消積抑癌外敷方對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及Survivin蛋白表達(dá)的影響

鄭 茜，劉遠(yuǎn)婷，丁甜甜，李 慧

(新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院中醫(yī)科，新疆 烏魯木齊 830000)

超過(guò)70%的肺癌患者確診時(shí)已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，無(wú)法接受手術(shù)治療，而非手術(shù)治療手段不良反應(yīng)較多，腫瘤晚期患者合并多種基礎(chǔ)病，免疫力低下，無(wú)法耐受放化療，因而積極探尋新的有效治療方法是目前研究重點(diǎn)[1-3]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為肺癌為本虛標(biāo)實(shí)，正氣虛損、陰陽(yáng)失調(diào)、六淫之邪乘虛而入，引起肺臟功能失衡，宣降失司，氣機(jī)不暢，從而血行受阻，津液輸布不暢，津聚為痰，瘀阻脈絡(luò)、痰氣瘀毒膠結(jié)，發(fā)為肺部腫塊。中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療肺癌多傾向于辨證辨病結(jié)合，扶正祛邪結(jié)合，改善患者癥狀、提高患者生存質(zhì)量、穩(wěn)定病灶、延長(zhǎng)生存期及提高生存率，而關(guān)于中醫(yī)作用于肺癌的機(jī)制目前研究甚少[4]。Survivin蛋白是以效應(yīng)細(xì)胞蛋白酶受體cDNA在人體的基因組庫(kù)雜交篩選中分離而得，參與肺癌的發(fā)生發(fā)展[5]。本研究擬分析消積抑癌外敷方對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)、Survivin蛋白表達(dá)的影響，為臨床治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株：選取SPF級(jí)C57BL/6小鼠60只，雌鼠、雄鼠各30只，4～9周齡，體重19～22 g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。Lewis肺癌細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)生命科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：消積抑癌外敷方組成如下：當(dāng)歸、川芎、乳香、沒(méi)藥、紅花、赤芍、甲珠、丹參各30 g，五靈脂、透骨草、青黛、仙鶴草、丹皮、白鮮皮、蛇莓各60 g，莪術(shù)、苦參、山慈菇、商陸、延胡索、浙貝母、烏梅、蜂房各120 g，全蝎、蟲(chóng)、拳參各40 g，蜈蚣40條，冰片9 g。以上中藥材由新疆醫(yī)科大學(xué)第七附屬醫(yī)院中藥房提供，將以上中藥以破壁機(jī)研成細(xì)粉，將冰片溶入46°白酒制備成冰片酒，調(diào)和成膏狀再消毒滅菌裝瓶封制成外敷制劑，濃縮至生藥含量為4.875 g/ml。其他試劑：胎牛血清(武漢博士德公司)，PBS(武漢博士德公司)，二抗PV-6001兔兩步法試劑盒、DAB顯色試劑盒(英國(guó)Invitrogen公司)，BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(江蘇南京凱基生物有限公司)，免疫組化染色試劑中一抗Survivin(1∶50)兔抗鼠單克隆抗體、鼠抗人單克隆抗體Anti-β-actin、兔抗人單克隆抗體Anti-survivin(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：恒溫CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)、低溫高速離心機(jī)(3K-15型，德國(guó)Sigma公司)、顯微鏡(BX60型，日本Olympus)、病理切片機(jī)(RM2016型，上海徠卡儀器有限公司)、光譜掃描多功能酶標(biāo)儀(ELX808IU型，美國(guó)Promega公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組及建模：60只小鼠以隨機(jī)數(shù)字表法分為四組，每組各15只，依次為對(duì)照組、消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組。建模：選擇生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis肺癌細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化，濃度調(diào)整為1×107個(gè)/ml后均經(jīng)小鼠右側(cè)腋部皮下接種0.2 ml。在建模8 d后，可觸及皮下結(jié)節(jié)、瘤長(zhǎng)至100～300 mm提示建模成功[6]。

1.2.2 給藥方法及取材：建模后，對(duì)照組0.80 ml/20 g0.9%氯化鈉溶液調(diào)和的面糊外敷于瘤體表面、加熱至30 ℃，3次/d，30 min/次。消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組分別予以0.20 ml/20g、0.40 ml/20g、0.80 ml/20g的消積抑癌外敷方外敷于瘤體表面、加熱至30 ℃，3次/d，30 min/次。各組均連續(xù)干預(yù)30 d后以頸椎脫臼法將小鼠處死，同時(shí)剝離各組小鼠瘤組織。

