他克莫司對嘌呤霉素?fù)p傷的腎小球足細(xì)胞重組人帕金森蛋白7表達(dá)的影響

譚俊杰 于生友 張瑤 郝志宏 于力

（廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院兒科，廣東廣州 510180）

腎小球硬化是由于多種慢性腎臟疾病發(fā)展的復(fù)雜病理過程，臨床上多種因素都可引起腎小球足細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變，包括感染、藥物、毒物、缺血、缺氧、代謝等，引起腎小球足細(xì)胞活化、增生、炎性細(xì)胞浸潤、凋亡等損傷。當(dāng)腎小球足細(xì)胞出現(xiàn)損傷后，足突的融合和裂孔隔膜消失，導(dǎo)致腎小球?yàn)V過屏障功能受損，出現(xiàn)蛋白尿。隨著各種細(xì)胞因子及炎癥因子釋放、免疫復(fù)合物沉積，導(dǎo)致大量的細(xì)胞外基質(zhì)積聚，進(jìn)而出現(xiàn)腎小球硬化病理改變［1-2］。腎小球足細(xì)胞是腎臟的固有細(xì)胞，其損傷后難以修復(fù)，臨床上通過多個(gè)靶點(diǎn)治療可改善腎小球?yàn)V過膜分子結(jié)構(gòu)，以減輕蛋白尿或者達(dá)到治愈目的，延緩腎小球硬化的進(jìn)程［3］。他克莫司（tacrolimus，F(xiàn)K506）屬于經(jīng)典的鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，通過免疫抑制T淋巴細(xì)胞的活化與增殖作用，以及非免疫抑制作用保護(hù)腎小球足細(xì)胞，其確切機(jī)制仍不十分清楚［4］。重組人帕金森蛋白7（Parkinson's disease 7，Park7）基因最初是在1997年Nagakubo等［5］發(fā)現(xiàn)的癌基因，隨后在2003年，證實(shí)是帕金森病的致病基因［6］。Park7基因廣泛存在于腦、肝臟、腎臟、骨骼肌及生殖器官，參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與氧化應(yīng)激、線粒體自噬途徑、分子伴侶等生物學(xué)作用，包括通過清除活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生直接抗氧化活性及Park7/Nrf2信號通路激活內(nèi)源性抗氧化作用等［7］。Park7與腎臟之間存在一定的關(guān)系，但研究報(bào)道比較少，國外曾有研究報(bào)道腎小球系膜細(xì)胞的Park7表達(dá)在高糖刺激下呈增高趨勢，并以時(shí)間依賴性方式與Akt磷酸化密切相關(guān)［8］。本課題組前期研究表明，嘌呤霉素（puromycin aminonucleoside，PAN）可以抑制足細(xì)胞突觸蛋白CD2AP、TRPC6、nephrin、podocin等表達(dá)，以時(shí)間和濃度依賴性方式誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡［9-11］。那PAN損傷足細(xì)胞究竟對Park7的表達(dá)是否有影響，F(xiàn)K506是否可通過參與足細(xì)胞Park7的表達(dá)，從而達(dá)到保護(hù)足細(xì)胞的作用？

本研究通過體外建立PAN誘導(dǎo)小鼠腎小球足細(xì)胞（mouse podocyte clone 5，MPC-5）損傷模型［12］，探討研究PAN對MPC-5凋亡及Park7 mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以及FK506對MPC-5損傷的保護(hù)機(jī)制，目的進(jìn)一步探討Park7參與腎小球足細(xì)胞損傷及保護(hù)的作用，從而為協(xié)助臨床治療腎臟疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 MPC-5培養(yǎng)

