貴紫麥1號(hào)紫粒性狀的遺傳規(guī)律及基因定位

董亞兵， 何 方， 彭亞姝， 徐如宏， 錢(qián)小康， 任明見(jiàn)

(1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院/國(guó)家小麥改良中心貴州分中心， 貴陽(yáng) 550025；2.遵義市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局， 貴州 遵義 563000)

紫色小麥?zhǔn)且活?lèi)花青素在種皮中累積而表現(xiàn)出紫色、紫紅色、紫黑色等的小麥品種[1]。研究表明，花青素能夠抗氧化、抗衰老及抑制心腦血管疾病的發(fā)生[2-5]等。紫色小麥富含花青素，作為特殊種質(zhì)資源具有較大的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值[6]。

紫粒小麥的種子因花青素的存在使種皮顏色呈現(xiàn)紫色[7]。種皮是由母體組織發(fā)育而來(lái)，所以母本基因型決定其紫粒色素，紫粒色素基因呈現(xiàn)母性遺傳且由細(xì)胞核基因控制[8]。國(guó)內(nèi)外對(duì)紫色小麥的紫粒性狀遺傳研究存在多種觀點(diǎn)，李楠楠[9]研究表明，紫粒性狀的遺傳受一對(duì)顯性基因或兩對(duì)顯性互補(bǔ)基因控制，并具有劑量效應(yīng)。錢(qián)小康[10]、黃碧光[11]、孫群等[12]研究表明，紫粒性狀分別受兩對(duì)不完全顯性互補(bǔ)基因、重復(fù)基因、兩個(gè)相互獨(dú)立基因和三個(gè)基因控制。紫色小麥的紫粒性狀遺傳復(fù)雜性受遺傳背景和環(huán)境條件的影響。不同紫色小麥材料之間，紫粒性狀的遺傳特性具有較大的差異[13-15]。

通過(guò)全基因組水平上掃描并檢測(cè)與重要性狀相關(guān)的基因序列差異和結(jié)構(gòu)變異可進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析[16-17]，也可利用多態(tài)性差異開(kāi)發(fā)新分子標(biāo)記對(duì)重要性狀基因進(jìn)行精細(xì)定位及候選基因預(yù)測(cè)[18]。集團(tuán)分離分析法(Bulked Segregation Analysis，BSA)通過(guò)一對(duì)親本重組交換得到的分離群體中選取一定數(shù)量的植株，對(duì)目標(biāo)基因的不同表型進(jìn)行鑒別，形成兩個(gè)亞群體或群體[19]。將每組等量的DNA混合形成兩個(gè)相對(duì)性狀的基因庫(kù)，選擇合適的分子標(biāo)記對(duì)兩個(gè)基因庫(kù)進(jìn)行分析，將兩組之間顯示多態(tài)性的分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀的基因進(jìn)行連接[20-22]。孫磊[23]基于群體基因組重測(cè)序開(kāi)發(fā)的SNP標(biāo)記構(gòu)建了高密度遺傳圖譜,并進(jìn)行了葡萄果實(shí)顏色QTL定位,結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序從QTL定位區(qū)間篩選到多個(gè)候選基因,并對(duì)個(gè)別候選基因進(jìn)行了初步功能驗(yàn)證。曾偉偉[24]采用全基因組重測(cè)序技術(shù)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記，對(duì)小麥莖稈發(fā)育調(diào)控基因qd1進(jìn)行精細(xì)定位和克隆，將小麥莖稈發(fā)育調(diào)控基因qd1定在4 B染色體上，其遺傳距離為0.29 cM。劉書(shū)林等[25]采用集團(tuán)分離分析法(BSA)結(jié)合全基因組重測(cè)序結(jié)果開(kāi)發(fā)新標(biāo)記，將目的基因定位在4號(hào)染色體上。

