結(jié)核分枝桿菌感染對NLRP3炎性小體活化的調(diào)控作用研究進展

劉 蕾， 楊 易， 徐金瑞*

(1.寧夏大學 西部特色生物資源保護與利用教育部重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 生命科學學院，寧夏 銀川 750021)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是一種最常見的慢性細菌性疾病。盡管目前已有治療藥物和疫苗，結(jié)核病在全世界的死亡率依然非常高。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)是TB的致病菌，屬于兼性胞內(nèi)菌。巨噬細胞、中性粒細胞、單核細胞及樹突狀細胞等均是Mtb的靶細胞。雖然大多數(shù)(90%～95%)接觸Mtb的個體不會發(fā)展成活動性結(jié)核，但大多都是Mtb的攜帶者，Mtb很可能存在于由免疫細胞聚集而成的肉芽腫的緊密組織中，即所謂的潛伏感染[1]。從潛伏感染或者進行性肺病發(fā)展為活動性結(jié)核病的病例中，因Mtb繁殖不受限制，從而導致病程延長，并伴隨著肺實質(zhì)的破壞。TB仍然是目前影響人類最嚴重的全球性疾病之一[2]。近年來，對TB發(fā)病機制的研究揭示了Mtb感染后引發(fā)宿主免疫反應的分子基礎。大量研究表明，炎性小體在機體免疫反應中發(fā)揮著重要作用，其中對NLRP3炎性小體的研究最為廣泛[3-4]。

1 炎性小體

炎性小體是一種多蛋白大分子復合體，炎性小體活化是固有免疫的一部分。炎性小體通過模式識別受體 (pattern recognition receptor，PRR) 識別病原微生物和內(nèi)源性危險信號，即病原相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)和危險相關分子模式(damage associated molecular pattern，DAMP)， 招募并且激活 Caspase-1，剪切 IL-1β 和 IL-18 分子的前體，產(chǎn)生相應成熟的細胞因子IL-1β和IL-18，參與機體對病原體的清除以及誘導適應性免疫應答的產(chǎn)生。目前發(fā)現(xiàn)能夠形成炎性小體的 PRR 主要有 NOD 樣受體(NOD-like receptor，NLR)、AIM2樣受體(AIM2-like receptor，ALR)以及含嘧啶和HIN結(jié)構域的蛋白質(zhì)(Pyrin and HIN domain-containing protein，PYHIN)蛋白家族受體[5]。

NLRP3 是目前研究最多的炎性小體，最初發(fā)現(xiàn)它與被稱為隱熱蛋白相關的周期性綜合征的遺傳性自身免疫疾病相關，癥狀是皮疹和發(fā)熱，NLRP3突變與90多種疾病相關。細胞外ATP、尿酸晶體、細菌成孔毒素、許多病原微生物，如金黃色葡萄球菌、李斯特菌屬、肺炎克雷伯菌、奈瑟菌屬、白色念珠菌、釀酒酵母菌、仙臺病毒、腺病毒、流感病毒等都能夠激活 NLRP3 炎性小體[6]。

NLRP1是第一個被描述的炎性小體復合物，在人類中由單個NLRP1基因編碼，在鼠中由NLRP1(a～c)編碼。NLRP1b炎性小體不像NLRP3炎性小體一樣在所有情況下都會導致caspase-1的自身蛋白水解切割，但它仍然能夠切割IL-1β并發(fā)生焦亡。 在人NLRP1中功能獲得突變會導致皮膚病，包括多個自愈性掌跖癌和家族性角化病[7]。研究發(fā)現(xiàn)炭疽芽胞桿菌的致死毒素是小鼠NLRP1的配體，人類NLRP1和鼠NLRP1a/c的生理觸發(fā)因素仍有待發(fā)現(xiàn)。

NAIP-NLRC4炎性小體對Ⅲ型分泌系統(tǒng)(T3SS)的細菌成分和革蘭陰性細菌的鞭毛蛋白有反應。NAIP蛋白質(zhì)感知細菌T3SS針頭狀復合物和鞭毛蛋白質(zhì)，將多個NLRC4蛋白募集到炎性小體組合物中。最近的研究確定NLRC4炎性小體也受到沙門氏菌感染期間S533上的磷酸化過程的調(diào)節(jié)，能夠在沙門氏菌感染期間形成包含NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated speck like protein containing CARD，ASC)分子、caspase-1和caspase-8的炎性小體復合物[8]。

AIM2炎性小體在病毒和細胞內(nèi)細菌感染期間檢測細胞胞質(zhì)中的dsDNA以及自身DNA。 AIM2的HIN-200結(jié)構域以序列非依賴性方式介導dsDNA的結(jié)合[9]。