MPC-5購買于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院，用含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗、0.2%γ-干擾素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，在33℃、5%二氧化碳條件下，誘導(dǎo)MPC-5進(jìn)行增殖。每隔1～2 d換液1次，待細(xì)胞融合至75%～85%，用含EDTA胰蛋白酶的消化液消化傳代后把培養(yǎng)溫度調(diào)至37℃，培養(yǎng)10～14 d后誘導(dǎo)MPC-5分化成熟，把分化成熟的MPC-5接種至6孔板中，待細(xì)胞融合至80%～90%后，用不含血清及抗生素的純RPMI1640培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞12 h，使細(xì)胞生長同步，再進(jìn)行分組、加藥處理。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為3組：對照組（RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)），PAN組［向培養(yǎng)液中加入PAN（濃度50 mg/L），誘導(dǎo)MPC-5損傷模型［12］］，F(xiàn)K506組［向培養(yǎng)液中加入PAN（濃度50 mg/L）和FK506（濃度5 mg/L）［13］］。PAN購自美國APExBIO公司，F(xiàn)K506購自浙江奧默生物醫(yī)藥有限公司。分別于3個(gè)時(shí)間段（12、24、48 h）使用倒置顯微鏡觀察MPC-5的形態(tài)結(jié)構(gòu)，并收集MPC-5進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 倒置顯微鏡觀察MPC-5形態(tài)結(jié)構(gòu)變化

用37℃PBS液漂洗各組細(xì)胞3次，倒置顯微鏡（×200）下觀察并拍照記錄，運(yùn)用Image J圖像處理圖片。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MPC-5凋亡率

預(yù)冷PBS漂洗MPC-5后，加入不含乙二胺四乙酸胰酶消化細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞于室溫離心5 min（1 000 r/min），去上清，預(yù)冷PBS沖洗2次，收集1×105～5×105個(gè)細(xì)胞，加入Binding Buffer 400μL重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移入流式管，加入Annexin V-FITC 10μL和PI 5μL后室溫靜置避光反應(yīng)10 min，采用流式細(xì)胞儀檢測并使用FlowJo-V10軟件分析，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測Park7 mRNA相對表達(dá)量

采用TRIzol protocol提取總RNA，按RNA gents Total RNA Isolation System（TAKARA公司）操作說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及Real-Time PCR反應(yīng)。Park7上游引物：5'-AGTCACTACAGCTACTCAGAGA-3'，下游引物：5'-AATGGCTAGTGCAAACTCAAAG-3'，片段長度126 bp；內(nèi)參β-actin上游引物：5'-TACCCCCAATGTGTCCGTC-3'，下游引物：5'-GCCCAAGATGCCCTTCAGT-3'，片 段 長度171 bp。引物的設(shè)計(jì)與合成由上海生工生物工程股份有限公司完成。Real-Time PCR反應(yīng)體系（20.0μL）：SYBR Premix Ex Taq（2×）10.0μL，cDNA 2.0μL，上下游引物各1.0μL，ddH2O 6.0μL。Real-Time PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火20 s，共40個(gè)循環(huán)。最后得出標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性方程，用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算，以Park7與β-actin內(nèi)參基因的比值表示Park7 mRNA的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.6 Western blot檢測Park7蛋白表達(dá)

PBS液漂洗各組MPC-5兩次，吸掉PBS液后加入RIPA細(xì)胞裂解液，置于冰上搖床裂解30 min，并吹打細(xì)胞裂解。按照BCA法測定總蛋白濃度并調(diào)平，100℃、10 min使蛋白變性。制備SDS凝膠，每孔加20μL樣品，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。室溫5%脫脂奶粉搖床封閉2 h，滴加Park7一抗（1∶500，英國Abcam公司）在4℃搖床孵育過夜，滴加二抗（1∶1 000）在室溫?fù)u床孵育1 h。加入1 mL的ECL化學(xué)發(fā)光劑，曝光并拍照，曝光圖片采用Image J圖像掃描并分析蛋白條帶灰度值，以Park7蛋白條帶與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的灰度值的比值表示Park7蛋白相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.7 免疫熒光檢測Park7蛋白分布

分組培養(yǎng)分化MPC-5并爬片，多聚甲醛固定8 min，Triton-100室溫破膜5 min，用5%BSA在37℃封閉1 h。向分組細(xì)胞爬片滴加Park7一抗（1∶500，英國Abcam公司），4℃濕盒過夜。PBS洗滌3次后加入二抗（1∶200），37℃孵育反應(yīng)1 h，采用DAPI室溫染核，PBST清洗多余DAPI 3次，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，熒光顯微鏡下觀察采集各組MPC-5的圖像，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察各組MPC-5的形態(tài)變化

