新冠病毒蛋白及其細(xì)胞受體ACE2翻譯后修飾的質(zhì)譜分析

鐘 力，朱 林，蔡宗葦

(環(huán)境與生物分析國家重點實驗室(香港浸會大學(xué))，香港特別行政區(qū) 999077)

2019年底，我國武漢市爆發(fā)了一種未知的嚴(yán)重急性呼吸道疾病。引發(fā)疾病的病原體很快被中國科學(xué)家分離、測序，并鑒定為一種新型冠狀病毒。該冠狀病毒是一種有包膜的正單鏈RNA病毒，含有29 903個堿基[1-4]。由于該病毒與嚴(yán)重急性呼吸道綜合征冠狀病毒(SARS-CoV)在核苷酸水平上具有高達(dá)79%的同源性，世界衛(wèi)生組織(WHO)將此病毒和引發(fā)的流行病分別命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2(SARS-CoV-2，以下簡稱“新冠病毒”)及2019冠狀病毒病(COVID-19，以下簡稱“新冠肺炎”)，并在2020年3月11日宣布疫情進(jìn)入“全球大流行”階段，并延續(xù)至今[4-7]。COVID-19是人類歷史上第一次全球性的冠狀病毒大流行，在世界范圍內(nèi)造成了不可估量的損失，截至2021年6月14日，已導(dǎo)致超過 1.76億的感染病例和381萬人死亡[8]。

SARS-CoV-2屬于冠狀病毒科β型冠狀病毒屬，是已知的第7種可感染人類的冠狀病毒。新冠病毒主要的傳播途徑是飛沫傳播，但也有其他傳播途徑和系統(tǒng)傷害的報道[9-11]。與 SARS-CoV和中東呼吸綜合征(MERS)冠狀病毒類似，新冠病毒通過與宿主細(xì)胞中的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(ACE2)結(jié)合，可感染多個器官、大量復(fù)制并影響其正常功能[12-14]。該病毒可引起咳嗽、氣喘、呼吸困難等癥狀，此外也有發(fā)熱、腹瀉、頭痛、嗅覺和味覺喪失等癥狀的報道[5,15-16]。一些無癥狀新冠病毒攜帶者在觀察14天后仍攜帶大量的病毒并且保有傳染性[17-18]。此外，隨著免疫逃逸病毒株(如近日出現(xiàn)并席卷全球的Delta病毒株)的出現(xiàn)，COVID-19 可能會像季節(jié)性流感一樣成為人類的常見健康威脅，或在局部地區(qū)形成新的風(fēng)土病[19-21]。因此，加深對新冠病毒的理解，尤其是探尋可表征其臨床結(jié)果的生物標(biāo)志物或感染的特征分子指紋具有重要的意義[22-24]。

生物標(biāo)志物是反映特定生物或疾病狀態(tài)相關(guān)的生物分子[25]。病毒會影響宿主的蛋白質(zhì)組，病毒和宿主之間的蛋白質(zhì)相互作用是病毒適應(yīng)宿主過程的決定性因素[26-28]。更重要的是，免疫反應(yīng)蛋白的豐度和修飾狀態(tài)可直接反映宿主的免疫狀態(tài)[29-30]。蛋白質(zhì)在生物的病理和免疫過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，已有報道指出在寨卡病毒(Zika)、埃博拉病毒(Ebola)、H1N1病毒中發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物[31-33]。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾(PTMs)是蛋白合成后在其氨基酸殘基上由酶誘導(dǎo)形成的可逆共價修飾，是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)位置、結(jié)合親和力和活性的關(guān)鍵步驟之一[34]。作為寄生者，病毒完全依賴宿主細(xì)胞的新陳代謝機(jī)制實現(xiàn)自身復(fù)制。因此，這些源自宿主信號傳遞及調(diào)控通路所產(chǎn)生的翻譯后修飾經(jīng)常被病毒劫為己用，以達(dá)到其最高復(fù)制效率。糖基化作為最常見也是最重要的一種翻譯后修飾種類，在病毒的生命周期中起著不可替代的作用，包括調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)折疊、干預(yù)受體結(jié)合、影響蛋白質(zhì)降解率、調(diào)控宿主偏好和屏蔽免疫系統(tǒng)識別的免疫原性表位等[35]。病毒引起的疾病同樣會顯著影響宿主的蛋白質(zhì)糖基化狀態(tài)，影響糖的豐度和種類，增加或減少其表達(dá)，甚至使糖結(jié)構(gòu)缺失[36-37]。蛋白質(zhì)糖基化的水平和種類與細(xì)胞微環(huán)境中的化學(xué)狀態(tài)密切相關(guān)，而細(xì)胞微環(huán)境可能因疾病而變化，因此長期以來糖基化水平、位點和修飾的糖種類也是疾病生物標(biāo)志物的主要來源之一[38]。蛋白質(zhì)的磷酸化同樣深刻影響蛋白質(zhì)的活性和功能。磷酸化和去磷酸化由蛋白激酶和蛋白磷酸酶催化完成，可以增強(qiáng)或減弱蛋白質(zhì)活性、穩(wěn)定或降解蛋白質(zhì)、啟動或停止蛋白之間的相互作用，乃至促進(jìn)或抑制蛋白質(zhì)在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間的遷移[39]。病毒通過靶向特定的蛋白激酶和磷酸酶導(dǎo)致的磷酸化異常是許多人類疾病的起因或結(jié)果，這使磷酸化蛋白成為一種不可忽視的生物標(biāo)志來源[40-41]。