Pyrin蛋白中的功能獲得性突變最初被發(fā)現(xiàn)與家族性地中海熱相關，家族性地中海熱是人類的自身炎癥性疾病，pyrin蛋白被鑒定為炎性小體復合體的組分。在正常條件下，來自細菌病原體(包括艱難梭菌(TcdB)、副溶血弧菌(VopS))等的Rho-滅活毒素激活pyrin炎性小體[10]。

小鼠NLRP9b炎性小體近期被發(fā)現(xiàn)可以在腸上皮細胞中被輪狀病毒感染激活。RNA解旋酶Dhx9，可以識別病毒雙鏈RNA，并導致NLRP9b與炎性小體適配子ASC和caspase-1裝配，并導致IL-18成熟和gasdermin D介導的焦亡[11]。

2 NLRP3炎性小體

2.1 NLRP3炎性小體的結(jié)構

NLRP3炎性小體是目前研究最廣泛的炎性小體，在結(jié)核病樣本中檢測到NLRP3炎性小體的激活[3]。NLRP3炎性小體是由NLRP3分子、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis associated speck like protein containing CARD，ASC)分子、pro-caspase-1分子組成的蛋白復合體(圖1)。NLRP3包含3個結(jié)構域，分別是羧基端富含亮氨酸重復序列(Leucine-rich repeat，LRR)結(jié)構域、中央的核苷酸結(jié)合和寡聚結(jié)構域(nucleotide-binding and oligomenzation，NACHT)以及氨基端的含吡啶結(jié)構的熱蛋白結(jié)構域(pyrin domain，PYD)[12]。

在危險信號刺激后，NLRP3分子會發(fā)生構象變化并導致自身寡聚化，與接頭蛋白ASC通過PYD-PYD相互作用結(jié)合，ASC再通過CARD結(jié)構域結(jié)合pro-caspase-1，從而完成NLRP3炎性小體的組裝。炎性小體復合物在將Caspase-1前體轉(zhuǎn)化為活化的Caspase-1 p20和 p10中起著關鍵作用，并促進下游IL-1β和IL-18的活化和分泌[13]。

圖1 NLRP3炎性小體的結(jié)構Fig.1 Simplified structure of NLRP3 inflammsome

2.2 NLRP3炎性小體活化機制

NLRP3炎性小體的激活過程分為起始和組裝兩部分。①起始階段：該階段TLR-NF-κB信號通路參與促進NLRP3、pro-IL-1β和pro-IL-18的轉(zhuǎn)錄和表達[14]。c-Jun氨基末端激酶1(c-Jun N-terminal kinase 1，JNK1)磷酸化NLRP3，為下游炎性小體的激活做準備[15]。②激活階段：發(fā)生外界刺激，NLRP3分子自身發(fā)生寡聚化，并通過ASC招募pro-caspase-1，從而完成炎性小體的組裝。NLRP3炎性小體激活后會使線粒體內(nèi)的組分釋放到胞質(zhì)中，釋放組織蛋白酶，并激活下游炎性信號。

目前，對NLRP3炎性小體激活機制主要包括鉀離子外流、溶酶體破裂、線粒體活性氧簇 (reactive oxygen species，ROS)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。①鉀離子外流引起NLRP3炎性小體活化[16](圖2)。P2X嘌呤受體7(P2X7)與ATP結(jié)合后被激活，離子通透性改變，細胞膜上的離子通道開放，胞內(nèi)鉀離子外流，使胞內(nèi)的低鉀環(huán)境激活NLRP3炎性小體[17-18]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，NIMA相關蛋白激酶7(NIMA-related kinase 7，NEK7)是NLRP3上游的重要分子[19]。NEK7與NLRP3分子的結(jié)合對于NLRP3炎性小體至關重要，研究還發(fā)現(xiàn)NEK7可以調(diào)節(jié)鉀離子流[20]，NEK7調(diào)節(jié)下游的IL-1β活化是通過與NLRP3分子的相互作用還是通過調(diào)節(jié)鉀離子流仍然需要進一步研究。②溶酶體膜的破裂引起NLRP3炎性小體活化。溶酶體膜破裂使溶酶體的組分組織蛋白酶B釋放到胞質(zhì)中激活NLRP3炎性小體[21]。③線粒體ROS引起NLRP3炎性小體活化。研究發(fā)現(xiàn)，ROS不僅可以直接參與NLRP3炎性小體活化，而且過量ROS還會使細胞內(nèi)產(chǎn)生硫氧還蛋白，胞內(nèi)游離的硫氧還蛋白與NLRP3分子結(jié)合，促進NLRP3炎性小體的激活。④內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的NLRP3炎性小體活化。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以通過核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)蛋白信號通路促進pro-IL-1β的轉(zhuǎn)錄和表達。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激也會引起胞內(nèi)鈣離子濃度升高、線粒體損傷以及下游的ROS升高使NLRP3炎性小體激活[22]。