分別在12、24、48 h于倒置顯微鏡（×200）下觀察各組MPC-5的形態(tài)結(jié)構(gòu)。各時(shí)間點(diǎn)對照組細(xì)胞體積較大，形狀一致，足突自細(xì)胞體伸出，相鄰細(xì)胞間連接緊密，結(jié)構(gòu)清晰，胞漿豐富，細(xì)胞核明顯。PAN刺激后，PAN組細(xì)胞12 h時(shí)較對照組相比，可見細(xì)胞體積縮小，相鄰細(xì)胞間連接疏松，足突回縮；24 h時(shí)細(xì)胞體積縮小，足突明顯回縮；48 h時(shí)MPC-5縮小最為明顯，細(xì)胞分布稀疏，可見較多破碎細(xì)胞。各時(shí)間點(diǎn)FK506組細(xì)胞胞體面積較PAN組胞體面積大，且足突結(jié)構(gòu)較明顯，數(shù)量較多，細(xì)胞之間連接緊密度也較PAN組好轉(zhuǎn)。見圖1。

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)MPC-5形態(tài)變化（倒置顯微鏡，×200） 對照組MPC-5在各時(shí)間點(diǎn)足突自細(xì)胞體伸出，結(jié)構(gòu)清晰，胞漿豐富，細(xì)胞核明顯，形態(tài)一致。PAN組MPC-5在各時(shí)間點(diǎn)可見細(xì)胞體積縮小，相鄰細(xì)胞間連接疏松，足突回縮，有較多破碎細(xì)胞。FK506組MPC-5在各時(shí)間點(diǎn)仍可見較多足突，細(xì)胞間連接緊密度也較PAN組好。

2.2 各組MPC-5凋亡率的變化

對照組中12、24、48 h MPC-5凋亡率均處于較低水平。PAN組中，12 h和24 h MPC-5的凋亡率明顯高于對照組，48 h MPC-5的凋亡率較對照組增加更為明顯（P<0.05）。FK506組中，12、24、48 h MPC-5凋亡率均低于PAN組，但仍均高于對照組（P<0.05）。見表1和圖2。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測各組不同時(shí)間點(diǎn)MPC-5凋亡率 Q1為PI（+），AnnexinⅤ（-）：機(jī)械損傷細(xì)胞；Q2為PI（+），AnnexinⅤ（+）：晚期凋亡或死細(xì)胞；Q3為PI（-），AnnexinⅤ（+）：早期凋亡細(xì)胞；Q4為PI（-），AnnexinⅤ（-）：正?；罴?xì)胞。其中Q2和Q3反映MPC-5凋亡率。

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)MPC-5凋亡率比較（n=3，±s，%）

表1 各組各時(shí)間點(diǎn)MPC-5凋亡率比較（n=3，±s，%）

注：a示與對照組比較，P<0.05；b示與PAN組比較，P<0.05。

組別對照組PAN組FK506組48 h 14.8±1.7 40.7±2.3a 23.9±2.0a,b 24 h 11.3±1.6 25.4±1.8a 19.2±1.7a,b 12 h 10.0±1.4 17.4±1.7a 15.8±1.3a,b F值P值21.425 0.002 51.992<0.001 128.051<0.001

2.3 各組MPC-5 Park7 mRNA相對表達(dá)量的變化

熒光定量PCR結(jié)果顯示，對照組中12、24、48 h的Park7 mRNA表達(dá)水平較低。PAN組12、24、48 h的Park7 mRNA表達(dá)水平均較對照組增高（P<0.05）。FK506組中，Park7 mRNA的表達(dá)水平在12、24、48 h時(shí)均低于PAN組（P<0.05），且與對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)Park7 mRNA相對表達(dá)量比較（n=3，±s）

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)Park7 mRNA相對表達(dá)量比較（n=3，±s）