據(jù)報道，約20%的新冠肺炎患者會發(fā)展為需要臨床監(jiān)護(hù)的重癥，乃至死亡[42]。雖然已知年齡、性別、既有長期疾病和亞健康的生活方式是影響疾病嚴(yán)重程度的重要因素，但尚不能直接用來評估病人的預(yù)后[43]?；趯π鹿诎l(fā)病機(jī)制和臨床特征的廣泛研究，其臨床表現(xiàn)已經(jīng)被確信與宿主的免疫反應(yīng)密切相關(guān)[44-47]。病毒感染從本質(zhì)上指的是作為病原體的病毒侵入宿主細(xì)胞后，適應(yīng)了宿主細(xì)胞的代謝環(huán)境，并操控細(xì)胞的代謝來繁殖、入侵其他宿主細(xì)胞。因此，了解病毒利用宿主代謝的致病作用，是未來阻止病毒流行和擊敗病毒的基礎(chǔ)[48-49]。通過對新冠肺炎患者的蛋白質(zhì)以及代謝組狀況進(jìn)行全面和詳細(xì)的分析，深入發(fā)掘關(guān)于宿主對病毒感染的免疫反應(yīng)知識，進(jìn)而闡明代謝狀況與臨床表現(xiàn)的潛在聯(lián)系[50]。另一方面，基于質(zhì)譜的組學(xué)方法，特別是基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)被廣泛用于探索宿主對病原體的反應(yīng)，包括感染、入侵、復(fù)制和發(fā)病機(jī)制，并能初步指導(dǎo)診斷，防止疾病發(fā)展為重癥[51-52]?；谫|(zhì)譜的蛋白組學(xué)的獨特優(yōu)勢在于，它以高通量、非偏倚的方式描繪了患者的蛋白質(zhì)特征圖譜[53]。通過縱向及橫向比較新冠肺炎患者的分子圖譜，諸多研究應(yīng)用基于質(zhì)譜的蛋白組學(xué)來探索新冠病毒的相關(guān)生物標(biāo)志物[22-23,54-57]。本文將側(cè)重于新冠病毒蛋白及其細(xì)胞受體的翻譯后修飾的研究進(jìn)展，尤其是糖蛋白質(zhì)組學(xué)及磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，以及這些 PTMs在尋找新冠肺炎臨床生物標(biāo)志物方面的潛在用途，并分析基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)在尋找生物標(biāo)志物過程中的挑戰(zhàn)。

1 基于質(zhì)譜技術(shù)的糖蛋白組學(xué)

糖蛋白組學(xué)(glycoproteomics)在細(xì)菌和病毒的鑒定以及免疫學(xué)和藥物方面具有重要意義，是探尋生物標(biāo)志物的一個新興前沿領(lǐng)域。病毒通過與宿主細(xì)胞表面的碳水化合物相互作用實現(xiàn)入侵，新冠病毒也不例外：糖基化蛋白參與了病毒的入侵、病毒細(xì)胞受體蛋白的水解、以及宿主免疫系統(tǒng)對病毒的識別和中和[58-60]。目前，已有許多關(guān)于糖基化的刺突蛋白(spike protein)及其在新冠感染機(jī)制的糖蛋白組學(xué)的研究報道[61-65]。根據(jù)以往對 SARS-CoV和MERS-CoV的糖蛋白組學(xué)研究，糖蛋白在SARS-CoV-2表面的修飾值得深入研究[66-67]。為剖析新冠肺炎患者血漿中蛋白質(zhì)的糖基化狀態(tài)，需要進(jìn)行的分析流程包括富集、消化、質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)采集。糖蛋白的特異性富集能降低非糖肽的干擾，提高低豐度糖肽的檢測效果，富集方法包括凝集素親和技術(shù)、肼化學(xué)富集法、親水色譜法、β-消除米氏加成反應(yīng)等[68-71]。除了富集技術(shù)，糖基化修飾研究的另一個重要部分是蛋白鑒定/糖基化位點確定方法，需要將糖鏈消化分離，并分別解析糖鏈與修飾位點，應(yīng)用最多的釋放方法是酶法和化學(xué)法。與肽骨架的連接不同，單糖和糖胺聚糖(GAGs)的N-糖基化(N-linked glycosylation)和O-糖基化(O-linked glycosylation)需要選擇相應(yīng)的釋放方法。例如，對于具有共同結(jié)構(gòu)(即Man3GlcNAc2，其中Man為甘露糖，GlcNAc為N-乙酰葡糖胺)的N-聚糖，使用PNGase F酶可以分割天冬酰胺和N-聚糖的核心GlcNAc之間的鍵[72]?；瘜W(xué)法，如肼解法和高碘酸氧化-β消除法也可以用來釋放N-聚糖，但效果不如酶解法[73-74]。由于Ser/Thr連接的聚糖的多樣性，沒有酶能實現(xiàn)O-聚糖的完全釋放。因此，一般傾向使用化學(xué)方法，但由此帶來的問題是難以完整的分析具體修飾的糖結(jié)構(gòu)及組分[75]。