貴紫麥1號(hào)是2015年通過(guò)貴州省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定的紫粒小麥品種(黔審麥2015003)。本研究通過(guò)常規(guī)遺傳分析方法與全基因組重測(cè)序技術(shù)結(jié)合集團(tuán)分離分析策略進(jìn)行紫粒性狀的遺傳規(guī)律和基因定位研究，為紫色小麥紫粒性狀目的基因的克隆、遺傳轉(zhuǎn)化及功能驗(yàn)證提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用材料貴紫麥1號(hào)(黔審麥2015003)(紫粒)、貴農(nóng)19號(hào)(黔審麥2007004)、貴農(nóng)麥30號(hào)(黔審麥2015002)，均由貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院國(guó)家小麥改良中心貴州分中心自主選育并提供。

1.2 遺傳群體構(gòu)建

貴紫麥1號(hào)分別與白粒小麥品種貴農(nóng)19號(hào)、貴農(nóng)麥30號(hào)進(jìn)行正反交獲得F1代。將收獲的F1代單株進(jìn)行套袋自交獲得F2代群體，同時(shí)開(kāi)展回交獲得BC1F1群體。并采用單籽粒傳法將F2代群體通過(guò)加代自交獲得F3、F4、F5代群體。于2021年3月分蘗后期對(duì)F5代單株進(jìn)行掛牌編號(hào)，剪取葉片，采用CTAB法提取DNA置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 遺傳規(guī)律分析

利用色選機(jī)將F1、F2～F5及BC1F1各世代群體根據(jù)籽粒顏色進(jìn)行區(qū)分和登記。統(tǒng)計(jì)F1、F2、F3、BC1F1群體各個(gè)組合紫粒和白粒的比例，分析紫粒基因的遺傳規(guī)律。

1.4 開(kāi)發(fā)標(biāo)記及群體驗(yàn)證

根據(jù)F5代群體粒色深淺將群體劃分為極紫、深紫、中紫、淺紫、淺色、白色等6個(gè)等級(jí)。在貴紫麥1號(hào)和貴農(nóng)麥30號(hào)雜交組合中，從6個(gè)粒色類(lèi)群中分別選取極紫和白色單株各30株，采用DNA基因組試劑盒提取DNA。將DNA進(jìn)行等量混合構(gòu)建紫、白兩個(gè)極端混池，將混池和雙親DNA提供給深圳華大基因股份有限公司進(jìn)行全基因組重測(cè)序檢測(cè)。

基于重測(cè)序檢測(cè)結(jié)果共開(kāi)發(fā)出517對(duì)InDel標(biāo)記，分子標(biāo)記全部由上海生物工程股份有限公司合成。將517對(duì)分子標(biāo)記在混池及雙親中進(jìn)行檢測(cè)，獲得特異性標(biāo)記。利用特異性標(biāo)記在定位研究群體中進(jìn)行驗(yàn)證。研究群體中的DNA提取參照彭琴等[26]等改良的CTAB法進(jìn)行基因組提取。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 10 μL PCR反應(yīng)體系

PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，退火溫度依引物設(shè)計(jì)而定，退火50 s，72 ℃延伸45 s，其中變性、退火、延伸3個(gè)步驟共35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用10%的非變性聚丙烯凝膠電泳，通過(guò)銀染顯影后在白熾燈下進(jìn)行拍照保存，統(tǒng)計(jì)擴(kuò)增條帶。

2 結(jié)果與分析

2.1 世代群體紫粒性狀的表現(xiàn)

利用貴紫麥1號(hào)與貴農(nóng)19號(hào)、貴農(nóng)麥30號(hào)，通過(guò)組配正反交組合(貴紫麥1號(hào)×貴農(nóng)麥30號(hào)、貴農(nóng)麥30號(hào)×貴紫麥1號(hào)；貴紫麥1號(hào)×貴農(nóng)19號(hào)、貴農(nóng)19號(hào)×貴紫麥1號(hào))以構(gòu)建正反交F1、F2、F3和BC1F1代群體。分別對(duì)各世代群體籽粒的顏色性狀進(jìn)行鑒定與統(tǒng)計(jì)(表2)。

表2 雜交后代群體籽粒顏色性狀的表現(xiàn)

