來源鹵化二型聚酮類生物合成基因簇的兩種關(guān)鍵功能基因鑒定與表達(dá)

王 苗， 岳昌武， 李曉倩， 陳 彬

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)研究院，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué) 貴州省普通高等學(xué)校微生物資源利用及開發(fā)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563000；3.延安大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，陜西 延安 716000；4.遵義醫(yī)科大學(xué) 第三附屬醫(yī)院，貴州 遵義 563000)

鹵化物是包括氟化物、氯化物、溴化物、碘化物以及某些鹵素互化物的一類有機(jī)化合物。大多數(shù)鹵化物具有重要的生物活性，臨床上使用的抗生素和抗腫瘤藥物中，有許多來源于微生物的鹵化物，如具有抗腫瘤活性的C-1027、蝴蝶霉素以及具有抗菌活性的萬古霉素、氯霉素等。2014年批準(zhǔn)上市的4個(gè)新型抗生素中3個(gè)為鹵化物，分別為Dalvance、Oritavanci、Sivextro[1-3]。鹵化物中的鹵素原子對鹵化物的生理活性有重要的影響，不僅可以有效提高化合物的相關(guān)活性[4-7]，而且可以延長半衰期并增加生物利用度[8-9]。因此，鹵化物的發(fā)現(xiàn)與研究對新藥的開發(fā)具有十分重要的意義。鹵化物主要來源于微生物，通過傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法挖掘天然鹵化物重復(fù)率高且不具有定向性[10]。研究表明，鹵化物的生物合成基因成簇(Gene cluster)存在于生物的基因組中，其中的鹵化酶基因負(fù)責(zé)化合物的鹵化修飾，是能夠賦予次生代謝產(chǎn)物活性的一種重要后期修飾酶，具有底物特異性，很可能催化合成新的鹵化產(chǎn)物。鹵化酶催化的鹵化反應(yīng)在抗生素生物合成途徑中起著重要作用，可極大提高代謝產(chǎn)物的生物活性。以鹵化酶基因?yàn)樘结槪l(fā)現(xiàn)與之偶聯(lián)的天然生物合成基因簇，利用鹵化酶基因序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)簡并引物，篩選土壤宏基因組文庫獲得鹵化酶陽性克隆，并對獲得的鹵化酶基因間的進(jìn)化及其與天然產(chǎn)物合成的關(guān)系進(jìn)行分析。高鵬等[11]、張繼[12]通過對微生物中的鹵化酶基因克隆和分析，為鹵化物的定向發(fā)現(xiàn)提供參考。鏈霉菌Streptomycessp. FJS31-2基因組全長約11.6 Mb,前期研究發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生一系列鹵化產(chǎn)物[13-14]，其中包含一個(gè)鹵化酶II型PKS類產(chǎn)物zunyimycin生物合成基因簇，全長15 462 bp。通過對其生物合成基因簇進(jìn)行系列分析，發(fā)現(xiàn)其中包含后修飾鹵化酶基因和單加氧酶基因并構(gòu)建鹵化酶和單加氧酶原核表達(dá)載體，進(jìn)行原核表達(dá)純化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體 鏈霉菌Streptomycessp. FJS31-2由本實(shí)驗(yàn)室(貴州省普通高等學(xué)校微生物資源利用及開發(fā)特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)分離自貴州省梵凈山地表10～20 cm土壤樣品(海拔高度800 m，東經(jīng)108°47′50″，北緯27°56′32″)，保存于中國普通菌種保存中心(菌保號(hào)：CGMCC 4.7321)。鏈霉菌Streptomycessp. FXJ1.264由中國科學(xué)院微生物所黃英課題組分離自江西瑤里酸性紅壤。大腸埃希菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞JM109、BL21(DE3)Rosetta購自博邁德(北京)基因技術(shù)有限公司；基因克隆質(zhì)粒載體pMD18-T simple購自寶生物(大連)公司；表達(dá)質(zhì)粒載體pET-32a 為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑與儀器 高純質(zhì)粒提取試劑盒及分子生物學(xué)試劑購自博邁德(北京)生物科技公司； rTaq等PCR 反應(yīng)試劑、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、去磷酸化酶等分子克隆所用酶類購自富酶泰斯(深圳)生物科技公司；培養(yǎng)基、蛋白質(zhì)表達(dá)純化等生化藥品如無特殊說明均購自碧迪醫(yī)療(上海)有限公司；DNA 凝膠回收試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒等購自愛思進(jìn)(杭州)生物技術(shù)有限科技公司；引物合成及測序由英濰捷基(廣州)有限公司完成；IPTG、氨芐青霉素等藥物購自西格瑪公司；GF254薄層層析(thin layer chromatography，TLC)硅膠板、柱層析用硅膠購自青島譜科分離材料有限公司；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20購自北京滿倉科技有限公司；甲醇、乙醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮等(均為分析純)購自成都科龍化工試劑廠；甲醇、乙腈等(均為色譜純)購自北京邁瑞達(dá)公司。紫外分光光度計(jì)(BASIC,德國Eppendorf)；高效液相色譜儀(Agilent 1220 Infinity LC VL，美國安捷倫公司)；液質(zhì)聯(lián)用儀(1200HPLC/6520 QTOFMS，美國安捷倫公司)；核磁共振儀(AV III，Ascend 500 HD 500 MHz，德國Bruker公司)；英培搖床(DZ-900，太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(R-210，瑞士步其公司)；培養(yǎng)箱(BSP-400，上海博訊設(shè)備儀器廠)；超級(jí)潔凈工作臺(tái)(E002092，蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司)；超純水機(jī)(Direct-Q5UV，美國密理博公司)；超聲波提取機(jī)(SCIENTZ-15T，寧波新芝公司)；自動(dòng)蒸汽滅菌器(MLS-3781L-PC，日本松下公司)。