質(zhì)譜已成為分析糖和糖肽的主要工具。與其他手段(如核磁共振、外糖苷酶處理或凝集素分析)相比，質(zhì)譜分析可以獲得大量的結(jié)構(gòu)信息，不僅可以檢測糖類成分，二級或多級質(zhì)譜還可以闡釋位置和連接異構(gòu)體[76-77]?；|(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)和電噴霧電離(ESI)是主要的電離方法，LC-ESI-MS具有高靈敏度、低離子抑制的特點，可用于位置和連接異構(gòu)體的解析[78-79]。此外，為了使多糖池的理化性質(zhì)均勻化，從而減少離子抑制，常對糖類進(jìn)行衍生，如穩(wěn)定同位素過甲基化[80]。用 MALDI進(jìn)行糖蛋白組學(xué)分析，具有樣品制備簡單、自動化程度高、數(shù)據(jù)采集快、能觀察到單一離子等優(yōu)點[81]。而且MALDI與甲基化等衍生技術(shù)相結(jié)合，可以避免電離過程中酸性基團(tuán)的損失，使其成為定性分析中最常用的方法。糖類和糖肽的詳細(xì)分析方法已經(jīng)有了很好的回顧和總結(jié)，特別是在 SARS-CoV-2中的應(yīng)用[82]。

體液是尋找疾病生物標(biāo)志物最具潛力的途徑，因為它們與各種組織直接相關(guān)，在這些組織中發(fā)現(xiàn)有蛋白質(zhì)的分泌或釋放[83]。早在2006年，Mann等[84-86]已經(jīng)利用高精度、高分辨質(zhì)譜對各種體液進(jìn)行大規(guī)模分析，構(gòu)建了第一張源于人類的體液蛋白圖。2014年，Kim等[87]利用高分辨傅里葉變換質(zhì)譜對體液(包括血清、唾液、尿液等)進(jìn)行了2次大規(guī)模的人類蛋白質(zhì)組圖譜研究。在各種體液中，血漿廣泛用于生物標(biāo)志物分析，主要因為其在一定程度上影響了其他體液，而且可以通過簡單、非侵入性的方法獲得[88-89]。血漿成分極其復(fù)雜，血漿蛋白的動態(tài)范圍是所有體液中最高的，大概超過10個數(shù)量級，因此，在質(zhì)譜分析前需要去除高豐度的蛋白質(zhì)以減少背景的復(fù)雜性[89]。常用的去除血漿中高豐度蛋白的方法有抗體親和法和分餾法，有時還需要特定方法以分離并富集目標(biāo)蛋白[90]。

病毒包膜蛋白的糖基化是病毒掩蓋相關(guān)蛋白表位的主要方式[91]。病原體利用糖基化來逃避宿主免疫系統(tǒng)的識別，并可能干擾宿主的適應(yīng)性免疫，甚至增強(qiáng)病毒的傳染性[92-93]。包括HIV、H1N1、SARS和寨卡病毒在內(nèi)的幾種致病病毒，都是利用宿主的糖基化，在病毒體表面構(gòu)建其糖蛋白，如N-糖基化和O-糖基化，以感染其目標(biāo)宿主細(xì)胞[91]。與其他冠狀病毒類似，SARS-CoV-2中糖基化的不同類型不僅影響單個糖的組成，而且影響整個病毒蛋白表面的免疫壓力，從而暴露出表面密集碳水化合物層中的脆弱區(qū)域[58,66]。病毒包膜的糖蛋白不僅與免疫有關(guān)，還具有與受體結(jié)合的作用。糖蛋白的這種作用不僅解釋了一些冠狀病毒的跨物種傳播機(jī)制，而且還為病毒溯源提供了線索。據(jù)Hulswit等[94]報道，β1-冠狀病毒上的糖基化9-O-Ac-Sia特異性受體結(jié)合點能夠與受體的糖蛋白結(jié)合。Qing等[95]報道了冠狀病毒的2個受體結(jié)合位點，S1A會與宿主的唾液酸結(jié)合，S1B會識別宿主的跨膜蛋白，從而有可能引發(fā)從人畜共患到人與人之間的感染。對新冠刺突蛋白的糖基化分析可以揭示其來源及中間宿主的信息，并作為潛在的預(yù)測病毒傳播能力及毒性的生物標(biāo)志物。然而，由于糖基化的豐度相對較低，以及富集和分析糖肽存在的技術(shù)挑戰(zhàn)，目前在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)方面仍處于早期階段。

2 新冠病毒刺突蛋白的糖蛋白組學(xué)特征

SARS-CoV-2通過高度糖基化的刺突蛋白進(jìn)行細(xì)胞入侵[61-65]。作為一個三聚體的Ⅰ類融合體，刺突蛋白由2個亞單位S1和S2組成，它們由宿主的蛋白酶裂解產(chǎn)生[61,63]。S1含有受體結(jié)合域(RBD)，對受體識別具有決定性作用；S2負(fù)責(zé)膜融合，對細(xì)胞粘附和免疫保護(hù)至關(guān)重要[96]。當(dāng)S1與宿主細(xì)胞的ACE2受體結(jié)合時，S1將從刺突蛋白上脫落，使病毒能夠利用S2與宿主細(xì)胞膜融合[61,97]。有報道認(rèn)為，新冠病毒的刺突蛋白是中和抗體的一個主要目標(biāo)[67]。因此，冠狀病毒的刺突蛋白的糖基化是否能使病毒蛋白表位充分暴露，或在免疫規(guī)避中起基本作用，仍是一個關(guān)鍵問題。

