hENT-1表達(dá)水平對(duì)胰腺癌吉西他濱輔助化療的影響

陳垚宇，王 喆，王 昭，荊 鑫，張 強(qiáng)

（1.珠海市人民醫(yī)院普通外科，廣東 珠海 519000；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院肝膽胰脾外科）

全世界每年因?yàn)橐认侔┒劳龅娜藬?shù)大于200，000例[1]。我國(guó)最新的統(tǒng)計(jì)報(bào)告指出，每年發(fā)病人數(shù)接近10萬(wàn)人，其中男性和女性分別約為5.4萬(wàn)人和4.1萬(wàn)人。而死亡人數(shù)更達(dá)到了8.4萬(wàn)，男性約為4.8萬(wàn)和女性約為3.6萬(wàn)[2]。其進(jìn)展快且隱匿，許多病人發(fā)病早期沒(méi)有任何癥狀，一旦出現(xiàn)腹痛、黃疸、貧血等癥狀時(shí)，病情可能達(dá)到晚期，從而喪失根治性手術(shù)機(jī)會(huì)，超過(guò)半數(shù)患者無(wú)法接受根治手術(shù)[3]。由于該病惡性度高、預(yù)后極差，為防止癌細(xì)胞殘留或癌癥復(fù)發(fā)，術(shù)后應(yīng)采取輔助化療。臨床上通常選用較5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）副作用少的吉西他濱（Gemcitabine，GEM）進(jìn)行輔助化療[4，5]。隨著臨床應(yīng)用，人們逐漸發(fā)現(xiàn)GEM輔助化療個(gè)體間的效果不盡相同。一些胰腺癌組織對(duì)GEM化療敏感性欠佳，可能導(dǎo)致部分病人僅獲得有限的效果。因?yàn)閔ENT-1是介導(dǎo)GEM進(jìn)入腫瘤細(xì)胞的主要運(yùn)載體，所以部分學(xué)者認(rèn)為其表達(dá)水平可能影響GEM輔助化療敏感性[6]。

人類(lèi)平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)體-1（Human equilibrative nucleoside transporter-1，hENT-1）是具有疏水α-螺旋結(jié)構(gòu)的跨膜蛋白[7，8]。該轉(zhuǎn)運(yùn)體除在許多正常組織中分布外，亦在腫瘤中差異表達(dá)[21～25]。它不僅幫助轉(zhuǎn)運(yùn)人體基本生理生化反應(yīng)過(guò)程中所需物質(zhì)，而且具備了轉(zhuǎn)運(yùn)核苷類(lèi)藥物的能力。親水性核苷類(lèi)藥物GEM不能通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散的方式穿過(guò)細(xì)胞膜，所以需要依賴(lài)hENT-1進(jìn)入胞漿[9]，以發(fā)揮抑制腫瘤生長(zhǎng)效果。

理論上GEM可顯著提高胰腺癌病人的總生存期及無(wú)病生存期。但臨床上其療效卻有著明顯的差異，GEM敏感性差是延長(zhǎng)病人OS和DFS的主要困難。至此，全世界學(xué)者們都在研究造成其敏感性不一的原因。可惜，時(shí)至今日，有關(guān)hENT-1是否影響胰腺癌GEM輔助化療敏感性的研究結(jié)論并未形成統(tǒng)一。如Farrell[6]認(rèn)為hENT-1表達(dá)水平與胰腺癌GEM輔助化療敏感性相聯(lián)系，可影響病人的OS以及DFS。但是，Poplin[10]等學(xué)者則認(rèn)為hENT1低表達(dá)對(duì)GEM化療敏感性無(wú)影響，病人之間的OS未見(jiàn)明顯差異。由于國(guó)內(nèi)有關(guān)hENT-1的研究缺乏，且此研究區(qū)域暫無(wú)有關(guān)文獻(xiàn)，故此次研究具有一定意義。