1.1.3 軟件 基因組測序結(jié)果拼接、核酸比對采用DNAMAN專業(yè)軟件；序列比對及進(jìn)化分析[15-17]采用MEGA 5.0專業(yè)軟件；采用Primer Premier 5專業(yè)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。通過數(shù)據(jù)庫專業(yè)網(wǎng)站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行核酸及蛋白序列的比對和分析、基因序列的上傳[18]，通過數(shù)據(jù)庫專業(yè)網(wǎng)站antiSMASH(http://antismash.secondarymetabolites.org/)進(jìn)行次級(jí)代謝基因簇分析[19]。

1.2 方法

利用DNA重組技術(shù)，將本實(shí)驗(yàn)室克隆并鑒定的鹵化二型聚酮化合物zunyimycins生物合成基因簇的后修飾基因單獨(dú)與表達(dá)質(zhì)粒載體pET32a重組，構(gòu)建重組原核表達(dá)質(zhì)粒載體，并轉(zhuǎn)化大腸埃希菌表達(dá)菌株BL21(DE3)和Rosetta獲得基因工程菌，利用鹵化酶和單加氧酶體外組合催化zunyimycins非鹵化前體物Anthrabenzoxocinones(ABX, BE-24566B)，分析其鹵化催化機(jī)制。

1.2.1 系統(tǒng)進(jìn)化分析 將基因組分析得到的氨基酸殘基序列，經(jīng)BLAST在線比對，NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST程序在線進(jìn)行氨基酸序列相似性比對搜索，從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得相似性較高且為有效描述的典型菌株的氨基酸序列作為參比對象，采用MEGA 5.0軟件進(jìn)行聚類分析并構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 目的基因克隆及原核表達(dá)質(zhì)粒載體構(gòu)建 利用primer5.0 等生物軟件， 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期鏈霉菌Streptomycessp. FJS31-2基因組測序結(jié)果，設(shè)計(jì)編碼基因的完全編碼區(qū)擴(kuò)增引物，Halo編碼基因上下游引物分別加入限制性內(nèi)切酶BglⅡ和HindⅢ識(shí)別位點(diǎn)，Mono編碼基因上下游引物分別加入限制性內(nèi)切酶HindⅢ和XhoⅠ識(shí)別位點(diǎn)。HaloEF/ER鹵化酶特異引物和mOXYEF/ER單氧酶特異引物以Streptomycessp. FJS31-2基因組DNA為模板擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物純化、TA克隆、特異引物PCR驗(yàn)證、測序驗(yàn)證陽性克隆、菌株Halo-T采用限制性酶BglⅡ和HindⅢ雙酶切，菌株Mono-T采用限制性酶HindⅢ和XhoⅠ雙酶切，雙酶切片段分別連接相應(yīng)酶切并去磷酸化處理的表達(dá)載體pET-32a，室溫反應(yīng)6 h，轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞，用特異引物進(jìn)行菌液PCR鑒定及質(zhì)粒酶切鑒定，測序鑒定，經(jīng)測序驗(yàn)證后的原核表達(dá)質(zhì)粒載體分別命名為pET-halo和pET-mono。

