胸腺肽α1聯(lián)合肺泡灌洗對銅綠假單胞菌定植的支氣管擴張患者免疫失衡及臨床療效的影響*

梁秋亭， 溫泳濤， 柳元斌， 趙一菊， 謝襯梨

東莞市第五人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科 (廣東東莞 523900)

支氣管擴張，主要是指支氣管及其周邊肺組織產(chǎn)生炎癥反應和纖維化等現(xiàn)象，損傷支氣管壁肌肉與彈性組織結(jié)構(gòu)完整性，進而造成支氣管結(jié)構(gòu)形體發(fā)生改變，增加呼吸障礙、肺源性心臟病等嚴重并發(fā)癥發(fā)生率[1]。有研究指出，支氣管擴張患者主要特征是受損的下呼吸道反復感染或持續(xù)的細菌定植[2]。而銅綠假單胞菌是支氣管擴張癥患者最常見的定植菌之一，該菌不僅極易產(chǎn)生多重耐藥，且不易被呼吸道防御系統(tǒng)徹底清除，其導致患者病情惡化，生活質(zhì)量下降及病死率升高[3-4]。另有研究還發(fā)現(xiàn)支氣管擴張癥可能與免疫失衡有關[5]。因此，本研究擬采用隨機對照的臨床試驗設計方法，針對銅綠假單胞菌定植的支氣管擴張患者，臨床方法多樣，本文主要研究胸腺肽α1聯(lián)合肺泡灌洗療法的應用效果，觀察其療效及對患者機體免疫功能產(chǎn)生的影響效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2016年6月至2018年9月，選擇在我院住院后病情好轉(zhuǎn)穩(wěn)定的119例銅綠假單胞菌定植的支氣管擴張患者，在征得患者同意并簽署書面知情同意書后進入本次研究。其中有3例患者因故退出本研究，其中1例因大咯血行手術治療退出本研究，2例患者因呼吸衰竭退出本研究。實際完成研究例數(shù)116例，隨機分為觀察組與對照組，分別納入59、57例，兩組患者基本資料對比，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

項目例數(shù)年齡(歲)性別[例(%)]吸煙[例(%)]肺功能男女有無FEV1(L)FVC(L)觀察組5957.7±6.828(47.5)31(52.5)36(60.0)23(40.0)1.47±0.51.87±0.8對照組5757.1±8.128(49.1)29(50.9)35(61.4)22(38.6)1.43±0.61.90±0.6P值0.6670.8580.9660.6970.820

注：FEV1:第1秒用力呼氣容積；FVC:用力肺活量

1.2 患者入選標準及排除標準 入選標準：(1)有長期咳嗽、咳膿痰的支氣管擴張癥病史；(2)胸部HRCT證實存在支氣管擴張；(3) 患者病情穩(wěn)定后連續(xù)2次痰培養(yǎng)銅綠假單胞菌陽性；(4)肝、腎功能正常。排除標準：(1)有其他進行性基礎疾病或嚴重并發(fā)癥的患者；(2)妊娠婦女；(3)胸腺肽過敏者。

1.3 方法

1.3.1 治療方法 所有患者安全度過急性期，病情相對穩(wěn)定后，連續(xù)2次痰培養(yǎng)仍存在銅綠假單胞菌，以自愿原則，隨機分為兩組進行維持治療。對照組行單純肺泡灌洗，肺泡灌洗方法：局麻2%利多卡因，霧化吸入或噴灑咽喉部；整個過程中系嚴格監(jiān)護患者生命體征，包括心電圖、呼吸節(jié)律、血氣分析等，予低流量吸氧，纖維支氣管鏡經(jīng)鼻或經(jīng)口腔套管進入，吸除氣道內(nèi)分泌物后，予使用一次性注射器抽取37 ℃無菌生理鹽水20 mL,由吸引孔緩慢向支氣管內(nèi)推注,注意避免引起患者出現(xiàn)嗆咳情況,負壓吸引回收灌洗液，反復多次沖洗,至抽出液體清亮為止,灌洗液總量為50～100 mL 左右。操作其間若動脈血氧飽和度(SaO2)降低到80%以下時抽出管鏡，置入鼻導管進行吸氧(高濃度)或行無創(chuàng)機械通氣，等到SaO2上升到90%以上后再予以灌洗療法。每2周1次，療程3個月。觀察組皮下注射胸腺肽α1，1.6 mg/支,每周2次，共3個月(意大利Patheon公司，國家藥品批準文號H20080079)+肺泡灌洗。

