NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3對哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用

惠超 劉馨

（錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，遼寧錦州 121000）

支氣管哮喘是兒科常見的呼吸系統(tǒng)疾病，是一類以可逆性氣流受限為特征的慢性氣道炎癥性疾病，中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞在氣道內(nèi)大量浸潤所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)、細(xì)胞焦亡與該病的發(fā)病密切相關(guān)［1-2］。目前，哮喘發(fā)病的具體分子機制及發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)、細(xì)胞焦亡的調(diào)控機制尚不十分清楚。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（nod-like receptor，pyrin domain containing3，NLRP3）是在呼吸系統(tǒng)內(nèi)發(fā)揮重要作用的模式識別受體，與凋亡相關(guān)斑點樣蛋白、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase-1，caspase-1）組成炎癥小體，激活后的生物學(xué)效應(yīng)是生成裂解型caspase-1（cleaved caspase-1），促進白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β及IL-18的釋放，并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，同時促進Gasdermin D（GSDMD）剪切為GSDMD-N并介導(dǎo)細(xì)胞焦亡［3-4］。已有哮喘相關(guān)的研究證實哮喘患者血清中IL-1β、IL-18的含量增加［5-6］，哮喘小鼠肺組織中NLRP3表達增加［7］，但NLRP3在哮喘發(fā)病中的直接生物學(xué)作用尚未見報道。本研究將通過NLRP3基因敲除（knockout，KO）的方式觀察NLRP3在支氣管哮喘發(fā)病中的作用，具體探究NLRP3對哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的調(diào)控作用，以期為今后深入認(rèn)識哮喘的發(fā)病機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物

NLRP3野生型（wild type，WT）C57BL/6J小鼠、NLRP3KOC57BL/6J小鼠均購自上海南方模式生物研究中心。

1.2 試劑與儀器

卵白蛋白（ovalbumin，OVA）、氫氧化鋁凝膠（Sigma公司，美國），蘇木精-伊紅染色試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），IL-1β、IL-18的酶聯(lián)免疫吸附法檢測試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司），NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD-N及β-actin一抗（Abcam公司，美國）。

全身體積描記檢測系統(tǒng)（巴克西科公司，美國），顯微鏡（尼康公司，日本），酶標(biāo)儀（南京德鐵實驗設(shè)備有限公司），凝膠電泳系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國），凝膠成像系統(tǒng)（上海勤翔科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 動物分組及造模

NLRP3WT小鼠分為NLRP3-WT對照組、NLRP3-WT哮喘組，NLRP3KO小鼠分為NLRP3-KO對照組、NLRP3-KO哮喘組，每組各10只。參照文獻［7-8］進行哮喘模型制備，方法如下：第1、7、14天時給予OVA與氫氧化鋁凝膠混懸液0.2 mL（100μg OVA、1 mg氫氧化鋁凝膠溶于0.2 mL 0.9%氯化鈉溶液）腹腔注射致敏；第21天起每天給予5%OVA霧化吸入，每次持續(xù)30 min，連續(xù)7 d進行激發(fā)。對照組用等體積0.9%氯化鈉溶液代替OVA與氫氧化鋁凝膠混懸液進行腹腔注射、代替OVA進行霧化吸入。末次霧化吸入激發(fā)24 h后進行標(biāo)本收集。

1.4 氣道反應(yīng)性的檢測

末次霧化吸入激發(fā)24 h后，將小鼠放入全身體積描記檢測系統(tǒng)，記錄3 min的基線讀數(shù)后給予乙酰甲膽堿25.0 g/L霧化吸入3 min并記錄讀數(shù)，根據(jù)配套的Cough analyzer系統(tǒng)計算增強呼氣間歇（enhanced pause，Penh）。

1.5 支氣管肺泡灌洗液的收集及檢測

完成氣道反應(yīng)性檢測后對小鼠進行麻醉，采用1 mL預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液進行肺泡灌洗，得到支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）后在離心機中以4℃、15 000 r/min的條件離心5 min，收集上清并采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒檢測IL-1β、IL-18的含量；收集沉淀并加入雙蒸水0.2 mL定容，Diff-quick染色后在顯微鏡下對中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞進行計數(shù)。

1.6 肺組織蘇木精-伊紅染色

完成BALF收集后處死小鼠，收集適量肺組織，0.9%氯化鈉溶液清洗后4%多聚甲醛固定，制作4μm厚度的病理切片后采用蘇木精-伊紅染色試劑盒進行染色實驗，在顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，按照下列標(biāo)準(zhǔn)進行炎癥評分［8］：無炎性細(xì)胞浸潤為0分，偶見炎性細(xì)胞浸潤為1分，多數(shù)支氣管或血管表層見1～2個炎性細(xì)胞為2分，中層見3～5個炎性細(xì)胞為3分，厚層見5個以上炎性細(xì)胞為4分。