注：a示與對照組比較，P<0.05；b示與PAN組比較，P<0.05。

組別對照組PAN組FK506組48 h 1.88±0.12 3.86±0.15a 2.03±0.12b 12 h 1.26±0.14 1.76±0.16a 1.57±0.18b 24 h 1.53±0.16 2.32±0.11a 1.71±0.19b F值P值7.388 0.024 20.907<0.001 213.211<0.001

2.4 各組細(xì)胞Park7蛋白表達(dá)情況

Western blot結(jié)果顯示：對照組中12、24、48 h的Park7蛋白表達(dá)水平較低。PAN組12、24、48 h的Park7蛋白表達(dá)水平均較對照組顯著增高（P<0.05）。FK506組中，Park7蛋白表達(dá)水平在12、24、48 h時(shí)均較PAN組下降（P<0.05）。見圖3，表3。

圖3 Western blot檢測各組不同時(shí)間點(diǎn)Park7蛋白相對表達(dá)電泳圖 1、4、7為對照組，2、5、8為PAN組，3、6、9為FK506組。

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)Park7蛋白相對表達(dá)水平比較（n=3，±s）

表3 各組各時(shí)間點(diǎn)Park7蛋白相對表達(dá)水平比較（n=3，±s）

注：a示與對照組比較，P<0.05；b示與PAN組比較，P<0.05。

組別對照組PAN組FK506組48 h 0.471±0.016 0.788±0.034a 0.557±0.020b 12 h 0.184±0.026 0.483±0.037a 0.260±0.031b 24 h 0.337±0.023 0.629±0.041a 0.391±0.016b F值P值98.727<0.001 100.429<0.001 166.500<0.001

2.5 免疫熒光檢測各組蛋白分布結(jié)果

免疫熒光染色顯示：對照組Park7主要分布于細(xì)胞膜表面，少量均勻地分布在細(xì)胞質(zhì)中，并且在細(xì)胞核周圍可見到顆粒狀分布。PAN刺激后，Park7蛋白在細(xì)胞膜上表達(dá)較對照組明顯增多，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布亦明顯增多，呈不均勻團(tuán)狀分布，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。隨著時(shí)間延長，在24 h、48 h后Park7蛋白表達(dá)明顯增多，呈密集團(tuán)狀分布，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)更加明顯。FK506干預(yù)后Park7在各時(shí)間點(diǎn)均勻地分布在細(xì)胞膜中，細(xì)胞膜中的分布較PAN組減少，熒光強(qiáng)度較PAN組降低。見圖4。

圖4 各組各時(shí)間點(diǎn)Park7蛋白免疫熒光表達(dá)和分布（×400） 對照組Park7蛋白主要分布于細(xì)胞膜表面，少量均勻地分布在細(xì)胞質(zhì)中，并且在細(xì)胞核周圍也可看到顆粒狀分布。PAN組Park7蛋白在細(xì)胞膜上表達(dá)較對照組明顯增多，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布亦明顯增多，呈不均勻團(tuán)狀分布，熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。FK506組Park7蛋白表達(dá)分布較PAN組減少，熒光強(qiáng)度較PAN組降低。

3 討論

腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分為基底膜、血管內(nèi)皮細(xì)胞及足細(xì)胞，可阻止白蛋白從血液中進(jìn)入尿液，避免蛋白丟失，其完整性遭到損傷可導(dǎo)致腎臟病變。在PAN建立腎小球足細(xì)胞損傷經(jīng)典模型中，PAN直接損傷細(xì)胞分子結(jié)構(gòu)及功能蛋白的表達(dá)，同時(shí)使腎小球固有細(xì)胞產(chǎn)生和釋放ROS而間接破壞腎小球?yàn)V過膜，最終導(dǎo)致腎小球損傷［14］。FK506是一種經(jīng)典鈣調(diào)磷酸酶抑制劑，體外實(shí)驗(yàn)顯示通過抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子和核因子κB活化T細(xì)胞核因子的活性，進(jìn)一步抑制了炎癥 細(xì) 胞 因 子（IL-2、IL-6和IL-8）的 分 泌［15］。Rosenstock等［16］和Shen等［17］研究表明，F(xiàn)K506可調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2、caspase-3及Bad等凋亡因子的表達(dá)，減少足細(xì)胞凋亡，并可通過增加膜蛋白podocin、突觸足蛋白等的表達(dá)，穩(wěn)定細(xì)胞骨架，同時(shí)抑制PAN誘導(dǎo)的p38/JNK信號傳導(dǎo)，從而達(dá)到保護(hù)足細(xì)胞作用。

