正交試驗(yàn)優(yōu)化參黃洗劑的提取工藝

葛桂枝，李艷，王春艷，于桂蘭，高珊，董楊，彭麗艷

（唐山市婦幼保健院 藥劑科，河北 唐山 063000）

0 引言

女性生殖系統(tǒng)疾病中，陰道炎的發(fā)病幾率、復(fù)發(fā)性極高，是婦科炎癥中的一大類，約占婦科疾患的70%[1]。中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域劃分陰道炎至“帶下”、“陰癢”范疇，致病原理由肝脾胃功能失調(diào)，造成脾胃虛弱，引發(fā)氣、血、精生化乏源所致，加之日常生活中，患者外感風(fēng)寒、內(nèi)受邪熱，導(dǎo)致氣血不通，筋脈失養(yǎng)，從而使陰道炎發(fā)病且反復(fù)發(fā)作[2-3]。參黃洗劑為我院臨床經(jīng)驗(yàn)方，處方有苦參、黃柏、大黃、大青葉等中成藥物，處方藥性存清熱利濕、解毒化瘀、殺蟲止癢的功效，臨床常用治療各種類型的陰道炎。參黃洗劑已廣泛用于我院陰道炎患者，但由于其中藥種類較多，穩(wěn)定性不易控制，因此，研究開發(fā)中藥坐浴洗劑，對(duì)臨床用藥具有重要意義。故本文綜合考慮處方中君臣藥的藥理作用及有效成分，參考相關(guān)文獻(xiàn)后[4-10]，以正交實(shí)驗(yàn)方式，對(duì)組方做工藝優(yōu)化，為參黃洗劑在醫(yī)院進(jìn)一步擴(kuò)大生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 試藥與儀器

1.1 試藥。參黃洗劑（唐山婦幼保健院，190802-190912）自制；鹽酸小檗堿對(duì)照品（中國(guó)生物制品鑒定研究院，10805-200305）、苦參堿對(duì)照品（中國(guó)生物制品鑒定研究院，110805-200305）均為含量測(cè)定用。甲苯（天津富宇精細(xì)化工有限公司，13081161）、三氯甲烷（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，20130305）、濃氨（天津市大茂化學(xué)試劑廠，20140320）均為分析純。甲醇、乙腈均為色譜純。純化水自制。

1.2 儀器。島津高效液相色譜儀（SPD-20A，島津企業(yè)管理中國(guó)有限公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（101型，北京科技永光儀器有限公司）；恒溫水浴振蕩器（SHA-C，常州國(guó)華電器）；精密電子天平；加熱蒸發(fā)皿（采博科技有限公司）；磁力加熱攪拌器；UV-2501PC紫外分光光度儀。

2 方法與結(jié)果

2.1 指標(biāo)性成分含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 色譜柱：EclipseXOB-C18（5 μm，4.6×150 mm）；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（酸堿度6.8，50：50）（乙腈-0.1%磷酸溶液：十二烷基磺酸鈉慰問(wèn)100 mL：0.1 g）；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：227 nm；進(jìn)樣量為：20 μL。

2.1.2 溶液的配制

（1）對(duì)照品溶液配制。嚴(yán)格稱取適量的鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品及苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品分別于50 mL容量瓶中，以清水作為溶解稀釋液，溶解至適量刻度，即得相應(yīng)的對(duì)照品溶液。對(duì)上述兩種儲(chǔ)備液進(jìn)行適度量取，量取量為0.5，1，2，4，6 mL，置入10 mL容量瓶當(dāng)中，明確取樣劑量，以編號(hào)方式對(duì)各儲(chǔ)備液進(jìn)行標(biāo)注，稀釋至刻度后，將各儲(chǔ)備液進(jìn)行混合。

（2）供試品溶液配制。量取10 mL參黃洗劑，以20 mL清水對(duì)其進(jìn)行稀釋處理，添加2.5 mL濃氨試液，對(duì)三氯甲烷進(jìn)行提取，每次15 mL，振蕩搖勻，震蕩次數(shù)2次左右，使提取液充分融合，過(guò)濾，加熱蒸發(fā)皿蒸干濾液，殘?jiān)萌?0 mL量甁中，以清水進(jìn)行溶解，搖勻，0.45 μm針式過(guò)濾器濾過(guò)，續(xù)濾液即為供試品溶液。

（3）陰性樣品溶液的制備。按參黃洗劑的藥材配比取缺少苦參黃柏的其他中藥，按供試品制備方法，對(duì)苦參黃柏進(jìn)行陰性樣品處理。

2.1.3 系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn):分別取上述對(duì)照品、供試品、陰性樣品10 mL，操作方式與“2.1.1”相一致，色譜條件進(jìn)樣并對(duì)其進(jìn)行記錄，陰性樣品在苦參黃柏兩處無(wú)吸收峰。