以 COVID-19、spike protein和glycosylation為關(guān)鍵詞，在Web of Science搜索相關(guān)報道，關(guān)于刺突蛋白的N-糖基化情況報道列于表1。新的實驗證據(jù)以及生物信息學(xué)分析均指出，刺突蛋白被高度糖基化修飾。根據(jù)序列特征，刺突蛋白至少有22個潛在N-糖基化位點(因此每個三聚體有66個N-糖基化位點)[105-108]。在刺突蛋白的N端域(NTD)有8個位點(17、61、74、122、149、165、234、282)，在受體識別域(RBD)有2個位點(331和343)，在連接域(CD)有2個位點(1 098和1 134)，其他位點則在已知功能域之外[102]，示于圖1a。由于O-糖基化修飾的種類繁多、糖鏈結(jié)構(gòu)復(fù)雜等特點，關(guān)于刺突蛋白的O-糖基化狀況尚不能詳盡所有的可能性[105-108]。Andersen等[105]通過氨基酸序列預(yù)測至少有3個O-糖基化位點位于S1亞單位內(nèi)：Ser673、Thr678和Ser686[105,108]。值得注意的是，Shajahan等[109]在RBD的Thr323處發(fā)現(xiàn)了一個預(yù)期之外的O-糖基化位點，另一個則是Ser525，這2個位于受體識別域的O-糖基化位點很可能在病毒-受體的結(jié)合中起到關(guān)鍵作用。Sanda等[108]率先在刺突糖蛋白的furin裂解位點(即S1和S2亞單位的連接位)附近發(fā)現(xiàn)了另外8個O-糖肽。這些O-糖基化位點被認(rèn)為可以保護(hù)刺突蛋白表位或關(guān)鍵殘基免受免疫系統(tǒng)攻擊，對病毒的免疫逃逸有重要影響[105,109-110]。所有的糖基化是否都會同時且持久存在，抑或會受到宿主環(huán)境或其他因素的影響而變化，仍然是一個有待探索且意義重大的問題。

表1 新冠病毒刺突蛋白N-糖基化修飾的部分報道Table 1 Partial reports of N-glycosylation of SARS-CoV-2 spike protein

注：a.SARS-CoV-2刺突蛋白的翻譯后修飾位點；b.常見的N-和O-糖基化類型；c.人類血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(hACE2)的翻譯后修飾位點；圖a與圖c的刺突蛋白和hACE2示意圖上的不同色塊表示蛋白結(jié)構(gòu)域；不同顏色文字標(biāo)記了不同種類的翻譯后修飾和對應(yīng)位點，黑色表示糖基化，橙色表示磷酸化，紫色表示甲基化，粉色表示羥基脯氨酸位點圖1 SARS-CoV-2刺突蛋白和人類血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ(hACE2)的翻譯后修飾位點以及常見的N-和O-糖基化類型Fig.1 Sites of post-translational modifications of SARS-CoV-2 spike protein and human angiotensin-converting enzyme Ⅱ (hACE2) and common N- and O-glycosylation types

發(fā)生在糖基化位點上的糖類組成與變化是理解病毒與宿主相互作用的另一個關(guān)鍵問題。利用基于質(zhì)譜的糖蛋白組學(xué)，發(fā)現(xiàn)刺突蛋白上的糖主要是高甘露糖、混合糖和復(fù)合糖，示于圖1b[106-109,111]。具體來說，8個N-糖基化位點主要是高甘露糖型，其他位點主要是復(fù)合糖[102,109]。刺突蛋白上2個重要的高甘露糖型位點(含有80%以上的高甘露糖)是N234和N709[102]。除了N234有Man9GlcNAc2外，刺突蛋白上其他7個位點的主要高甘露糖型糖結(jié)構(gòu)是Man5GlcNAc2，使這些位點容易成為α-1,2-甘露糖苷酶的底物，但不能與GlcNAcT-Ⅰ反應(yīng)，因此，不能被加工成混合型和復(fù)合型糖類[102]。此外，當(dāng)S1和S2分別表達(dá)時，其糖的組成和各自位點的占有率可能不同[109]。哪些因素導(dǎo)致了這種分歧，以及它們將如何影響分子功能，值得探究。

SARS-CoV-2刺突蛋白的糖基化異質(zhì)性已有報道，從不同的宿主細(xì)胞中分離出的刺突蛋白呈現(xiàn)出不同的N-聚糖的種類和數(shù)量[102,107,109]。Zhang等[107]預(yù)測，新冠病毒上刺突蛋白的原生N-糖基化處理產(chǎn)生的成熟糖應(yīng)該與人類細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白相同，人類細(xì)胞表達(dá)的刺突蛋白主要是復(fù)合型糖基化，而昆蟲上則以高甘露糖為主。Miller等[106]通過電荷檢測質(zhì)譜法評估了刺突蛋白質(zhì)上N-聚糖位點的糖基化異質(zhì)性，確定了高度異質(zhì)性蛋白質(zhì)的質(zhì)量分布，指出“自下而上”的糖蛋白組學(xué)可能低估了較大、較復(fù)雜的糖豐度。同時他們提出，刺突蛋白糖基化的異質(zhì)性可能會強(qiáng)化其三聚體結(jié)構(gòu)，從而有迷惑宿主免疫系統(tǒng)的作用。Shajahan等[109]使用高分辨質(zhì)譜法對刺突蛋白的N-和O-糖基化進(jìn)行定量分析，并同時應(yīng)用生物信息學(xué)工具和詳盡的人工分析來研究所得到的數(shù)據(jù)，以證實 SARS-CoV-2的糖基化復(fù)雜性。此外，一些研究表明，刺突蛋白上的糖基化位點在全球快速傳播過程中是相對保守的[110,112]。這種保守性表明，其在病毒的生命周期和宿主的適應(yīng)中具有關(guān)鍵功能。刺突蛋白與ACE2受體的結(jié)合主要是由于RBD與ACE2的結(jié)構(gòu)域之間極性殘基的相互作用[13, 62,112]。三聚體、復(fù)雜糖基化的刺突蛋白在與受體結(jié)合方面比單體、不成熟的糖基化變體具有更強(qiáng)的親和力[113]。刺突蛋白上的RBD發(fā)生的鉸鏈?zhǔn)絼討B(tài)運動，加強(qiáng)了RBD 對ACE2的親和力，使新冠病毒與受體的結(jié)合親和力比SARS提高了10～20倍，這部分解釋了病毒的高傳播性[61-62,114]。相反，如果在低聚糖階段阻斷了N-聚糖或O-聚糖的生物合成或成熟，將促使刺突蛋白的分解，從而降低病毒與ACE2結(jié)合的可能性[115]。