1.2.3 HE染色：取瘤旁及瘤體組織，4%中性甲醛固定后的標(biāo)本經(jīng)脫水、透明、浸蠟與包埋后，制成蠟塊。以Leica RM2235石蠟切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，厚度5 μm，切片經(jīng)脫蠟后予以常規(guī)的蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光學(xué)顯微鏡下觀察組織學(xué)形態(tài)并拍照記錄。

1.2.4 抑瘤效果評(píng)估：取出完整的腫瘤組織后稱(chēng)重，計(jì)算抑瘤率。抑瘤率為對(duì)照組與觀察組的平均瘤重差值占對(duì)照組平均瘤重百分比。

1.2.5 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)：在剝離瘤體后，取小鼠胸腺、脾臟組織，稱(chēng)重。胸腺指數(shù)=10×胸腺重量(g)/鼠重(g)、脾臟指數(shù)=10×脾臟重量(g)/鼠重(g)。

1.2.6 肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)：將雙肺完整取出后，應(yīng)用苦味酸固定，鏡下對(duì)雙肺表面轉(zhuǎn)移灶數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.7 免疫組化法測(cè)定Survivin蛋白表達(dá)水平：經(jīng)SP免疫組化法對(duì)腫瘤組織Survivin蛋白表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定。取新鮮腫瘤組織，以10%中性甲醛固定24 h后切塊、脫水、石蠟包埋，以切片機(jī)切片，每蠟塊連續(xù)切片3張，厚度4～5 μm，切片脫蠟水洗后高壓熱修復(fù)，以3%H2O2阻斷過(guò)氧化酶，PBS洗滌3 min×3次，滴加一抗，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3 min×3次，滴加二抗，37 ℃孵育45 min，PBS洗滌3 min×3次，DAB顯色2 min，蘇木素復(fù)染，透明后封片鏡檢。嚴(yán)格依據(jù)半定量評(píng)分系統(tǒng)評(píng)定染色效果[7]，著色強(qiáng)度、陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比兩項(xiàng)乘積<3分為陰性(-)，≥3分為陽(yáng)性(+)，3～5分為弱陽(yáng)性(+)，6～9分為中陽(yáng)性()，>9分為強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)()。

1.2.8 Western blot法測(cè)定Survivin蛋白表達(dá)：取新鮮腫瘤組織并移入無(wú)菌的離心管，1000 r/min、離心5 min，以4 ℃預(yù)冷的PBS洗滌2次，將殘余液體吸干后每瓶細(xì)胞加300 μl細(xì)胞裂解液，冰上搖勻30 min，待細(xì)胞充分裂解后收集到不含RNA酶的1.5 ml預(yù)冷離心管，取上清應(yīng)用BCA法定量，采用PVDF膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)，5%脫脂奶粉行免疫印跡、封閉、孵育，將殘留的一抗洗掉后加二抗，室溫?fù)u床1 h，洗去膜上殘留二抗，避光滴加配制好的ECL化學(xué)發(fā)光A、B混合試劑，經(jīng)數(shù)字凝膠成像系統(tǒng)對(duì)PVDF膜進(jìn)行掃描，按照內(nèi)參條帶測(cè)出目的條數(shù)，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。相對(duì)表達(dá)量=目的條帶灰度值/內(nèi)參灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 瘤旁及瘤體組織的HE染色結(jié)果 HE染色結(jié)果(圖1)可見(jiàn)瘤旁組織的肺泡未增厚，腺圈不明顯；瘤體組織見(jiàn)肺泡壁明顯增厚，觀察到肺腺癌的病理特征，腺圈明顯。

2.2 各組小鼠體重、瘤重、抑瘤率比較 各組小鼠體重兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (均P>0.05)。消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組小鼠瘤重均低于對(duì)照組，且消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組小鼠瘤重依次降低，而抑瘤率逐漸增加，三組組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠體重、瘤重、抑瘤率比較

2.3 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較 消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組、消積抑癌高劑量組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于對(duì)照組(P<0.05)。消積抑癌高劑量組胸腺指數(shù)高于消積抑癌低劑量組、消積抑癌中劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；消積抑癌高劑量組、消積抑癌中劑量組小鼠脾臟指數(shù)高于消積抑癌低劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較(mg/10 g)