筆者對(duì)近5年附屬醫(yī)院胰腺癌GEM輔助化療的患者采取回顧性分析，并經(jīng)免疫組織化學(xué)手段測(cè)定胰腺癌組織中hENT1的表達(dá)水平，最后對(duì)相應(yīng)預(yù)后情況作出對(duì)比分析。

1 試劑與儀器

1.1 試劑

PBS緩沖液、DAB顯色液、中性樹(shù)膠、乙醇、修復(fù)液、蘇木素染色劑、兔多克隆抗hENT-1抗體等。

1.2 儀器

切片機(jī)、烤片機(jī)、展片臺(tái)、光學(xué)顯微鏡、顯微鏡攝像系統(tǒng)、冰箱、溫箱。

1.3 組織標(biāo)本

近5年附屬醫(yī)院55例胰腺導(dǎo)管腺癌切片。

2 病例收集及觀察指標(biāo)

2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

入選標(biāo)準(zhǔn)：（1）行胰腺癌根治術(shù)后，病理學(xué)診斷為導(dǎo)管腺癌；（2）未行新輔助放、化療；（3）經(jīng)GEM為主輔助化療；（4）滿(mǎn)足免疫組織化學(xué)手段標(biāo)本；（5）臨床資料，如年齡、性別、民族、飲酒情況、腫瘤位置、腫瘤大小、病理級(jí)別、TNM分期、術(shù)式無(wú)明顯缺失；（6）無(wú)較為嚴(yán)重的并發(fā)癥；（7）隨訪至2020.01.01。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）患有嚴(yán)重心、肺、腦、腎、免疫缺陷等基礎(chǔ)疾病；（2）腫瘤晚期或TxNxM1，無(wú)法行根治術(shù)；（3）病人失訪或拒絕規(guī)律隨訪病情。

2.2 觀察指標(biāo)

（1）經(jīng)免疫組化后hENT-1的染色強(qiáng)度、范圍；（2）總體生存期和無(wú)病生存期；（3）年齡、性別、民族等情況；（4）腫瘤位置及直徑、術(shù)式、病理級(jí)別、TNM分期。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 制作胰腺癌切片

3.2 免疫組化染色

按順序進(jìn)行：脫蠟→水化→抗原修復(fù)→去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶→封閉→孵育一抗→孵育二抗→DAB顯色→蘇木素復(fù)染→分化→返藍(lán)→脫水→透明→封片。

3.3 免疫組織化學(xué)評(píng)分

將染色強(qiáng)度分為4級(jí)，利用同一切片中淋巴細(xì)胞的著色度進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，3分即強(qiáng)著色，腫瘤細(xì)胞的染色程度高于淋巴細(xì)胞；2分即中等著色，兩種細(xì)胞染色程度一致；1分即淺著色，腫瘤細(xì)胞的染色程度弱于淋巴細(xì)胞；0分即無(wú)著色。而染色范圍計(jì)分即評(píng)估單張切片范圍內(nèi)著色的腫瘤細(xì)胞占該切片總腫瘤細(xì)胞的比例，4分：＞50%陽(yáng)性，3分：26%～50%陽(yáng)性；2分：11%～25%陽(yáng)性；1分：≤10%陽(yáng)性；0分：細(xì)胞呈陰性或比例＜1%。最終，hENT-1染色水平評(píng)分由上述兩項(xiàng)相加，強(qiáng)陽(yáng)性（++）：≥7分；陽(yáng)性（+）：5～6分；弱陽(yáng)性（+-）：3～4分；陰性（-）：＜2分。低表達(dá)組由陰性及弱陽(yáng)性組組成，高表達(dá)組則由陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性組組成。

4 醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 20.0分析，正態(tài)分布數(shù)值以（±s）表示，計(jì)量資料采用方差分析或t檢驗(yàn)。而計(jì)數(shù)資料應(yīng)用卡方檢驗(yàn)以及Fisher精確檢驗(yàn)（當(dāng)期望值＜5時(shí)）。以Kaplan-Meier生存曲線(xiàn)分析OS和DFS與hENT-1表達(dá)水平的相關(guān)性。病人的獨(dú)立預(yù)后因素分別以Log-rank檢驗(yàn)及Cox regression模型進(jìn)行分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α＝0.05，P＜0.05即差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