1.3.2 標本采集 分別在第 0、3個月收集患者靜脈血 5 mL×2管。其中一管采用肝素抗凝，用以檢測 T 淋巴細胞亞群；另一管不抗凝，分離血清用以檢測炎癥因子。

1.3.3 檢測方法

1.3.3.1 外周血淋巴細胞Th17細胞檢測 對照管和樣本檢測管中加入肝素鈉抗凝血，100 μL 1640培養(yǎng)基和4 μL BD GolgiPlug(刺激劑和蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑)，培養(yǎng)箱孵育4 h。加入抗體CD3+、CD8+，避光孵育15 min。隨后加入BD intrasure固定液A避光孵育5 min，再加入紅細胞裂解孵育10 min，離心棄上清；加固定液B，在對照管中加入抗體IgG1-PE，樣本管中加入抗體白細胞介素(IL)-17，避光孵育15 min，離心洗滌，重懸，CD3+CD8-反設門圈取CD4+Th細胞，檢測CD3+CD8-IL-17+細胞。

1.3.3.2 外周血淋巴細胞Treg細胞檢測 對照管中加入抗體CD45+、CD4+、IgG1-APC、IgG1-PE，樣本檢測管中加入抗體CD45+、CD4+、CD25+、CD127+，兩管中再分別加入50 μL肝素鈉抗凝血，避光孵育15 min；隨后加入2 mL紅細胞裂解液，反應15 min后離心，棄上清液，再離心洗滌1次，重懸，檢測CD4+CD25+CD127low的表達。

1.3.3.3 血清炎癥因子檢測 采用ELISA技術檢測血清炎癥介質(zhì)IL-6、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)和IL-17、IL-10的檢測(試劑盒購于美國Ray Biotech公司,按實驗操作步驟)：制備好標準曲線，分別在孔板中加入標準曲線和血清樣本各100 μL，搖床孵育2.5 h；洗板，加入抗體，孵育1 h，洗板，拍干，加入100 μL酶，孵育45 min，再洗板拍干，每孔加入底物孵育30 min后加入終止液，立刻在酶標儀(Thermo公司)上，以450 nm波長檢測吸光度，繪制標準曲線，計算樣本的OD值。

1.4 療效觀察

1.4.1 臨床癥狀 以記錄患者治療前后咳嗽癥狀改善與咳痰量為主：(1)咳痰量：無咳痰記為0分，輕度記為1分，24 h痰量≤50 mL；中度記為2分，24 h痰量51～100 mL；重度記為3分，24h痰量>100 mL。(2)咳嗽：無咳嗽記為0分；輕度記為1分，每天咳嗽頻次<10，不干擾工作，夜間咳嗽癥狀消除；中度記為2分，頻次10～20，干擾正常工作活動，伴夜間咳嗽；重度記為3分，頻次>20，對工作產(chǎn)生嚴重影響，夜間無法入睡。將患者對應的評分相加即為臨床癥狀評分。

1.4.2 再次感染次數(shù) 對比觀察組和對照組患者6個月內(nèi)呼吸道再感染次數(shù)。結(jié)合O′Donnell等[6]的標準研究期間急性加重發(fā)生情況：患者伴有以下≥4個癥狀：(1)排痰量或痰液顏色發(fā)生改變；(2)呼吸困難癥狀嚴重化；(3)咳嗽程度、次數(shù)等增加；(4)持續(xù)高熱；(5)喘息癥狀嚴重；(6)自感周身不適或運動量明顯降低；(7)肺部功能減退；(8)胸X線、CT檢查結(jié)果提示肺部病灶有進展；(9)肺部聽診音出現(xiàn)變化。

1.4.3 肺功能測定 治療前后均要檢測患者肺功能[1秒用力呼氣容積(FEV1)、FVC及呼氣峰流速(PEF)]，以上操縱均由專業(yè)人員進行，選用儀器為Vmax 229型肺功能儀，以上每個指標均需連續(xù)進行3次，將最優(yōu)值設為檢測結(jié)果。

1.4.4 免疫指標測定 測定兩組病例第 0、 3、6個月免疫因子Treg、Th17的水平，Th17/Treg比值，炎癥因子IL-17、IL-6、IL-10、TGF-β水平。