2.4 各組小鼠肺轉(zhuǎn)移灶個(gè)數(shù)比較 對(duì)照組肺轉(zhuǎn)移灶平均(14.23±1.56)個(gè)>消積抑癌低劑量組(10.12±1.35)個(gè)>消積抑癌中劑量組(8.49±0.88)個(gè)>消積抑癌高劑量組(6.43±0.67)個(gè)。消積抑癌不同劑量組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

2.5 各組小鼠Survivin蛋白表達(dá)比較 對(duì)照組Survivin蛋白積分、Survivin蛋白陽(yáng)性率及Survivin蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于不同劑量的消積抑癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。消積抑癌高劑量組Survivin蛋白積分、Survivin蛋白陽(yáng)性率及Survivin蛋白相對(duì)表達(dá)量最低。見(jiàn)表3(圖2、3)。

表3 各組小鼠Survivin蛋白表達(dá)比較

A：對(duì)照組；B：消積抑癌低劑量組；C：消積抑癌中劑量組；D：消積抑癌高劑量組

A：對(duì)照組；B：消積抑癌低劑量組；

3 討 論

肺癌為臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤，肺癌的發(fā)病率和病死率逐年攀升[8-9]。手術(shù)、放化療為肺癌的主要治療方案，近年來(lái)中醫(yī)藥治療逐漸受到關(guān)注。中醫(yī)認(rèn)為肺癌以肺脾虛為本，痰瘀為標(biāo)，久病及腎；肺癌證型主要有氣滯、血瘀、痰濕、熱毒等，依據(jù)臨床表現(xiàn)可歸于“咳嗽”“痰飲”“息奔” “肺積” “咯血” “肺花瘡” “胸痛”等范疇[10]。蔣艷玲等[11]發(fā)現(xiàn)，中藥化痰消瘤方能對(duì)Lewis荷瘤小鼠發(fā)揮抑瘤作用，并對(duì)抗肺癌轉(zhuǎn)移，且以高劑量組療效最顯著，其作用機(jī)制可能是上調(diào)腫瘤E-cad表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間黏附增加，使其向周?chē)M織侵襲力減輕，且可顯著下調(diào)腫瘤細(xì)胞的表達(dá)，減輕腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)間的黏附，使腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移受到抑制。Survivin為凋亡基因，其能抑制凋亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，于多種惡性腫瘤中高表達(dá)，而正常組織中幾乎不表達(dá)[12]。李興培教授提出治療肺癌的臨床方案為以扶正消積湯內(nèi)服聯(lián)合消積抑癌外用方，或單用消積抑癌外用方，與西醫(yī)放、化療有機(jī)結(jié)合，可緩解患者癥狀并穩(wěn)定病灶，提高放化療效果，使患者帶瘤生存水平提升，增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，減輕放化療所致消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)的不良反應(yīng)。因此本研究建立Lewis肺癌荷瘤模型，分析消積抑癌方外敷治療的抑瘤作用及其作用機(jī)制，為后續(xù)臨床治療提供理論依據(jù)。

本次通過(guò)建立Lewis肺癌荷瘤小鼠模型，分析本院消積抑癌外敷方對(duì)其腫瘤生長(zhǎng)的影響，從結(jié)果來(lái)看Lewis肺癌荷瘤小鼠予以消積抑癌外敷方后可起到抑制腫瘤生長(zhǎng)、減少腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。此外本次研究發(fā)現(xiàn)，隨消積抑癌外敷方給藥劑量增加，Lewis肺癌荷瘤小鼠瘤重逐漸減少，抑瘤率逐漸增加，說(shuō)明其治療效果呈劑量依賴(lài)性抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)，這與周婷婷等[13]的研究結(jié)論吻合。