3 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ的糖蛋白組學(xué)特征

ACE2是一種Ⅰ型膜蛋白，在人類或動物的肺部、心臟、腎臟和腸道中廣泛表達(dá)[116-118]。ACE2由1個N端的肽酶區(qū)(peptidase domain)和1個C端的Collectrin樣結(jié)構(gòu)域(collectrin-like domain)組成[118-119]。ACE2主要通過將血管緊張素Ang Ⅰ和Ang Ⅱ分別轉(zhuǎn)化為Ang 1-9和Ang 1-7來發(fā)揮腎素-血管緊張素系統(tǒng)的主調(diào)控功能[120-121]。ACE2具有多重作用，包括作為多種底物的催化劑、SARS病毒和SARS-CoV-2的功能受體、以及氨基酸的轉(zhuǎn)運蛋白[121-125]。

作為新冠病毒的受體，ACE2為免疫、炎癥和心血管疾病之間提供了一個關(guān)鍵聯(lián)系。Shajahan等[126]利用質(zhì)譜技術(shù)對人類ACE2的N-和O-聚糖表征進(jìn)行鑒定，指出7個潛在的N-糖基化位點(53、90、103、322、432、546 和 690)和1個意料之外的O-糖基化位點Thr730，示于圖1c。在所有的N-糖基化位點中，復(fù)合型、雙天線型糖比高甘露糖和混合型糖更豐富，而Thr730上97%被Core-1粘蛋白類型占據(jù)。Mehdipour和Hummer[127]利用原子分子動力學(xué)模擬，發(fā)現(xiàn)ACE2受體的糖基化對病毒的結(jié)合有很大貢獻(xiàn)。有趣的是，2個糖基化位點N90和N322的糖對刺突蛋白的結(jié)合有相反的影響。N90位點的聚糖部分覆蓋了刺突體RBD的結(jié)合界面，可以干擾刺突蛋白和ACE2的結(jié)合，保護(hù)病毒與細(xì)胞的對接。與之相反，N322位點的聚糖加強(qiáng)了RDB和ACE2的結(jié)合作用。值得注意的是，N322聚糖與刺突蛋白的一個保守區(qū)域結(jié)合，該區(qū)域先前被確定為中和抗體的一個隱性位點。

雖然ACE2在SARS-CoV-2入侵細(xì)胞的過程中擔(dān)當(dāng)受體的關(guān)鍵作用，但在尋求抗病毒的療法上，抑制ACE2的表達(dá)和活性會引起腎素-血管緊張素系統(tǒng)失衡，從而導(dǎo)致高血壓、心血管受損和臟器損傷等嚴(yán)重后果[128]。因此，干預(yù)ACE2的糖蛋白修飾是在不影響ACE2表達(dá)的前提下一種更有效的抗病毒方案。

4 新冠病毒蛋白的磷酸化組學(xué)分析

蛋白質(zhì)的磷酸化對蛋白質(zhì)的功能具有重要影響，可以改變細(xì)胞的信號傳導(dǎo)、發(fā)育和分化以及周期控制和代謝[129]。磷酸化的作用類似一個開關(guān)，以可逆的方式“打開”或“關(guān)閉”一個蛋白質(zhì)的活性或者一個細(xì)胞的通路[130]。據(jù)估計，真核細(xì)胞中約有1/3的蛋白質(zhì)在其生命周期的某個階段被磷酸化[131]。負(fù)責(zé)磷酸化和去磷酸化的是蛋白激酶和蛋白磷酸酶，其基因編碼占人類基因組的2%[132-133]。但僅從基因序列來預(yù)測蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是不準(zhǔn)確的，對磷酸化位點的實驗測定仍是最可靠和重要的技術(shù)。盡管多年來已建立和發(fā)展了各種確定蛋白質(zhì)磷酸化位點的方法，但這項技術(shù)仍然面臨諸多挑戰(zhàn)[134]。由于磷酸化蛋白低豐度、高復(fù)雜性和高動態(tài)范圍的性質(zhì)，在進(jìn)行質(zhì)譜分析前，需要對磷酸化的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸殘基的肽段進(jìn)行富集。從細(xì)胞總肽段肽的復(fù)雜樣品中富集磷酸化肽最流行的策略是，先對磷肽進(jìn)行分餾，再利用固相金屬離子親和色譜(IMAC)或金屬氧化物親和色譜(MOAC)進(jìn)行二次磷肽富集[135-139]。常見的分餾方法包括強(qiáng)陽離子交換色譜法(SCX)和高pH反相色譜法(HPRP)等[140-141]。IMAC富集磷肽的原理是利用螯合在磁珠或硅顆粒上過渡態(tài)金屬陽離子(如Fe3+、Ga3+、Zr4+、Ti4+等)的親和作用去除樣品中的非磷酸化肽，從而保留磷肽[138,142-143]；而MOAC則利用氧化金屬(如TiOx和Fe3O4)可以與磷酸根基團(tuán)中的氧結(jié)合的特性，實現(xiàn)磷肽富集[144-145]。但 IMAC 和 MOAC 都對樣品pH值有嚴(yán)格要求，經(jīng)過富集的樣品需要脫鹽處理，操作較繁瑣[146]。近年來，由Matthias等[135]開發(fā)的EasyPhos技術(shù)克服了這些缺陷。EasyPhos技術(shù)優(yōu)化了蛋白質(zhì)酶解、簡化了磷肽脫鹽和分餾步驟，是快速且高通量的磷肽富集法。質(zhì)譜具有高靈敏度、高通量和快速掃描的優(yōu)點，大多數(shù)磷酸化蛋白質(zhì)的分析和位點研究采用串聯(lián)質(zhì)譜(MS/MS)進(jìn)行檢測[147-150]。尤其Orbitrap在磷酸化蛋白質(zhì)分析的應(yīng)用，能通過快速掃描顯著提高數(shù)據(jù)的覆蓋度和樣品的檢測效率[151]。