另外，在NLRP3分子缺陷型和ASC分子缺陷型細胞中仍然發(fā)現(xiàn)有IL-1β細胞因子的釋放[23-24]，caspase1和caspase11雙缺陷型小鼠獲得的樹突狀細胞仍然可以分泌IL-1β和IL-18，雖然比野生型細胞低[25]，說明存在NLRP3炎性小體非依賴的方式分泌這些細胞因子。

3 Mtb感染對NLRP3炎性小體活化的作用

3.1 Mtb感染對NLRP3炎性小體活化的激活作用

作為結(jié)核病的標志，Mtb在活動性結(jié)核期間會誘發(fā)全身性炎癥反應。炎癥的分子調(diào)節(jié)與炎性小體的組裝有關。Mtb可以特異性活化NLRP3炎性小體，Mtb觸發(fā)炎性小體激活的程度影響小鼠模型中TB的嚴重程度[26]。

圖2 NLRP3炎性小體的活化Fig.2 NLRP3 inflammasome activation

ESX-1系統(tǒng)被認為是Mtb致病性的一個關鍵介質(zhì)，缺乏ESX-1的突變株在巨噬細胞內(nèi)復制有缺陷，并且實驗小鼠的結(jié)核病癥狀顯著減輕。Mtb的毒力相關差異區(qū)域1(region of difference 1，RD1)基因編碼ESX-1系統(tǒng)的許多毒力因子，毒力因子釋放到受感染細胞使吞噬體膜破裂，而吞噬體膜破裂是Mtb胞質(zhì)逃逸的重要先決條件[27]。Mtb刺激巨噬細胞釋放成熟的IL-1β，而減毒的牛分枝桿菌BCG缺失RD1區(qū)，不能刺激巨噬細胞釋放成熟的IL-1β，說明ESX-1系統(tǒng)是NLRP3炎性小體活化的關鍵因素[17，28]。

ESX-1系統(tǒng)的各個組成部分如何協(xié)同工作以激活NLRP3炎性小體及產(chǎn)生一個完整的分泌機制還不完全清楚，其效應蛋白的精確功能和性質(zhì)也不清楚。大多數(shù)關于ESX-1系統(tǒng)與免疫元件相互作用的研究都集中在6 kD早期分泌抗原靶(6 kD early secreted antigen target 6, ESAT6)和10 kD培養(yǎng)濾液蛋白(culture filter protein 10, CFP10)上，這兩種底物是Mtb免疫過程中結(jié)合T細胞的主要抗原[29]。這些蛋白質(zhì)以異二聚體的形式分泌，需在共分泌蛋白質(zhì)的輔助下通過分泌裝置[30]。ESAT-6具有膜通透性，通過其膜溶解能力激活NLRP3炎性小體[17，28]，ESAT-6缺失的細菌突變體感染能力明顯減弱[31]。除ESAT-6和CFP-10外，一些ESX-1分泌相關蛋白(ESX-1 secretion-associated proteins,Esp)被認為是候選底物，與ESAT-6一起誘導宿主細胞裂解，有利于Mtb的維持。由于ESX-1在細菌效應物向宿主細胞溶膠轉(zhuǎn)移中的重要性，其表達對細胞內(nèi)包括炎性小體在內(nèi)的模式識別受體激活有強烈影響。

盡管ESAT-6是Mtb非常重要的毒力因子，但最近的研究表明，單獨ESX-1底物與宿主免疫反應之間的相互作用比最初預期的更為復雜。例如，ESAT-6分泌減弱的各種減毒菌株(如H37Ra、DEspC、DEspA)仍然能夠刺激小鼠和人巨噬細胞產(chǎn)生IL-1β[32]。這表明其他ESX-1底物也可以在吞噬體膜上穿孔及誘發(fā)后續(xù)的炎性反應，這些底物在Mtb侵染細胞中發(fā)揮的作用仍需要進一步的研究。

除ESX-1，研究人員發(fā)現(xiàn)ESX-5在Mtb感染巨噬細胞后也可引起分泌IL-1β[33]。Mtb的 ESX-5突變株在體內(nèi)的生長減慢，表明ESX-5可能也與Mtb的毒力有關[34]。ESX-5激活炎性小體的機制仍然需要進一步研究。