由表2可知，F(xiàn)1代籽粒的顏色與母本相同，F(xiàn)2世代籽粒的顏色均表現(xiàn)為淺紫色，F(xiàn)3世代籽粒顏色發(fā)生分離。通過(guò)F1代與紫粒親本回交，后代籽粒顏色均為紫色；F1代與白粒親本回交，后代籽粒顏色發(fā)生分離現(xiàn)象。結(jié)果表明，貴紫麥1號(hào)的紫粒性狀由顯性基因控制。

2.2 貴紫麥1號(hào)與貴農(nóng)麥30號(hào)雜交后代群體籽粒顏色的分析

利用貴紫麥1號(hào)與白粒小麥貴農(nóng)麥30號(hào)進(jìn)行正反交，鑒定并統(tǒng)計(jì)其正反交F3及回交群體的籽粒顏色。通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析紫粒與白粒的分離比例(表3)。

表3 貴紫麥1號(hào)與貴農(nóng)麥30號(hào)雜交后代群體籽粒顏色的分離情況

由表3可知，群體中紫粒與白粒的分離比例符合1∶3；F3群體中紫粒與白粒的分離比例符合9∶7。F1代與白粒親本回交，后代群體籽粒顏色發(fā)生分離現(xiàn)象，紫粒與白粒的分離比例均符合1∶3；F1代與紫粒親本回交，后代群體籽粒顏色均表現(xiàn)為紫色。正反交F3世代中紫粒與白粒的分離比例均符合9∶7，表明貴紫麥1號(hào)的紫粒性狀受兩對(duì)顯性互補(bǔ)基因控制。

2.3 貴紫麥1號(hào)與貴農(nóng)19號(hào)雜交后代群體籽粒顏色的分析

利用貴紫麥1號(hào)與貴農(nóng)19號(hào)進(jìn)行正反交，鑒定并統(tǒng)計(jì)其正反交F3世代及回交群體的籽粒顏色。通過(guò)卡方檢驗(yàn)分析紫粒與白粒的分離比例(表4)。

表4 貴紫麥1號(hào)與貴農(nóng)19號(hào)雜交后代群體籽粒顏色的分離情況

由表4可知，群體中紫粒與白粒的分離比例符合1∶3；F3群體中紫粒與白粒的分離比例符合9∶7。F1與白粒親本回交，后代群體籽粒顏色發(fā)生分離現(xiàn)象，紫粒與白粒的分離比例均符合1∶3；F1與紫粒親本回交，后代群體籽粒顏色均表現(xiàn)為紫色。正反交F3世代中紫粒與白粒的分離比例均符合9∶7，表明貴紫麥1號(hào)的紫粒性狀受兩對(duì)顯性互補(bǔ)基因控制。

2.4 紫粒性狀基因的遺傳模式

根據(jù)貴紫麥1號(hào)與白粒小麥(貴農(nóng)19號(hào)或貴農(nóng)麥30號(hào))雜交后代群體籽粒顏色的分離情況分析，貴紫麥1號(hào)的紫粒性狀由兩對(duì)顯性的互補(bǔ)基因控制。當(dāng)兩對(duì)顯性基因共同存在時(shí)，貴紫麥1號(hào)的籽粒顏色方表現(xiàn)為紫色，當(dāng)僅有一對(duì)顯性基因或?yàn)殡p純和隱性基因時(shí)，籽粒顏色為白色。假設(shè)紫粒小麥品種貴紫麥1號(hào)的基因型為AABB，白粒小麥品種貴農(nóng)麥30號(hào)和貴農(nóng)19號(hào)的基因型為aabb，其遺傳模式見(jiàn)圖1。