SARS-CoV-2膜蛋白和宿主細(xì)胞進(jìn)入因子的磷酸化是新冠肺炎相關(guān)研究的熱點。Davidson等[152]利用串聯(lián)質(zhì)譜法在病毒感染的細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了500多個病毒肽和44個磷肽，幾乎涵蓋了預(yù)測由SARS-CoV-2基因組編碼的所有蛋白質(zhì)。在分析病毒蛋白的磷酸化狀態(tài)時，使用凝膠內(nèi)胰蛋白酶消化和基于TiO2與Fe-NTA的磷肽富集，在LC-MS/MS的DDA 模式下檢測到這些磷肽分布于N、M、ORF 3a、nsp3、nsp9、nsp12和刺突蛋白上。尤其在刺突蛋白上檢測到的磷酸化位點是以往研究中從未發(fā)現(xiàn)的，揭示了磷酸化對三聚體組裝的潛在影響，在基于該蛋白的疫苗開發(fā)上具有重要意義。Bouhaddou等[55]分析了SARS-CoV-2感染Vero E6細(xì)胞期間，蛋白質(zhì)豐度和磷酸化的擾動情況。利用IGEPAL裂解和FeCl3富集磷酸蛋白的方法，再通過LC-MS/MS在DDA和DIA兩種模式下的分析，確定了SARS-CoV-2病毒的nsp3、nsp14、ORF9b、M和N上分布的25個磷酸化位點，與Davidson等[147]的報道相互佐證。Bouhaddou等[55]揭示了宿主和病毒蛋白上磷酸化的重構(gòu)，激活了酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)和 p38 MAPK，使各種細(xì)胞因子的產(chǎn)生關(guān)閉了有絲分裂激酶導(dǎo)致的細(xì)胞周期停滯。通過對全局磷酸化圖譜與失調(diào)的激酶和途徑進(jìn)行映射，確定了87種藥物和化合物在COVID-19治療上的可行性。Klann等[57]報道了感染 SARS-CoV-2 病毒后宿主細(xì)胞的全局、差異化的磷酸化分析。蛋白裂解液通過Fe-NTA富集和TMT同位素標(biāo)記，經(jīng)過LC-MS/MS分析發(fā)現(xiàn)，33個磷酸化位點分布于pp1ab、nsp6、ORF3a、ORF9b、M和N蛋白。然而，這些位點的功能意義需要相當(dāng)長的時間通過點突變和/或生化技術(shù)來獨立驗證和研究。這些位點的磷酸化水平也需要更多的研究加以闡明。一個合理的猜測是，新冠病毒蛋白的磷酸化事件在新冠病毒生命周期的某一個特定步驟起到了關(guān)鍵作用，是新冠病毒劫持宿主信號通路調(diào)控機(jī)制的一個表現(xiàn)，同時也會是潛在的抗病毒藥物的靶點。通過對這些磷酸化的分析，可以深入理解新冠病毒的宿主適應(yīng)過程，啟發(fā)抗新冠乃至廣譜抗冠狀病毒藥物的開發(fā)。

除此以外，通過分析宿主磷酸化水平的變化，也可以推測出新冠入侵所依賴的關(guān)鍵蛋白激酶。Liu等[56]應(yīng)用透射電子顯微鏡從時間維度上考察了SARS-CoV-2進(jìn)入宿主細(xì)胞前30 min的圖像，發(fā)現(xiàn)5 min和15 min分別是病毒附著及開始膜融合的關(guān)鍵時間節(jié)點。通過定量磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析手段，并輔以自制的蛋白激酶活性預(yù)測流程，鑒定了這2個關(guān)鍵時間點上共同被調(diào)控活性的蛋白激酶，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn) PKC 激酶的β亞族，而非α或ε亞族，對病毒入侵起到了關(guān)鍵作用。Klann等[57]確定了病毒蛋白的磷酸化，并定義了感染后磷酸化驅(qū)動的宿主細(xì)胞信號傳導(dǎo)變化，發(fā)現(xiàn)對生長因子受體下游信號的抑制可以防止新冠病毒在細(xì)胞中的復(fù)制。Yang等[40]研究了被新冠病毒感染的單核細(xì)胞衍生的樹突狀細(xì)胞的宿主反應(yīng)，指出樹突細(xì)胞對病毒的免疫反應(yīng)減弱與病毒對STAT1磷酸化的拮抗作用有關(guān)。這些研究解釋了新冠病毒的傳播特征和免疫行為，為COVID-19的治療提供了新的策略。