1.5 統(tǒng)計學方法 用Excel.2007表格與SPSS 20.0統(tǒng)計軟件分別統(tǒng)計與處理實驗數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的分別用獨立樣本t與2檢驗，否則用LAD-t檢驗。經(jīng)計算，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胸腺肽α1聯(lián)合肺泡灌洗治療銅綠假單胞菌定植的支氣管擴張患者的免疫指標的影響 治療前兩組患者Th17細胞、Treg細胞和Th17/Treg比例差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。而對照組僅給予肺泡灌洗治療后，上述免疫指標無明顯變化。然而，觀察組患者治療后Treg的活動值明顯高于治療前，差異有統(tǒng)計學意義 (P<0.001), Th17的比例和Th17/ Treg比例均明顯低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。此外，治療后與對照組相比，觀察組Th17細胞和Th17/Treg比例水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；Treg細胞水平增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表2。

免疫指標例數(shù)Th17TregTh17/Treg觀察組59 治療前2.46±0.935.12±1.040.47±0.19 治療后0.54±0.33*△7.42±1.41*△0.076±0.032*△對照組57 治療前2.48±0.895.09 ±1.170.49±0.22 治療后2.63±0.945.08 ±1.310.52±0.25

*與同組治療前比較P<0.001；△與對照組治療后比較P<0.001

2.2 兩組炎性細胞因子比較 觀察組和對照組在治療前，IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β的表達水平之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。此外，對照組治療前、后IL-17、IL-10、IL-6和TGF-β的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后觀察組的IL-17和IL-6顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，IL- 10和TGF-β顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。此外, 與對照組治療后比較，觀察組IL-17和IL-6水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)；IL-10和TGF-β水平則明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。見表3。

2.3 兩組臨床癥狀及再次感染情況及肺功能比較 觀察組和對照組治療前的臨床癥狀和再次感染次數(shù)差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。治療后，觀察組咳嗽、咳痰癥狀，肺功能及再次感染明顯減輕，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組僅臨床癥狀及肺功能明顯改善，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后觀察組患者的臨床癥狀評分和再次感染次數(shù)明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后觀察組及對照組患者的肺功能均改善，觀察組患者的肺功能FEV1改善更多(P<0.05)。見表4。

組別例數(shù)IL-17(pg/mL)IL-6(pg/mL)IL-10(pg/mL) TGF-β(pg/mL)觀察組59 治療前8.32±1.614.24±1.220.86±0.2292.4±11.8 治療后6.20±0.74*△3.21±1.50*△1.23±1.51*△110.4±9.73*△對照組57 治療前8.53±2.114.12±1.310.84±0.3591.7±9.69 治療后8.61±1.874.43±1.420.92±0.4492.6±10.5

*與同組治療前比較P<0.001；△與對照組治療后比較P<0.001

項目例數(shù)臨床癥狀(分)再次感染次數(shù)(次)FEV1(L)FVC(L)觀察組59 治療前5.3±0.43.7±0.51.47±0.51.87±0.8 治療后3.6±0.5*△2.4±0.7*△1.95±0.3*△2.13±0.4*對照組57 治療前5.2±0.73.8±0.81.43±0.61.90±0.6 治療后4.0±0.8*3.7±0.91.66±0.7*2.02±0.5*