1.2.3 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 分別取陽性克隆菌pET-halo、pET-mono質(zhì)粒和pET32a 質(zhì)粒100 ng，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)過夜、T7 啟動(dòng)子引物菌液PCR 鑒定后，將含重組質(zhì)粒的基因工程菌分別命名為pET-haloBL21、pET-monoBL21和pET32aBL21。取這3種基因工程菌各50 μL，分別接種于5 mL 含終濃度100 ng/μL 氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基中，220 r/min，37 ℃培養(yǎng)3 h進(jìn)行活化，然后分別接種100 mL 含終濃度100 ng/μL氨芐西林的LB 液體培養(yǎng)基中，220 r/min、37 ℃ 培養(yǎng)至OD600=0.3 時(shí)，分別取5 mL液體培養(yǎng)物分裝至50 mL 無菌離心管，加入終濃度1.0 mmol/L 的IPTG，28 ℃恒溫?fù)u床誘導(dǎo)6 h。取1 mL 誘導(dǎo)后培養(yǎng)物，4 000 r/min 離心5 min，菌體沉淀加入100 μL 5×SDS-PAGE 電泳上樣緩沖液，99 ℃金屬浴裂解10 min，12 000 r/min，室溫離心10 min，上清即為菌體總蛋白裂解液。分別取10 μL 總蛋白裂解液上樣，10%SDS-PAGE凝膠電泳?？捡R斯亮藍(lán)R250 染色6 h 后，甲醇-冰醋酸脫色液脫色6 h，判斷蛋白質(zhì)表達(dá)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 關(guān)鍵基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

鏈霉菌Streptomycessp. FJS31-2中單加氧酶蛋白序列AbxO與糖多孢菌屬Saccharomonosporasp.xinjiangensis的氨基酸序列同源性為33%、Saccharomonosporasp.CNQ490的氨基酸序列同源性為31%、Saccharomonosporasp.cyanea NA-134的氨基酸序列同源性為32%、Saccharomonosporasp.glauca的氨基酸序列同源性為31%，與鏈霉菌屬Streptomycessp.violaceusniger的氨基酸序列同源性為31%、與Streptomycessp.iranensis的氨基酸序列同源性為33%、與Streptomycessp.PRh5的氨基酸序列同源性為33%，與Streptomycessp.violaceusniger TU4113的氨基酸序列同源性為31%(圖1)。

鏈霉菌Streptomycessp. FJS31-2AbxH鹵化酶蛋白序列與鏈霉菌屬Streptomycessp.prunicolor的鹵化酶氨基酸序列同源性為57%、與Streptomycessp.iranensis的同源性為53%、與Streptomycessp.roseochromogenus的同源性為47%、與Streptomycessp.scopuliridis的同源性為46%，與鹽孢菌屬的兩株不同菌的同源性都均54%，與小單孢菌屬M(fèi)icromonosporaechinospora的鹵化酶蛋白序列同源性為53%，與擬無枝酸菌屬Amycolatopsisrifamycinica的鹵化酶氨基酸序列同源性為58%、與Amycolatopsissp.decaplanina DSM44594的同源性為53%，與一株未分類細(xì)菌的鹵化酶氨基酸序列同源性為56%(圖2)。

圖1 鏈霉菌Streptomyces sp. FJS31-2 AbxO與其他菌株Monooxygenase基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.1 Analysis of the gene system evolution of Streptomyces sp. FJS31-2 AbxO and other strains of Monooxygenase◇:已鑒定功能產(chǎn)生單加氧酶的SchA蛋白; ▲:鏈霉菌Streptomyces sp. FJS31-2 AbxO蛋白◇：the SchA protein whose function has been identified to produce monooxygenase；▲：Streptomyces sp. FJS31-2 AbxO protein