2.5 紫?；蚨ㄎ患叭后w驗(yàn)證

2.5.1重測(cè)序結(jié)果分析

采用全基因組重測(cè)序技術(shù)分別對(duì)紫、白兩個(gè)混池及其親本進(jìn)行全基因組檢測(cè)。經(jīng)數(shù)據(jù)處理分析表現(xiàn)差異的InDel共有123 086個(gè)，通過(guò)數(shù)據(jù)過(guò)濾處理發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)出差異的InDel共有16 465個(gè)，將表現(xiàn)出差異的InDel整合至21條染色體上(圖2)。大量差異InDel位點(diǎn)分布在2 A、6 A、1 B、2 B、3 B、5 B、6 B、7 B和7 D等9條染色體上，以上9條染色體中的InDel約占總InDel數(shù)量的67%。結(jié)果表明，貴紫麥1號(hào)的紫?；蚝芸赡艽嬖谟谶@9條染色體上。

為探究貴紫麥1號(hào)紫粒基因確切位置，需進(jìn)一步分析這9條染色體上的InDel分布密度，再根據(jù)InDel的數(shù)量及密度判定貴紫麥1號(hào)紫?；虻乃谖恢谩；谥販y(cè)序數(shù)據(jù)分析，染色體2 A和7 D中的InDel較于染色體6 A、1 B、2 B、3 B、5 B、6 B和7 B相對(duì)集中分布(圖3)，可初步判定貴紫麥1號(hào)的紫粒基因存在于2 A和7 D染色體上，其物理區(qū)間分別為673～698 Mb和581～601 Mb。

2.5.2多態(tài)性標(biāo)記篩選及群體驗(yàn)證

將517對(duì)InDel標(biāo)記在紫白混池和雙親中進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，在2 A和7 D兩條染色體共獲得多態(tài)性標(biāo)記39對(duì)，其中2 A染色體包括chr 2 A 26、chr 2 A 25、chr 2 A 37、chr 2 A 28、chr 2 A 34、chr 2 A 32、chr 2 A 16、chr 2 A 20、chr 2 A 1、chr 2 A 2、chr 2 A 27、chr 2 A 38、PP 1、PP 2、2 A 5、2 A 8、2 A 296、DY-2 A 5、DY-2 A 6和DY-2 A 7等20對(duì)多態(tài)性標(biāo)記；7 D染色體包括chr 7 D 5、chr 7 D 6、chr 7 D 15、chr 7 D 14、chr 7 D 19、chr 7 D 43、chr 7 D 25、chr 7 D 48、chr 7 D 20、chr 7 D 7、chr 7 D 12、chr 7 D 24、chr 7 D 35、chr 7 D 37、chr 7 D 33、DY-7 D 1、DY-7 D 6、DY-7 D 8和DY-7 D 10等19對(duì)多態(tài)性標(biāo)記。

利用JoinMap 4.0軟件對(duì)分離群體的紫粒性狀和分子標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖計(jì)算，獲取其遺傳距離。遺傳連鎖圖譜采用MapChat 4.0軟件進(jìn)行繪制。結(jié)果表明，控制貴紫麥1號(hào)紫粒性狀的一對(duì)顯性基因存在于2 AL和7 DL染色體上。2 A染色體中的紫粒基因GZMPp1與標(biāo)記chr 2 A 32的遺傳距離為1.2 cM。7 D染色體上的紫粒基因GZMPp2與標(biāo)記DY-7 D 6的遺傳距為0.5 cM。

2.6 候選基因功能注釋

根據(jù)基因定位結(jié)果，在定位區(qū)間內(nèi)進(jìn)行候選基因查詢。對(duì)每個(gè)基因的分子功能進(jìn)行鑒定。在2 AL染色體的定位區(qū)間內(nèi)共找到2個(gè)與花青素合成途徑相關(guān)的功能注釋基因，基因功能注釋為bHLH protein。在7 DL染色體定位區(qū)間內(nèi)共找到5個(gè)與花青素合成途徑相關(guān)的功能注釋基因，基因功能注釋為MYB-related transcription factor。運(yùn)用NCBI網(wǎng)站將兩條染色體上的7條候選基因進(jìn)行查詢均與花青素合成代謝相關(guān)。