除了分泌系統(tǒng)分泌的相關蛋白外，研究還發(fā)現(xiàn)Mtb的雙鏈RNA可以使Caspase-1激活。將Mtb未處理的總RNA和RNase I(降解單鏈RNA)處理過的總RNA，RNase III(降解雙鏈RNA)處理過的RNA分別轉(zhuǎn)染到細胞中，發(fā)現(xiàn)未處理的總RNA和RNase I處理過的總RNA都可以使Caspase-1活化，但是未處理的總RNA和RNase I處理過的總RNA不能使Caspase-1活化，說明Mtb雙鏈RNA可以特異地使NLRP3炎性小體激活[35]。

3.2 Mtb感染對NLRP3炎性小體活化的抑制作用

在Mtb感染后，炎性小體的活化有助于細胞清除Mtb，限制Mtb的生存和遷移。但是在大多數(shù)情況下，感染不會導致疾病，因為芽胞桿菌已經(jīng)進化出逃避炎性小體活化的策略，與免疫反應保持平衡，從而保持潛伏數(shù)十年[36]。機體對抗Mtb免疫反應的一個標志是肉芽腫的形成，肉芽腫內(nèi)一些被感染的細胞發(fā)生壞死，形成一個無細胞的中央?yún)^(qū)，Mtb在此處繼續(xù)留在肉芽腫內(nèi)。研究發(fā)現(xiàn)，Mtb強毒株可能通過鋅離子依賴的金屬蛋白酶1(Zn-metalloprotease，Zmp1)和酪氨酸磷酸酶A(tyrosine phosphatase，Ptp A)調(diào)節(jié)宿主代謝，直接或間接抑制NLRP3炎性小體，但其具體機制仍有待進一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，Zmp1可以抑制吞噬體溶酶體的融合[37]和限制IL-1β的產(chǎn)生和激活，有助于Mtb的逃逸和增殖。通過用Zmp1缺失或減弱的Mtb感染巨噬細胞，觸發(fā)了NLRP3炎性小體的激活，導致IL-1β分泌增加，含Mtb的吞噬體成熟增強，巨噬細胞對Mtb的清除增加，以及被氣溶膠感染的小鼠肺部載菌量降低[38]。通過使用不能抑制IL-1β產(chǎn)生的Zmp1 Mtb突變體，證實了在TB動物模型中，吞噬體成熟的阻滯、Mtb細胞內(nèi)存活和完全毒力都依賴于Mtb對炎性小體激活的主動抑制作用[38]。

Ptp A抑制宿主先天免疫信號通路。在細胞質(zhì)中，Ptp A抑制JNK/p38 MAPK和NF-κB信號通路[39]，JNK/p38 MAPK和NF-κB信號通路進而影響NLRP3 炎性小體組分的轉(zhuǎn)錄[40]。在吞噬體的成熟過程中，Ptp A可促進吞噬體的組成通過質(zhì)膜分子再利用和依次獲得早期內(nèi)體、晚期內(nèi)體和溶酶體相關分子發(fā)生改變，進而抑制吞噬體與溶酶體的融合及吞噬體的酸化[41]，發(fā)揮對NLRP3炎性小體活化的抑制作用[42]。在細胞核中，Ptp A具有調(diào)節(jié)宿主細胞的免疫、遷移、增殖等基因表達的作用[43]。Ptp A對NLRP3炎性小體活化的調(diào)控機制仍需要進一步的研究。

4 展 望

本文綜述了NLRP3炎性小體活化的機制及Mtb感染對NLRP3炎性小體活化的調(diào)控作用。通過在Mtb感染的不同時期，對NLRP3炎性小體進行與Mtb感染相反的調(diào)控，可能對控制Mtb在體內(nèi)的侵染、增殖、遷移等起到有效的控制作用，從而有效控制結(jié)核病的發(fā)展。盡管在Mtb感染后NLRP3 炎性小體的活化研究目前已經(jīng)取得了很大進展，但尚有很多問題亟需解決，包括NLRP3炎性小體在Mtb感染后參與調(diào)控的具體途徑，NLRP3炎性小體在Mtb感染后與其他信號通路之間的相互調(diào)控與聯(lián)系，以及NLRP3炎性小體在Mtb感染中具體的作用機制等。對Mtb感染期間NLRP3炎性小體活化的更全面了解將為結(jié)核的有效宿主導向治療或輔助治療提供新的潛在靶點。