圖2 鏈霉菌Streptomyces sp. FJS31-2 AbxH與其他菌株Halo基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.2 Analysis of the gene system evolution of Streptomyces sp. FJS31-2 AbxH and other strains of Halo◇:已鑒定功能的鹵化酶蛋白CalO3; ▲:鏈霉菌Streptomyces sp. FJS31-2 AbxH蛋白◇：the halogenase protein CalO3 with identified function; ▲：Streptomyces sp. FJS31-2 AbxH protein

2.2 pET-abxH和pET-abxO表達(dá)載體構(gòu)建

以鏈霉菌Streptomycessp.FJS31-2基因組為模板，特異引物擴(kuò)增abxH和abxO目的片段，分別TA克隆，T載體通用引物M13F/M13R進(jìn)行菌液PCR鑒定，abxH/T質(zhì)粒BglⅡ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切鑒定并膠回收1 300 bp目的片段，連接相同酶切并去磷酸化處理的質(zhì)粒載體pET32a，abxO/T質(zhì)粒酶HindⅢ和XhoⅠ酶切鑒定并膠回收753 bp目的片段，連接相同酶切并去磷酸化處理的質(zhì)粒載體pET32a，兩種連接產(chǎn)物室溫過夜連接，轉(zhuǎn)化克隆菌株JM109感受態(tài)細(xì)胞。分別命名為pET-abxH-J和pET-abxO-J。

pET-abxH-J進(jìn)行特異引物菌液PCR鑒定，擴(kuò)增出對應(yīng)的目的條帶1 300 bp(圖3)；pET-abxO-J進(jìn)行特異引物菌液PCR鑒定，擴(kuò)增出對應(yīng)的目的條帶753 bp(圖4)。擴(kuò)增出目的條帶的陽性克隆提取質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切鑒定，pET-abxH-J質(zhì)粒BglⅡ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，可以切出載體片段5 900 bp和插入的目的條帶1 300 bp，pET-abxO-J質(zhì)粒HindⅢ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶雙酶切鑒定，可以切出載體片段5 900 bp和插入的目的條帶750 bp，鑒定的陽性克隆測序驗(yàn)證。

圖3 pET-abxH-J連接轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞特異引物鑒定Fig.3 pET-abxH-J identification of specific primers for connecting transformed JM109 competent cells1～20: 隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子;M: 2 000 bp DNA Marker1-20: randomly selected transformants; M: 2 000 bp DNA Marker

圖4 pET-abxO-J連接轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)胞特異引物鑒定Fig.4 pET-abxO-J identification of specific primers for connecting transformed JM109 competent cells1～24:隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子;M:2 000 bp DNA Marker1-24: randomly selected transformants; M: 2 000 bp DNA Marker

2.3 目的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

測序驗(yàn)證的陽性菌轉(zhuǎn)化表達(dá)菌株BL21(DE3)Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，特異引物菌液PCR鑒定(圖5、6)，分別命名為pET-abxH-R、pET-abxO-R，并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，蛋白樣品處理，SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析，可見明顯的誘導(dǎo)蛋白條帶(圖7)，鹵化酶分子量大小為65 kD，單加氧酶分子量大小為37 kD。

圖5 pET-abxH-J連接轉(zhuǎn)化BL21(DE3)Rosetta感受態(tài)細(xì)胞特異引物鑒定Fig.5 pET-abxH-J identification of specific primers for connecting transformed BL21(DE3)Rosetta competent cells1～22: 隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子；M: 2 000 bp DNA Marker1-22: randomly selected transformants； M: 2 000 bp DNA Marker

圖6 pET-abxO-J連接轉(zhuǎn)化BL21(DE3)Rosetta感受態(tài)細(xì)胞特異引物鑒定Fig.6 pET-abxO-J identification of specific primers for connecting transformed BL21(DE3)Rosetta competent cells1～3: 隨機(jī)挑選轉(zhuǎn)化子；M: 2 000 bp DNA Marker1-3:randomly selected transformants； M:2 000 bp DNA Marker