圖1 苦參堿和小檗堿HPLC圖（A.對(duì)照品溶液；B.陰性對(duì)照；C.供試品溶液：1.苦參堿，2.小檗堿）

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：量取鹽酸小檗堿標(biāo)準(zhǔn)品、苦參堿標(biāo)準(zhǔn)品及不同濃度混合對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”操作方式行檢測(cè)，X為對(duì)照品進(jìn)樣量，Y為峰面積值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。曲線方程分別為：Y=1.4395×104X-2.7464×103，r=0.9996；Y=4.2921×105X+1.9126×103，r=0.9999，苦參堿的濃度在0.15～4.2 μg·mL-1、鹽酸小檗堿在0.4～4.8 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗(yàn)：量取混合對(duì)照品溶液，按照“2.1.1”操作方式，共實(shí)施操作8次，對(duì)小檗堿和苦參堿兩種成分的峰面積RSD為0.65%和0.75%進(jìn)行計(jì)算匯總。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn)：取參黃洗劑樣品6份，分別參考“2.1.3”操作方式，對(duì)供試品溶液進(jìn)行配制，進(jìn)樣測(cè)定并記錄峰面積，小檗堿平均含量2.477 g·L-1和苦參堿平均含量0.4658 g·L-1，其RSD值分別為1.3%和1.6%（n=6）。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取上述供試液1份，分別在0，2，4，8，12，24進(jìn)樣1次，小檗堿RSD為0.6%，苦參堿RSD為0.7%，提示供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定可控。

2.2 正交實(shí)驗(yàn)。參考中藥提取相關(guān)文獻(xiàn)為背景，選用提取液中君臣藥鹽酸小檗堿、苦參堿2兩種指標(biāo)性性成分并計(jì)算干膏得率，進(jìn)行以提取次數(shù)、浸泡溫度（℃）、浸泡時(shí)間（h）、料液比（g·mL-1）為考察因素的單因素分析試驗(yàn)。根據(jù)單因素分析實(shí)驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素水平表內(nèi)容如表1，各因素對(duì)參黃洗劑提取率影響順序?yàn)椋篋＞C＞A＞B。由表3的極差結(jié)果可知，A，B，C必需選擇對(duì)正交結(jié)果影響最高的水平。綜合K值與R值，最佳提取工藝為：A2B2C3D2，即2次提取，40℃浸泡，共浸泡2 h，料液比1:10（g· mL-1），詳見表1、表2和表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表3 方差分析結(jié)果

2.3 最佳提取工藝的驗(yàn)證。根據(jù)優(yōu)選方案，開展平行提取3次，比對(duì)可見，提取量指標(biāo)均較為良好，表2正交試驗(yàn)結(jié)果匯總，組合測(cè)得指標(biāo)值，平行實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)之間無(wú)明顯差異重現(xiàn)性理想，詳見表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)

3 討論

以唐山婦幼保健院治療陰道炎的參黃洗劑配方作為本次研究?jī)?nèi)容。現(xiàn)今醫(yī)療領(lǐng)域中，陰道炎疾病治療用藥藥物劑型多為栓劑、膏劑，患者在用藥過(guò)程中，存使用不便，污染衣物等情況，對(duì)患者日常生活、工作存在影響性。而參黃洗劑用于陰道炎治療相比于其他類型制劑具有直接接觸病灶，使用方便簡(jiǎn)單，適合患者家中使用，因此本研究針對(duì)中藥材活性成分提取，并就提取率以正交試驗(yàn)方式，篩選最佳水提工藝，使方劑更好的應(yīng)用于患者。

君、臣、佐、使等是對(duì)中藥材在中醫(yī)組方特征及地位的劃分。但在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中，中藥成分、所含物質(zhì)等存復(fù)雜性，藥性及用藥效果具有多面性，加之對(duì)部分中成藥物藥效、藥性等尚不清楚，因此在中藥制劑質(zhì)量分析中，首選君藥、臣藥，進(jìn)行研究分析。該實(shí)驗(yàn)選取了指標(biāo)性成分苦參、黃柏。

通過(guò)正交試驗(yàn)最終以提取2次，浸泡溫度40℃，浸泡2 h，料液比1:10（g· mL-1），合并兩次煎液，濾過(guò)，藥材提取液濃縮至1000 mL。得出：制備工藝穩(wěn)定及可行性強(qiáng)，為參黃洗劑更好工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。