5 新冠蛋白及其受體的其他翻譯后修飾

在眾多蛋白翻譯后修飾種類中，糖基化和磷酸化最具代表性且被研究詳盡。超過600種的翻譯后修飾將各種功能基團(tuán)引入蛋白質(zhì)，使其功能種類得到巨大擴(kuò)充，并且影響了蛋白質(zhì)的折疊、穩(wěn)定性、活性以及蛋白質(zhì)的相互作用[34]。病毒作為特定細(xì)胞內(nèi)的寄生者，依靠宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)合成機(jī)制來支持其復(fù)制，因此病毒蛋白同樣受到PTMs的影響。例如，蛋白酶解和二硫鍵的形成改變病毒蛋白的結(jié)構(gòu)，糖基化、磷酸化、乙?；蜕锼鼗葎t為病毒蛋白添加了功能團(tuán)[153]。正如前文提到，這些源自宿主信號傳遞及調(diào)控通路所產(chǎn)生的翻譯后修飾已經(jīng)被新冠病毒劫持并為己所用，以達(dá)到其在宿主細(xì)胞內(nèi)的最高復(fù)制效率。換言之，如果能夠分析并理解新冠病毒蛋白上的翻譯后修飾事件在其復(fù)制周期的具體功能，會極大地加深人們對新冠病毒分子機(jī)理的了解，有助于進(jìn)一步的藥物研發(fā)。因翻譯后修飾種類繁多，物化性質(zhì)各有不同，并沒有一套通行的分析方法。但大致上都以基于質(zhì)譜的鳥槍法蛋白質(zhì)組學(xué)手段作為鑒定方式，遵循蛋白提取—酶解—基于特異性抗體的免疫共沉淀富集—質(zhì)譜分析的流程[154-155]。以質(zhì)譜分析為主的方法在鑒定翻譯后修飾的點位及定量方面具有獨特優(yōu)勢，而近年來興起的DIA、PRM等針對微量蛋白樣品的質(zhì)譜新方法，則進(jìn)一步提升了對翻譯后修飾多肽的鑒定能力。

針對新冠病毒蛋白的翻譯后修飾，大多集中在已具備成熟富集-分析方法的糖基化和磷酸化上；其他翻譯后修飾的質(zhì)譜分析研究則十分有限。Sun等[156]報道了刺突蛋白和ACE2上額外的翻譯后修飾，對刺突蛋白和ACE2進(jìn)行胰蛋白酶、糜蛋白酶和內(nèi)切蛋白酶Lys-C裂解處理，并通過LC-MS/MS分析蛋白位點，發(fā)現(xiàn)刺突蛋白和ACE2都包含多個甲基化位點，而ACE2還具有多個羥基脯氨酸位點。這項發(fā)現(xiàn)為研究病毒的宿主附著和免疫反應(yīng)機(jī)制提供了額外的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，也為開發(fā)急需的治療方案和疫苗提供了支持。由于大多數(shù)甲基轉(zhuǎn)移酶位于細(xì)胞核，刺突蛋白的甲基化可能發(fā)生于蛋白分泌過程[157]。盡管已有研究通過分子動力學(xué)、分子演變和生物信息學(xué)預(yù)測了刺突蛋白和ACE2上可能存在的其他翻譯后修飾，如ADP-核糖基化、蘇木酰化、棕櫚?；蚍核鼗?，這些修飾后的蛋白可能存在相互作用[158-162]，但目前還沒有基于實驗數(shù)據(jù)的研究來支持這些觀點?？梢韵胂蟮氖?，正如同其他已知的病毒，這些發(fā)生于新冠病毒蛋白上的翻譯后修飾對于病毒蛋白的功能起到了不可或缺的調(diào)節(jié)功能，有利于新冠病毒在宿主細(xì)胞的復(fù)制、裝配和釋放。這方面的研究對深入理解新冠病毒的毒性機(jī)制有獨特的價值，亟待深入發(fā)掘。

新冠病毒與其他冠狀病毒在基因?qū)用婢哂型葱裕虼税l(fā)生在其他冠狀病毒蛋白上的PTMs同樣有機(jī)會出現(xiàn)在新冠病毒蛋白上，且其功能、機(jī)制和調(diào)控都可能類似。鑒于對新冠病毒蛋白非糖基化/磷酸化翻譯后修飾的研究還十分有限，我們或許可以從針對其他冠狀病毒的研究結(jié)論中探究新冠病毒的面目。目前已知的部分冠狀病毒蛋白的PTMs及其功能列于表2[153,163]。針對新冠病毒其他蛋白的翻譯后修飾，如起到類似組蛋白功能的N蛋白，以及除刺突蛋白外另一個膜蛋白E蛋白的進(jìn)一步分析，將會具有重要意義。

表2 冠狀病毒蛋白的翻譯后修飾及其功能[148]Table 2 Post-translational modifications in coronavirus proteins and proposed functions