1.7 Western blot法檢測肺組織中蛋白表達水平

取適量肺組織，采用組織裂解液進行勻漿，勻漿液在離心機中以4℃、12 000 r/min的條件離心10 min，收集上清并檢測蛋白濃度。根據(jù)檢測結(jié)果將30μg蛋白樣本用于Western blot實驗，在SDS-聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，分離不同分子量的蛋白，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉硝酸纖維素膜1 h；用1∶1 000稀釋的NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD-N一 抗 或1∶2 500稀釋的β-actin一抗4℃孵育硝酸纖維素膜16～24 h；而后用1∶2 000稀釋的二抗室溫孵育硝酸纖維素膜1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)中進行蛋白顯影及表達水平的半定量分析。結(jié)果以目的蛋白NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD-N與內(nèi)參蛋白β-actin的比值表示。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Prism 6.0軟件進行數(shù)據(jù)的制圖。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織中NLRP3表達水平的鑒定

NLRP3-WT對照組、NLRP3-WT哮喘組小鼠肺組織中均表達NLRP3，且NLRP3-WT哮喘組小鼠肺組織中NLRP3的表達水平（0.91±0.16）高于NLRP3-WT對照組（0.38±0.08，t=15.575，P<0.05）。NLRP3-KO對照組、NLRP3-KO哮喘組小鼠肺組織中均不表達NLRP3。見圖1。

圖1 Western blot法檢測各組小鼠肺組織中NLRP3表達水平電泳圖

2.2 各組小鼠氣道反應(yīng)性的變化

NLRP3-WT對照組、NLRP3-WT哮喘組、NLRP3-KO對照組、NLRP3-KO哮喘組小鼠的Penh分別為117±14、375±63、108±15、189±25，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=20.398，P<0.001）。與NLRP3-WT對照組比較，NLRP3-WT哮喘組小鼠的Penh明顯升高（P<0.05），NLRP3-KO對照組小鼠的Penh水平無明顯變化（P>0.05）；與NLRP3-WT哮喘組比較，NLRP3-KO哮喘組小鼠的Penh水平明顯降低（P<0.05）。

2.3 各組小鼠BALF中各細(xì)胞計數(shù)變化

與NLRP3-WT對照組比較，NLRP3-WT哮喘組小鼠BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計數(shù)明顯升高（P<0.05），NLRP3-KO對照組小鼠BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計數(shù)無明顯變化（P>0.05）；與NLRP3-WT哮喘組比較，NLRP3-KO哮喘組小鼠BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計數(shù)明顯降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計數(shù)比較 （±s，×105/mL）

表1 各組小鼠BALF中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞計數(shù)比較 （±s，×105/mL）

注：a示與NLRP3-WT對照組比較，P<0.05；b示與NLRP3-WT哮喘組比較，P<0.05。

n 組別NLRP3-WT對照組NLRP3-WT哮喘組NLRP3-KO對照組10 10 10淋巴細(xì)胞計數(shù)2.9±0.5 5.7±0.8a 2.8±0.4中性粒細(xì)胞計數(shù)2.2±0.4 5.1±0.8a 2.2±0.5嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)5.1±0.8 18.4±3.6a 5.0±0.7 NLRP3-KO哮喘組F值P值10 3.2±0.4b 11.092<0.001 8.9±1.3b 9.829<0.001 3.4±0.6b 13.575<0.001

2.4 各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)及炎癥評分的變化

NLRP3-WT對照組、NLRP3-KO對照組小鼠肺組織內(nèi)氣道平滑肌形態(tài)正常，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；NLRP3-WT哮喘組小鼠肺組織出現(xiàn)氣道平滑肌增厚、炎性細(xì)胞浸潤的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；NLRP3-KO哮喘組小鼠肺組織內(nèi)氣道平滑肌增厚、炎性細(xì)胞浸潤的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)較NLRP3-WT哮喘組明顯改善。見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織形態(tài)學(xué)表現(xiàn)（蘇木精-伊紅染色，×200） NLRP3-WT對照組（A）、NLRP3-KO對照組（C）小鼠肺組織內(nèi)氣道平滑肌形態(tài)正常，未見明顯炎性細(xì)胞浸潤；NLRP3-WT哮喘組（B）小鼠肺組織出現(xiàn)氣道平滑肌增厚、炎性細(xì)胞浸潤的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)；NLRP3-KO哮喘組（D）小鼠肺組織內(nèi)氣道平滑肌增厚、炎性細(xì)胞浸潤的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)較NLRP3-WT哮喘組明顯改善。