*與同組治療前比較P<0.05；△與對照組治療后比較P<0.05

2.4 不良反應 觀察組1例出現(xiàn)關節(jié)疼痛，所有患者均完成治療。對照組沒有特別的主訴。

3 討論

支氣管擴張是>3 mm的近側(cè)支氣管，管壁肌肉和彈性組織結(jié)構(gòu)完整性發(fā)生破損而出現(xiàn)異常擴張的情況，數(shù)次感染后造成以上結(jié)構(gòu)損傷嚴重，對管壁的支撐功能顯著降低，支氣管壁破壞又導致纖毛功能明顯下降，引發(fā)分泌物阻塞管腔,導致引流不暢而加重感染[7]。研究報道銅綠假單胞菌是其常見的定植菌，該菌可在機體免疫力低下時大量增殖引起支氣管擴張急性發(fā)作,造成嚴重感染并產(chǎn)生多重耐藥。該菌可以生物膜為“屏障”實現(xiàn)對抗菌藥物作用過程與宿主細胞免疫系統(tǒng)的有效抵制，進而以慢性定植菌的身份居留在支氣管擴張患者氣道內(nèi)；并能夠生成Ⅲ型分泌系統(tǒng)、脂多糖等毒力因子，襲擊宿主細胞，促使肺部感染癥狀嚴重化,同時造成多重耐藥[8]。感染及環(huán)境污染等因素刺激時,病原菌所含的某些抗原成分或代謝產(chǎn)物可激發(fā)局部肺泡巨噬細胞的生物活性，進而促使其快速合成并釋放炎癥因子，以白細胞介素等為主，白細胞介素又作用于肺泡巨噬細胞與支氣管上皮細胞形成炎癥因子，炎癥因子可激發(fā)巨噬細胞活性形成基質(zhì)金屬蛋白酶，促進血管內(nèi)皮細胞表達相關炎癥因子，促進炎癥反應、血管生成與組織纖維化等進程，進而損傷支氣管組織以及黏膜纖毛運動正常功能等，以上過程還會降低黏膜對細菌清除能力明顯降低，進而促進病原菌的定植過程，反復感染[9]。早先研究已證實支氣管擴張的發(fā)病機制可能與 T 淋巴細胞部分功能的缺損有關,反復感染及細菌定植導致患者免疫失衡[10]。已有研究表明，銅綠假單胞菌患者病情嚴重程度更高，炎癥狀態(tài)相關性更強，臨床、肺功能及影像學特征惡化，生活質(zhì)量及遠期預后較差[11]。

支氣管肺泡灌洗是當前廣泛應用的一種治療支氣管擴張的方案, 其原理是利用灌注生理鹽水清洗呼吸道分泌物，降低氣道壓力，提高氣道通暢程度。已有研究顯示，支氣管肺泡灌洗治療支氣管擴張合并感染的優(yōu)點在于支氣管鏡可直達病變部位，清除分泌物徹底；灌洗刺激可誘發(fā)咳嗽，有利于痰液及炎性物質(zhì)的排出, 促進病灶吸收；提高患者的肺通氣功能以及血氧含量。其可通過對患者支氣管進行數(shù)次灌洗與吸引，促進支氣管管腔中痰液、痰栓引流過程，收獲良好的應用效果[12]。

伴隨微創(chuàng)技術的改良與發(fā)展，臨床用纖維支氣管鏡對病灶進行直接治療的病例不斷增多，該療法能明顯提升用藥效率。針對支氣管疾病患者能有效吸除痰液，提升病程漫長者病源的有效清除率，為后期臨床治療做鋪墊。在本次研究中，實施纖維支氣管鏡肺泡灌療法，能直接清洗病灶，提升淤積痰液清洗率，減輕臨床癥狀，提高肺功能，提升整體治療效果。本研究結(jié)果顯示，兩組治療總有效率比較，差異有統(tǒng)計學意義。觀察組咳嗽咳痰、再次感染次數(shù)、肺功能差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。胸腺肽為一類提升晶體免疫力藥物，在疾病臨床治療中有較廣泛應用，其由胸腺上皮細胞分泌，同時進入機體循環(huán)參與T淋巴細胞分化成熟進程，此外，該類藥物還可激發(fā)細胞免疫活性，進而更明顯的提升病患免疫功能[13]。在本研究中發(fā)現(xiàn), 觀察組治療前后比較，胸腺肽α1聯(lián)合肺泡灌洗治療可使Treg明顯升高，Th17 和Th17/Treg比值明顯下降，而對照組無明顯改變。觀察組治療前、后比較，IL-17和IL-6明顯下降，IL-10和TGF-β顯著增加。對照組則無明顯變化。再次感染的數(shù)量而言,觀察組治療前后再次感染顯著降低，而對照組治療后沒有明顯變化。觀察組的平均次數(shù)低于對照組。

總之，肺泡灌洗療法有助于減輕支氣管擴張患者臨床癥狀，增強肺部功能。支氣管擴張張患者胸腺肽α1聯(lián)合肺泡灌洗,可以顯著減少咳嗽和痰的癥狀,改善肺功能，可以減少再次感染的數(shù)量,提高患者的免疫系統(tǒng)功能。不良反應小，是支氣管擴張的一種新的預防治療方法。