5 結(jié)果

5.1 hENT-1表達(dá)水平與病人預(yù)后的單因素生存分析

經(jīng)Kaplan-Meier分析后示，hENT-1高表達(dá)組與低表達(dá)組的中位OS分別是20個(gè)月對(duì)10個(gè)月（見(jiàn)圖1），而DFS是15個(gè)月對(duì)6個(gè)月（見(jiàn)圖2）。hENT-1高表達(dá)組的OS及DFS明顯優(yōu)于低表達(dá)組。

圖1 hENT-1表達(dá)水平與OS的KM生存曲線(xiàn)

圖2 hENT-1表達(dá)水平與DFS的KM生存曲線(xiàn)

5.2 hENT-1表達(dá)水平與病人預(yù)后的多因素生存分析

經(jīng)Cox regression分析臨床資料中的變量后，其結(jié)果表明OS的獨(dú)立預(yù)后因素是hENT-1表達(dá)水平、病理級(jí)別和淋巴轉(zhuǎn)移情況（P＜0.05）。DFS的獨(dú)立預(yù)后因素是hENT-1表達(dá)水平和病理級(jí)別（P＜0.05）。

5.3 臨床資料與hENT-1表達(dá)水平

hENT-1表達(dá)水平分別與計(jì)量資料（病人年齡、腫瘤直徑）經(jīng)t檢驗(yàn)后，暫無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），以及與計(jì)數(shù)資料（性別、民族、飲酒情況、腫瘤位置和病理等級(jí)）行χ2檢驗(yàn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，臨床資料與hENT-1蛋白表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性，暫不能認(rèn)為其對(duì)hENT-1表達(dá)水平有影響。

6 討論

指南指出[12]，GEM是胰腺癌輔助化療的一線(xiàn)藥物?；旧δ芷椒€(wěn)的病人術(shù)后應(yīng)積極使用GEM輔助化療。但是，化療前未知GEM化療敏感情況時(shí)，很難制訂最佳的化療方案。若有標(biāo)記物能夠預(yù)測(cè)胰腺腫瘤對(duì)GEM輔助化療敏感性，可為化療藥物選擇提供思路，從而制訂個(gè)體治療方案。本研究發(fā)現(xiàn)hENT-1高表達(dá)病人比低表達(dá)病人使用GEM輔助化療生存期更長(zhǎng)、敏感性更高，對(duì)GEM耐藥的可能性更低。而且，在GEM輔助化療下，其OS的獨(dú)立預(yù)后因素是hENT-1表達(dá)水平、病理級(jí)別和淋巴轉(zhuǎn)移情況（P＜0.05）。而DFS的獨(dú)立預(yù)后因素是hENT-1表達(dá)水平和病理級(jí)別（P＜0.05）。因此根據(jù)hENT-1表達(dá)水平預(yù)測(cè)胰腺癌術(shù)后GEM輔助化療效果有一定意義。但是，過(guò)往研究表明有爭(zhēng)議發(fā)生。Farell[6]等學(xué)者發(fā)現(xiàn)GEM組hENT-1表達(dá)與病人OS和DFS相關(guān)，而5-FU組則未見(jiàn)相關(guān)性，但該實(shí)驗(yàn)將免疫組化染色結(jié)果分為3個(gè)等級(jí)，即＞50%腫瘤細(xì)胞染色的為高染色；＜50%染色者為無(wú)染色；介于兩者之間的為低染色。但上述分級(jí)方法忽略了染色強(qiáng)度深淺的情況。幾年后，Marechal等[13]也發(fā)現(xiàn)接受GEM化療的病人，hENT-1高表達(dá)與更長(zhǎng)的生存期顯著相關(guān)（HR 0.34，P＜0.05），而未接受輔助化療的病人以及其他化療組無(wú)上述情況。而且，hENT-1是GEM輔助化療預(yù)后的獨(dú)立影響因素。由于胰腺癌復(fù)發(fā)率高，術(shù)后基本生命功能平穩(wěn)的病人鮮有不進(jìn)行輔助化療的，且不接受輔助化療病人無(wú)法追蹤，所以本研究無(wú)法構(gòu)建非化療組，該方向研究需等待下一階段進(jìn)行。Marechal[13]及Oba[15]都認(rèn)為hENT-1高表達(dá)病人更應(yīng)選擇GEM行輔助化療，因?yàn)楦弑磉_(dá)者獲益更多。對(duì)于hENT-1低表達(dá)的病人，有學(xué)者[14]認(rèn)為不應(yīng)采取GEM作為化療方案的主要藥物，因?yàn)榈捅磉_(dá)的病人術(shù)后使用GEM化療所獲得的效果欠佳。而5-FU相比之下具有更好的獲益，并且ESPAC-3試驗(yàn)[14]亦證實(shí)這一點(diǎn)。