NLRP3-WT對照組、NLRP3-WT哮喘組、NLRP3-KO對照組、NLRP3-KO哮喘組小鼠的肺組織炎癥評分分別為（0.61±0.09）分、（3.94±0.67）分、（0.55±0.08）分、（1.62±0.22）分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=19.383，P<0.001）。與NLRP3-WT對照組比較，NLRP3-WT哮喘組小鼠肺組織炎癥評分明顯升高（P<0.05），NLRP3-KO對照組小鼠肺組織炎癥評分無明顯變化（P>0.05）；與NLRP3-WT哮喘組比較，NLRP3-KO哮喘組小鼠肺組織炎癥評分明顯降低（P<0.05）。

2.5 各組小鼠肺組織中cleaved caspase-1表達水平的變化

NLRP3-WT對照組、NLRP3-WT哮喘組、NLRP3-KO對照組、NLRP3-KO哮喘組小鼠的肺組織cleaved caspase-1表達水平分別為0.76±0.08、1.32±0.20、0.45±0.06、0.64±0.08，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.575，P<0.001）。與NLRP3-WT對照組比較，NLRP3-WT哮喘組小鼠肺組織中cleaved caspase-1的表達水平明顯升高，NLRP3-KO對照組小鼠肺組織中cleaved caspase-1的表達水平明顯降低（P<0.05）；與NLRP3-WT哮喘組比較，NLRP3-KO哮喘組小鼠肺組織中cleaved caspase-1的表達水平明顯降低（P<0.05）。見圖3。

圖3 Western blot法檢測各組小鼠肺組織中cleaved caspase-1表達水平電泳圖

2.6 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-18含量的變化

與NLRP3-WT對照組比較，NLRP3-WT哮喘組小鼠BALF中IL-1β、IL-18的含量明顯升高（P<0.05），NLRP3-KO對照組小鼠BALF中IL-1β、IL-18的含量無明顯變化（P>0.05）；與NLRP3-WT哮喘組比較，NLRP3-KO哮喘組小鼠BALF中IL-1β、IL-18的含量明顯降低（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-18含量的比較（±s，ng/mL）

表2 各組小鼠BALF中IL-1β、IL-18含量的比較（±s，ng/mL）

注：［IL］白細(xì)胞介素。a示與NLRP3-WT對照組比較，P<0.05；b示與NLRP3-WT哮喘組比較，P<0.05。

NLRP3-KO哮喘組F值P值10 5.71±0.82b 11.315<0.001 3.56±0.51b 15.474<0.001 n IL-18 1.84±0.32 6.09±0.77a 1.77±0.29組別NLRP3-WT對照組NLRP3-WT哮喘組NLRP3-KO對照組10 10 10 IL-1β 3.12±0.62 11.46±2.05a 2.96±0.56

2.7 各組小鼠肺組織中GSDMD-N表達水平的變化

NLRP3-WT對照組、NLRP3-WT哮喘組、NLRP3-KO對照組、NLRP3-KO哮喘組小鼠的肺組織GSDMD-N表達水平分別為0.54±0.07、1.08±0.16、0.31±0.06、0.46±0.06，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=9.387，P<0.001）。與NLRP3-WT對照組比較，NLRP3-WT哮喘組小鼠肺組織中GSDMD-N的表達水平明顯升高，NLRP3-KO對照組小鼠肺組織中GSDMD-N的表達水平明顯降低（P<0.05）；與NLRP3-WT哮喘組比較，NLRP3-KO哮喘組小鼠肺組織中GSDMD-N的表達水平明顯降低（P<0.05）。見圖4。

圖4 Western blot法檢測各組小鼠肺組織中GSDMDN表達水平電泳圖

3 討論

支氣管哮喘的發(fā)病過程涉及多種炎性細(xì)胞及細(xì)胞組分，但具體的機制尚未完全闡明。在氣流受限反復(fù)發(fā)作的過程中，氣道炎癥反應(yīng)持續(xù)激活是特征性的病理改變，同時也會誘發(fā)細(xì)胞焦亡、引起氣道上皮細(xì)胞損傷并加重氣道高反應(yīng)性。NLRP3炎癥小體在炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的調(diào)控中起關(guān)鍵作用，在病原相關(guān)分子、活性氧簇、組織蛋白酶等刺激下NLRP3表達增加，進而通過凋亡相關(guān)斑點樣蛋白使下游caspase-1前體活化為cleaved caspase-1，后者能夠介導(dǎo)炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的激活。近些年，多項基礎(chǔ)研究報道了地塞米松［9］、雌激素［10］、miR-223過表達［11］、蒼術(shù)內(nèi)酯Ⅲ［12］等不同哮喘治療手段不僅顯著改善哮喘動物模型肺功能，同時也對NLRP3的表達具有抑制作用，提示NLRP3的高表達可能在哮喘的發(fā)病中起重要作用。