本次采用的消積抑癌外敷方由新疆名中醫(yī)李興培教授創(chuàng)制，李教授論治腫瘤的辨證思想融合了金元時(shí)期張從正和張?jiān)氐膶W(xué)術(shù)主張。張從正認(rèn)為：“蓋邪未去而不可言補(bǔ)，補(bǔ)之則適足資寇”“損其有余所以補(bǔ)不足也”。張?jiān)卣J(rèn)為：“養(yǎng)正積自除”。故李興培教授取兩家之長(zhǎng)，以“攻補(bǔ)兼施”為指導(dǎo)思想，創(chuàng)制了扶正消積湯(內(nèi)服方)和消積抑癌外用方，內(nèi)服“補(bǔ)其不足”，外敷“損其有余”。消積抑癌外敷方中多選用蟲(chóng)類(lèi)藥以通絡(luò)消積、以毒攻毒；選用活血破瘀消積藥以清瘀毒，如當(dāng)歸、川芎、乳香、沒(méi)藥等；選用清熱解毒散結(jié)藥物如苦參、山慈菇、商陸等[8]；輔以冰片、白酒的辛散透皮，引藥到達(dá)病所；諸藥配伍可發(fā)揮清熱解毒、活血消積、以毒攻毒等功效[14-16]。現(xiàn)代藥理研究表明當(dāng)歸[17]、川芎[18]可活血、補(bǔ)血，抑制Lewis小鼠移植瘤生長(zhǎng)，其作用機(jī)制可能是直接作用于癌細(xì)胞，發(fā)揮抗血管生成作用；紅花中紅花黃色素可較好緩解及保護(hù)呼吸系統(tǒng)相關(guān)疾病[19]；莪術(shù)[20]、赤芍[21]、丹參[22]能較好抑制腫瘤組織轉(zhuǎn)移、血管生成，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能、抑制肺間質(zhì)纖維化。

研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)消積抑癌外敷方高劑量組的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)較消積抑癌外敷方低劑量組、消積抑癌外敷方中劑量組高，消積抑癌外敷方中劑量組脾臟指數(shù)高于消積抑癌外敷方低劑量組，這與謝英瑛[16]的報(bào)道結(jié)果相似，說(shuō)明消積抑癌外敷方可提高Lewis肺癌荷瘤小鼠的免疫器官指數(shù)，保護(hù)小鼠免疫功能，增強(qiáng)腫瘤的免疫應(yīng)答水平，且呈劑量依賴(lài)性，這可能和中藥活性成分發(fā)揮藥理作用有關(guān)系，其具體機(jī)制可在后期研究中進(jìn)一步探討。

Survivin為最強(qiáng)的凋亡抑制因子，也是唯一和細(xì)胞周期有密切關(guān)系的IAP家族成員，通過(guò)BIR重要序列抑制Caspase依賴(lài)的細(xì)胞凋亡途徑；Survivin也可促進(jìn)p21與線粒體中Caspase-3結(jié)合，而明顯抑制Caspase活性，促進(jìn)細(xì)胞分裂，抑制細(xì)胞凋亡[23-24]。本研究中對(duì)照組Survivin蛋白積分、陽(yáng)性率與相對(duì)表達(dá)量均高于消積抑癌外敷方各劑量組，其中消積抑癌外敷方高劑量組的Survivin蛋白積分、陽(yáng)性率與相對(duì)表達(dá)量最少，表明消積抑癌外敷方可抑制Lewis小鼠Survivin蛋白表達(dá)。李巧玲[25]發(fā)現(xiàn)，愛(ài)康方(組方：生薏苡仁、通關(guān)藤、金蕎麥、桃仁、紫珠葉、臭殼蟲(chóng)、花蕊石、三七、血余炭)對(duì)人肺腺癌A549、小鼠Lewis細(xì)胞內(nèi)的Survivin蛋白及基因表達(dá)有一定影響。此外也有研究發(fā)現(xiàn)Survivin是細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，其表達(dá)和肺癌的癌細(xì)胞周期密切相關(guān)，半衰期僅30 min，于細(xì)胞周期G2M期有一定表達(dá)，而隨后G1期的mRNA及蛋白表達(dá)水平快速下降，Survivin在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)水平升高，抑制癌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)癌細(xì)胞侵襲周?chē)M織，導(dǎo)致轉(zhuǎn)移[26]。但本次未對(duì)Lewis荷瘤小鼠的細(xì)胞周期進(jìn)行研究，關(guān)于Survivin蛋白對(duì)Lewis肺癌荷瘤小鼠的細(xì)胞周期調(diào)控作用值得進(jìn)一步探究。

綜上所述，消積抑癌外敷方能較好地抑制Lewis肺癌荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)及Survivin蛋白表達(dá)，且呈劑量依賴(lài)性。