表5 貴紫麥1號(hào)定位區(qū)間內(nèi)候選基因功能注釋

3 討 論

本研究以貴紫麥1號(hào)(紫粒)分別與貴農(nóng)19號(hào)和貴農(nóng)麥30號(hào)(白粒)進(jìn)行正反交及回交。通過(guò)對(duì)籽粒顏色統(tǒng)計(jì)，以紫粒小麥為母本與白粒小麥雜交，其F1世代籽粒顏色為紫色；以白粒小麥為母本與紫粒小麥雜交，其F1世代籽粒的顏色為白色，因此，F(xiàn)1世代籽粒的顏色始終與母本一致。F2世代籽粒的顏色均為淺紫色。結(jié)果表明，貴紫麥1號(hào)的紫粒性狀在種皮中表現(xiàn)，種皮是由珠被發(fā)育而來(lái)。因此，種皮顏色的表達(dá)由上一代植株的基因型控制且紫粒性狀表現(xiàn)為顯性。關(guān)于紫色小麥的紫粒性狀遺傳規(guī)律國(guó)內(nèi)很早便展開(kāi)了研究，歐俊梅等[27]在紫粒小麥漯珍1號(hào)的研究中，經(jīng)過(guò)卡方測(cè)驗(yàn)，F(xiàn)2群體中紫粒與白粒的分離比例符合9∶7，而F1代與白粒親本回交后紫粒與白粒的分離比為1∶3，結(jié)果表明，漯珍1號(hào)品種的紫粒性狀是由兩個(gè)完全顯性的基因共同決定。徐丙元[28]在紫粒小麥漯珍1號(hào)的研究中發(fā)現(xiàn)，漯珍1號(hào)的紫粒性狀同樣由兩個(gè)完全顯性的基因獨(dú)立決定。針對(duì)貴紫麥1號(hào)在F3代中籽粒顏色發(fā)生分離現(xiàn)象研究中，結(jié)果表明，貴紫麥1號(hào)的紫粒性狀由兩對(duì)顯性互補(bǔ)基因控制，當(dāng)兩個(gè)顯性基因共同存在時(shí)，貴紫麥1號(hào)的籽粒顏色表現(xiàn)為紫色，當(dāng)只有一個(gè)顯性基因或純隱形基因時(shí)，籽粒顏色為白色。表明，兩顯性基因間存在相互作用的結(jié)果。不同來(lái)源的紫粒小麥研究結(jié)果與本研究結(jié)果一致[29]。也有研究表明，不同來(lái)源的紫粒小麥的紫粒性狀是由一個(gè)完全顯性基因決定的[30-31]。畢嬋，尤明山[17]在紫粒小麥的研究中發(fā)現(xiàn)，紫麥農(nóng)大3753的籽粒顏色為顯性單基因控制，且將紫粒基因定位在7 D染色體上[32]。綜上表明，其原因極有可能是不同生長(zhǎng)環(huán)境的影響，紫粒小麥種皮中花色素的合成不僅受遺傳物質(zhì)的控制，而且還會(huì)受到光照和溫度等環(huán)境因素的影響[33-35]。環(huán)境因素通過(guò)影響花青素的積累，從而影響紫粒小麥紫粒顏色的表型，干擾了研究者對(duì)紫粒性狀的觀察統(tǒng)計(jì)，從而導(dǎo)致不同的研究結(jié)果[36]。

基于全基因組重測(cè)序及特異性標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果，將控制貴紫麥1號(hào)紫粒性狀的兩個(gè)互補(bǔ)顯性基因分別位于2 AL和7 DL染色體上。根據(jù)基因定位結(jié)果，在2 AL和7 DL染色體定位區(qū)間內(nèi)共找到7個(gè)與花青素合成途徑相關(guān)的功能注釋基因[37-38]，基因功能注釋為bHLH protein和MYB-related transcription factor[39]。王偉偉等[40]、葉廣繼等[41]研究發(fā)現(xiàn)，bHLH和MYB轉(zhuǎn)錄因子均可調(diào)控花青素的合成代謝。經(jīng)過(guò)NCBI查詢7個(gè)候選基因位置與重測(cè)序候選物理區(qū)間重疊，表明控制貴紫麥1號(hào)紫?；蛟谶@7個(gè)候選基因內(nèi)。