Wood等［13］的臨床研究證實哮喘患者外周血中NLRP3的表達水平明顯增加；Xu等［7］及Zhang等［14］的動物實驗證實哮喘小鼠肺組織中NLRP3炎癥小體的表達均顯著增加。本研究通過OVA聯(lián)合氫氧化鋁致敏、OVA激發(fā)的方式建立支氣管哮喘小鼠模型，在WT哮喘小鼠肺組織中檢測到NLRP3、cleaved caspase-1的表達增加，與既往其他學(xué)者報道支氣管哮喘發(fā)病過程中NLRP3炎癥小體表達增加的結(jié)果［7，13］一致。為了進一步探究NLRP3在哮喘發(fā)病過程中的作用，本研究對小鼠進行了NLRP3KO，NLRP3KO后進行支氣管哮喘模型制備，NLRP3KO哮喘小鼠較WT哮喘小鼠的氣道反應(yīng)性指標(biāo)Penh水平明顯降低，肺組織中氣道平滑肌增厚、炎性細(xì)胞浸潤的形態(tài)學(xué)改變明顯改善，表明NLPR3KO顯著改善哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性及氣道病理改變，由此也提供了NLPR3高表達參與哮喘發(fā)病的直接證據(jù)。

NLRP3表達增加后使下游有活性的cleaved caspase-1生成增加，后者能夠使IL-1β和IL-18的前體裂解為有活性的成熟的IL-1β和IL-18并釋放進入局部組織、血液循環(huán)，進而發(fā)揮促炎生物學(xué)效應(yīng)，在局部招募多種炎性細(xì)胞浸潤并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)激活［15-16］。炎癥反應(yīng)激活是造成哮喘發(fā)病過程中氣道高反應(yīng)性、氣流受限的關(guān)鍵因素，既往多項研究［8］及本研究均證實哮喘小鼠肺組織的炎癥評分增加、BALF中多種炎性細(xì)胞數(shù)目增多。同時，本研究還檢測到WT哮喘小鼠BALF中IL-1β和IL-18的含量增加，與NLRP3及cleaved caspase-1表達增加的結(jié)果吻合，進一步確認(rèn)哮喘發(fā)病過程中NLRP3炎癥小體過度激活。為了闡明NLRP3在哮喘發(fā)病過程中的炎癥調(diào)控作用，本研究在NLRP3KO后觀察到哮喘小鼠肺組織的炎癥評分降低、BALF中多種炎性細(xì)胞數(shù)目減少且IL-1β和IL-18的含量降低，表明NLRP3在哮喘發(fā)病過程中直接參與氣道炎癥反應(yīng)的調(diào)控，高表達的NLRP3能夠增加IL-1β和IL-18的釋放、招募多種炎性細(xì)胞浸潤并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的激活。

近些年關(guān)于哮喘、慢性阻塞性肺疾病等的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞焦亡是與上述呼吸道疾病發(fā)生密切相關(guān)的生物學(xué)環(huán)節(jié)，在焦亡過程中細(xì)胞膜迅速破裂，細(xì)胞內(nèi)大量炎癥介質(zhì)釋放進入細(xì)胞間液，進而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的級聯(lián)放大。目前認(rèn)為焦亡的經(jīng)典途徑由NLRP3介導(dǎo)，使細(xì)胞內(nèi)GSDMD裂解為GSDMD-N并使細(xì)胞發(fā)生焦亡，這一過程主要發(fā)生在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等，GSDMD-N是目前公認(rèn)的焦亡標(biāo)志物。有研究報道，激活焦亡使哮喘小鼠的氣道功能減退、炎癥反應(yīng)加?。?7］。本研究在WT哮喘小鼠中檢測到肺組織GSDMD-N的表達水平增加，表明哮喘發(fā)病過程中存在焦亡的過度激活，既與既往關(guān)于焦亡與哮喘的其他研究結(jié)果一致，也與本研究觀察到哮喘發(fā)病過程中NLRP3表達增加的結(jié)果吻合。進一步在NLRP3KO后檢測焦亡程度可知：在NLRP3KO哮喘小鼠肺組織內(nèi)GSDMD-N的表達水平降低，表明NLRP3KO對GSDMD-N的表達及細(xì)胞焦亡具有抑制作用，進而證實哮喘發(fā)病過程中高表達的NLRP3不僅參與炎癥反應(yīng)的調(diào)控，還對細(xì)胞焦亡產(chǎn)生調(diào)控。

綜上所述，本研究中WT小鼠的實驗表明哮喘發(fā)病過程中存在NLRP3炎癥小體的過度表達，NLRP3KO小鼠的實驗表明NLRP3在哮喘發(fā)病過程中參與炎癥反應(yīng)及細(xì)胞焦亡的調(diào)控。這為今后深入認(rèn)識NLRP3在哮喘發(fā)病中的作用及哮喘的發(fā)病機制提供了實驗依據(jù)，也為發(fā)現(xiàn)哮喘新的治療靶點提供了思路。