圖7 pET-abxH-R(A)、pET-abxO-R(B)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白質(zhì)電泳分析Fig.7 pET-abxH-R(A)，pET-abxO-R(B) induced expression protein electrophoresis analysisA：pET-abxH-R SDS-PAGE電泳圖， BSA:牛血清蛋白，分子量為66 kD，與鹵化酶大小相似，作為對照；1：誘導(dǎo)菌株蛋白表達(dá)；2：未誘導(dǎo)菌株蛋白表達(dá)；M：蛋白質(zhì)Marker。B：pET-abxO-R SDS-PAGE電泳圖, 1：誘導(dǎo)菌株蛋白表達(dá)；2：未誘導(dǎo)菌株蛋白表達(dá)；M：蛋白質(zhì)MarkerA: pET-abxH-R SDS-PAGE electrophoresis chart, BSA: bovine serum protein with a molecular weight of 66 kD, which is similar to the size of halogenase, which is a control; 1： the protein expression of the induced expression strain; 2: the protein expression of the uninduced strain; M: Protein Marker.B: pET-abxO-R SDS-PAGE electrophoresis chart, 1: the protein expression of the induced expression strain; 2: the protein expression of the uninduced strain; M: the protein Marker

3 討 論

重組質(zhì)粒pET-abxH 和pET-abxO 轉(zhuǎn)化大腸埃希菌表達(dá)菌株BL21(DE3)Rosetta感受態(tài)細(xì)胞，分別以不同的誘導(dǎo)溫度誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳分析，誘導(dǎo)的兩種蛋白可溶性表達(dá)。后續(xù)采用Ni-NTA親和層析進(jìn)行濃縮、提取，純化目的蛋白，催化通過正向硅膠柱純化鏈霉菌Streptomycessp. FXJ1.264發(fā)酵產(chǎn)物中的二型聚酮骨架化合物BE-24566B，在其骨架上插入鹵化基團(tuán)，得到了疑似鹵化產(chǎn)物峰圖，但是由于催化的不穩(wěn)定性及產(chǎn)物不唯一性，這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)壳斑€在優(yōu)化中，希望找到最優(yōu)的催化時(shí)間及催化緩沖液，得到一系列鹵化產(chǎn)物，對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并分析活性，得到一種或幾種活性較好的鹵化產(chǎn)物，為抗生素的來源提供參考。

鹵族元素具有強(qiáng)大的電負(fù)性，使得鹵化物具有良好的、多樣的生物活性。目前，鹵化物已經(jīng)在生命科學(xué)和化工生產(chǎn)中占據(jù)著不可替代的位置。截止目前，天然鹵化物的數(shù)量已超過5 000種[20]，這些鹵化物主要由微生物、海綿、高等植物和昆蟲等幾種生物產(chǎn)生，其中約95%的鹵化物為氯化物和溴化物。在全球銷售的藥品中，25%的化合物具有鹵原子[21]。一些眾所周知的藥物如氯霉素(chloroamphenicol)、萬古霉素(vancomycin)、替考拉寧(teicoplanin)、卡利奇霉素(calicheamicin)和蝴蝶霉素(rebeccamycin)等藥物在臨床上普遍應(yīng)用。此外在洗滌劑、殺蟲劑等化工品種中，鹵化物也占有很大比重。鹵化物的潛在生物活性與結(jié)構(gòu)多樣性引起了研究者越來越廣泛的關(guān)注[22-25]。

隨著基因組學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科領(lǐng)域的快速發(fā)展，通過基因篩選發(fā)掘放線菌活性天然產(chǎn)物成為可能。已有研究表明，放線菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成途徑中包含一些關(guān)鍵酶，分別用于合成不同類型的化合物骨架和進(jìn)行不同的后期修飾，使其最終成為特定結(jié)構(gòu)類型的活性化合物，而且其合成途徑中的相關(guān)基因均成簇排列，比如在放線菌基因組中，排列在約20～200 kb范圍內(nèi)。因此編碼這些關(guān)鍵酶的基因可以作為篩選靶點(diǎn)，探究菌株合成某類次級(jí)代謝產(chǎn)物的能力，并獲得相應(yīng)的次級(jí)代謝產(chǎn)物。這一技術(shù)手段已經(jīng)被用于聚酮(Polyketide)類和非核糖體肽 (Nonribosomal peptide)類化合物及其基因簇的篩選。基于PKS和NRPS基因篩選限定了目的化合物的結(jié)構(gòu)類型，不利于廣泛篩選未知化合物，而且通過PKS和NRPS途徑合成的化合物往往需要經(jīng)過后期修飾酶的結(jié)構(gòu)修飾，如環(huán)化、氧化、鹵化、內(nèi)酯化、甲基化、糖基化等，才能最終產(chǎn)生有活性的化合物。因此，后修飾酶基因篩選更有助于發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)多樣的活性化合物[26]。