雖然hENT-1表達(dá)水平與胰腺癌GEM輔助化療療效具有相關(guān)性的觀點(diǎn)獲得以上研究支持，但仍有不少學(xué)者對(duì)此作出反對(duì)。如Fisher等[16]指出在GEM輔助化療中，hENT-1高表達(dá)水平者與OS無(wú)關(guān)，無(wú)法作為主要標(biāo)記物來(lái)預(yù)測(cè)該藥化療敏感性。Ormanns等[11]則 利 用AIO-PK0104的 臨 床 資 料 進(jìn) 行兩次實(shí)驗(yàn)，所有結(jié)果均無(wú)法支持hENT-1可以作為預(yù)測(cè)性生物標(biāo)記物。除此之外，一些學(xué)者[17，18]甚至懷疑hENT-1表達(dá)與GEM敏感性存在差異可能與免疫組化中所選擇的hENT-1抗體種類(lèi)有關(guān)，如SP120兔抗體對(duì)測(cè)定的hENT-1表達(dá)水平可能存在缺陷。針對(duì)該情況，Kalloger等[19]認(rèn)為10D7G2單克隆抗體和SP120多克隆抗體，均可檢測(cè)出hENT-1的表達(dá)水平。而且，兩者可相互補(bǔ)充某種有意義的信息，令研究對(duì)象分層更加全面，如療效的分層。

本研究探討胰腺癌hENT-1表達(dá)水平對(duì)吉西他濱輔助化療的影響，所入組的病人均接受胰腺癌根治術(shù)，并排除了其他明顯影響生存期的疾病。筆者認(rèn)為同時(shí)使用10D7G2單克隆抗體和SP120多克隆抗體進(jìn)行測(cè)定可以更全面地對(duì)病人hENT-1表達(dá)水平作出準(zhǔn)確的評(píng)估。但是由于10D7G2國(guó)內(nèi)無(wú)大量生產(chǎn)，以至獲取困難，故本次研究?jī)H選用SP120多克隆抗體。本次染色評(píng)分綜合染色強(qiáng)度及范圍，可大大減少因顯色條件差而產(chǎn)生的誤判，臨床上采用該方法具有確切意義。本次研究所覆蓋到的范圍有限，無(wú)法對(duì)全國(guó)不同地區(qū)人群展開(kāi)研究。今后仍需各位學(xué)者進(jìn)行更深一步探研。

7 結(jié)論

hENT-1表達(dá)水平與GEM輔助化療預(yù)后相關(guān)。hENT-1高表達(dá)的病人比低表達(dá)者有更長(zhǎng)的OS和DFS，說(shuō)明高表達(dá)者的GEM敏感性更高。檢測(cè)hENT-1表達(dá)水平具有預(yù)測(cè)吉西他濱療效的意義。hENT-1表達(dá)水平和病理級(jí)別共同影響病人的OS和DFS，卻互不牽涉，其機(jī)制暫不明確。年齡、性別、腫瘤位置及大小、術(shù)式、TNM分期等暫未發(fā)現(xiàn)對(duì)hENT-1表達(dá)水平造成影響。