6 挑戰(zhàn)與展望

本文回顧了基于質(zhì)譜以糖蛋白組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)為代表的病毒蛋白翻譯后修飾水平的研究。面對新冠肺炎咄咄逼人的流行趨勢，迫切需要對新冠肺炎患者進(jìn)行快速和精確的分級診斷，以便在感染早期階段采取適當(dāng)?shù)尼t(yī)療措施。自新冠肺炎爆發(fā)和流行以來，基于質(zhì)譜的多種組學(xué)主要用于尋找生物標(biāo)志物，以識別感染者、尋找藥物目標(biāo)、評估醫(yī)療效果，或闡明發(fā)病和疾病嚴(yán)重程度的分子機(jī)制[164]。盡管目前新冠病毒已經(jīng)在傳播中產(chǎn)生4種已知的變異毒株(Alpha、Beta、Gamma和Delta)，其發(fā)病機(jī)制和癥狀的復(fù)雜性也在發(fā)生相應(yīng)的改變，但考慮到基于質(zhì)譜的組學(xué)技術(shù)在尋找生物標(biāo)志物和開發(fā)新治療方法上的顯著優(yōu)勢，有理由相信這項技術(shù)在幫助人類了解變種病毒方面仍擁有深厚潛力[165]。

對蛋白翻譯后修飾的質(zhì)譜分析而言，最大的挑戰(zhàn)在于樣品的富集。翻譯后修飾作為對蛋白活性瞬時微調(diào)的主要手段，出現(xiàn)的頻率偏低。單個蛋白上會被修飾的氨基酸殘基點位往往是有限的，而數(shù)量眾多的不同修飾種類還會互相爭奪同一個修飾位點，從而導(dǎo)致具備特定修飾的多肽所占比例很小。以出現(xiàn)頻率最高的磷酸化修飾為例，磷酸化肽段在樣本中的比例大約是千分之一[135]，而另一種常見的乙酰化修飾則小于萬分之一[166]。如果不加以純化富集，修飾過的多肽質(zhì)譜信號會被占絕大多數(shù)的無修飾多肽的信號抑制，從而無法鑒定。目前新冠領(lǐng)域?qū)Ψg后修飾的研究集中于磷酸化和糖基化，主要原因是這兩種修飾的相對豐度最高，且富集純化的手段相對成熟。而其他翻譯后修飾，一般必須使用成本昂貴的特異性單抗對目標(biāo)多肽通過免疫共沉淀法富集，才能得到足夠的樣本進(jìn)行質(zhì)譜分析。幸運的是，隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，儀器的靈敏度有了長足的進(jìn)步：一方面，最新推出市場的具備雙重離子淌度的質(zhì)譜儀將對樣本量的要求下降1～2個數(shù)量級；另一方面，隨著新的非數(shù)據(jù)依賴采集方法(如DIA及PRM)的開發(fā)，我們可以更有針對性地開發(fā)新的質(zhì)譜分析方法，靶向檢測特定修飾過的多肽。這些技術(shù)和儀器上的進(jìn)步，使得針對其他微量存在的翻譯后修飾事件的質(zhì)譜分析成為可能，并完全可以移植到新冠研究的領(lǐng)域中，進(jìn)一步加深對新冠病毒分子機(jī)制的理解。

即便如此，進(jìn)行復(fù)雜樣品分析時，質(zhì)譜檢測的動態(tài)范圍仍然是有限的。為達(dá)到最佳的分析效果，對樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化同樣至關(guān)重要。例如，為了分析新冠肺炎患者的血漿蛋白，需要克服血漿蛋白濃度范圍大所帶來的挑戰(zhàn)。常用的策略包括：1) 去除高豐度蛋白質(zhì)，特別是血漿中的白蛋白和免疫球蛋白，以避免掩蔽血漿中的低豐度蛋白質(zhì)，使低豐度蛋白質(zhì)得以被檢測；2) 通過色譜法、凝膠電泳或其他方法對血漿蛋白質(zhì)進(jìn)行分餾，以降低復(fù)雜性；3) 使用ELISA等策略分離目標(biāo)蛋白質(zhì)或多肽的目標(biāo)組，從而實現(xiàn)對目標(biāo)組的直接分析。蛋白質(zhì)可能包含多個糖基化修飾位點，每個位點的糖基化修飾類型(N-或O-糖基化)和聚糖鏈占有率可能不同(宏觀不均勻性)，而且在一個位點可能包含多個不同的聚糖鏈結(jié)構(gòu)(微觀不均勻性)[167]。在糖蛋白結(jié)構(gòu)分析中，糖鏈結(jié)構(gòu)的宏觀和微觀不均勻性需要逐一解決，因此建立高效、高特異性、高靈敏度的富集方法和批量分析方法是深入研究糖基化的關(guān)鍵。

在新冠肺炎肆虐全球的當(dāng)下，用于發(fā)掘生物標(biāo)志物的多組學(xué)和分子網(wǎng)絡(luò)研究是對新冠肺炎進(jìn)行全面認(rèn)識的可靠方法和寶貴工具。新興的糖蛋白組學(xué)和基于質(zhì)譜的翻譯后修飾研究可以提供蛋白活性調(diào)控的信息，將其應(yīng)用于尋找新冠的生物標(biāo)志物，可以促進(jìn)在分子水平上對感染和發(fā)病機(jī)制的深入探索，并可能最終發(fā)現(xiàn)新的治療策略?；谫|(zhì)譜的蛋白組學(xué)具有高通量和無偏見的優(yōu)勢，有望成為破解新冠肺炎大流行的關(guān)鍵法寶。

致謝：感謝郭鐘寶芬慈善基金為設(shè)立郭一葦環(huán)境與生物分析教授席所做的捐贈。