫瘤患者存在TP53基因突變，腫瘤相關(guān)的突變型p53蛋白不僅失去抑制腫瘤的功能，并且在腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移、耐藥性等方面發(fā)揮重要作用^[17]。張帥等^[18]研究發(fā)現(xiàn)，TP53高表達(dá)可能預(yù)示著原發(fā)性胃間質(zhì)瘤患者術(shù)后具有更高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。費(fèi)喜佳^[19]實(shí)驗(yàn)表明，β-谷甾醇可調(diào)節(jié)TP53基因，加速腫瘤細(xì)胞凋亡。卞春安等^[20]分析了120例肺腺癌患者術(shù)后病理資料，并運(yùn)用免疫組化法檢測患者組織標(biāo)本中突變型p53蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，TP53基因突變的肺腺癌患者預(yù)后較差，突變型p53蛋白可以作為預(yù)測患者預(yù)后的分子標(biāo)志物。MAPK是細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，能將細(xì)胞外刺激信號傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞核內(nèi)，并引起細(xì)胞生物學(xué)行為，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和凋亡的功能^[21]。MAPK通路的異常活化會導(dǎo)致細(xì)胞喪失分化和凋亡能力，引起細(xì)胞異常增殖、惡性轉(zhuǎn)化，在腫瘤耐藥的機(jī)制中發(fā)揮重要作用^[22-23]。車煥莉^[24]研究表明，疏肝益腎方能下調(diào)人表皮生長因子受體2基因表達(dá)，抑制MAPK通路，起到逆轉(zhuǎn)乳腺癌細(xì)胞耐藥的作用。小檗堿可通過調(diào)節(jié)活性氧相關(guān)信號通路JNK/p38 MAPK、蛋白激酶C和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）等，激活內(nèi)源性線粒體凋亡通路，發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用^[25]。李倩等^[26]研究表明，紅景天苷可延緩人肺癌A549細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長速度，破壞腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制MAPK/ERK1/2信號通路有關(guān)。在本研究中，知柏地黃湯可能通過MAPK的3種亞型MAPK1、MAPK8和MAPK14發(fā)揮抑制前列腺癌的作用。

現(xiàn)有研究顯示，在許多實(shí)體腫瘤中存在EGFR的高表達(dá)或異常表達(dá)^[27]，在結(jié)腸癌中EGFR的高表達(dá)影響結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，EGFR可作為腫瘤早期診斷和預(yù)后的重要指標(biāo)^[28-29]。蔣寒冰等^[30]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩素可通過抑制癌癥相關(guān)的EGFR-STAT信號通路，靶向作用于TGF-β₁，逆轉(zhuǎn)胃癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。JUN在多種癌癥中差異表達(dá)且具有較強(qiáng)活性，在乳腺癌中活化的JUN可影響腫瘤血管的生長，促進(jìn)乳腺癌的轉(zhuǎn)移^[31];在膀胱癌患者中，JUN低表達(dá)患者的預(yù)后遠(yuǎn)優(yōu)于高表達(dá)患者^[32]。雌激素受體主要有2個亞型，分別為雌激素受體α（ESR-α/ESR1）和雌激素受體β（ESR-β/ESR2）。研究發(fā)現(xiàn)ESR1與山柰酚相結(jié)合具有很好的抗腫瘤作用^[33]。TNF是腫瘤微環(huán)境中最重要的炎性細(xì)胞因子之一，其中以TNF-α最具代表性，主要介導(dǎo)炎癥反應(yīng)。β-谷甾醇可抑制TNF-α的生成，減輕炎癥反應(yīng)，改善腫瘤微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡^[34]。

綜上所述，知柏地黃湯可能通過作用于JUN、TP53、MAPK1等靶點(diǎn)發(fā)揮治療前列腺癌的作用。本研究尚存在不足之處，檢索的數(shù)據(jù)庫不能完全包括知柏地黃湯所有的化學(xué)成分及其相應(yīng)的靶點(diǎn)，計(jì)算化學(xué)生物學(xué)方法本身也具有一定的局限性，且預(yù)測結(jié)果還有待后期的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

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（收稿日期：2021-04-12）

（修回日期：2021-05-08;編輯：鄭宏）