Park7基因位于染色體1p36.2-p36.3，屬于Thij/PfPI家族，在進(jìn)化上高度保守，人體和小鼠的基因相似，大約24 kb。Park7基因在人體中廣泛存在于大腦、肝臟、腎臟及卵巢等器官，近年來發(fā)現(xiàn)Park7參與腎臟疾病越來越受到研究者的重視［18］。Cuevas等［19］證實(shí)在高血壓腎病中，調(diào)節(jié)Park7在腎小管上皮細(xì)胞的表達(dá)，直接影響ROS的產(chǎn)生。Andres-Mateos等［20］發(fā)現(xiàn)Park7作為蛋白酶有清除線粒體過氧化氫的作用，穩(wěn)定線粒體自噬功能。位紅蘭等［21］研究表明在腎臟纖維化實(shí)驗(yàn)中，Park7的高表達(dá)可抑制第10號染色體缺失性磷酸酶和張力蛋白同源物的轉(zhuǎn)錄及翻譯，并改變其在細(xì)胞內(nèi)的分布，還可促進(jìn)PI3K/AKt通路的活化，說明當(dāng)有效抑制Park7的表達(dá)時(shí)可以延緩腎臟纖維化。沈孜穎等［22］研究證實(shí)高糖可導(dǎo)致氧化應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致抗氧化應(yīng)激損傷Park7/Nrf2重要通路失活，從而導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷的病理生理過程。Wang等［23］研究表明過表達(dá)Park7可降低Nrf2蛋白的泛素化，穩(wěn)定Nrf2的蛋白表達(dá)水平，下調(diào)Park7則會降低Nrf2蛋白的穩(wěn)定性。以上研究均提示Park7是維持腎臟正常生理功能的重要成分之一。

本研究在PAN刺激MPC-5后，隨著干預(yù)時(shí)間的變化，PAN引起足細(xì)胞明顯損傷，細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能受損。此外，PAN組隨著干預(yù)時(shí)間的延長，細(xì)胞凋亡率逐漸升高，可能與促細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的活性增強(qiáng)密切相關(guān)。PAN直接損傷及通過間接信號途徑參與破壞足細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及其分子功能，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高，損傷腎小球結(jié)構(gòu)完整性，可引起蛋白尿。PAN刺激足細(xì)胞后，可見Park7 mRNA和蛋白表達(dá)上調(diào)。當(dāng)PAN刺激足細(xì)胞時(shí)引起細(xì)胞核內(nèi)Park7磷酸化失活，活性Park7含量的下降引起代償性mRNA表達(dá)增高，同時(shí)由于外源性細(xì)胞質(zhì)中的活性Park7減少，使得其抗氧化能力也隨之下降，無法及時(shí)清除ROS，異常積累的ROS可導(dǎo)致線粒體發(fā)生腫脹，細(xì)胞膜通透性增高，細(xì)胞進(jìn)一步出現(xiàn)明顯損傷。免疫熒光結(jié)果顯示經(jīng)PAN刺激后，Park7分布增多，呈密集團(tuán)狀分布。我們考慮，當(dāng)PAN刺激足細(xì)胞發(fā)生劇烈氧化反應(yīng)時(shí)，胞漿中的Park7蛋白可移位至線粒體中，并形成二聚體，免疫熒光明顯增強(qiáng)［24］。在本研究中，PAN組足細(xì)胞Park7 mRNA及蛋白的表達(dá)變化是一致的，符合mRNA轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯的調(diào)控機(jī)制。隨著時(shí)間的推移，在PAN刺激及氧化應(yīng)激反應(yīng)持續(xù)狀態(tài)下，Park7失代償性升高，進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷加重。

我們觀察FK506干預(yù)損傷的足細(xì)胞，其損傷較PAN組減輕，細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)均更為清晰，細(xì)胞間連接較PAN組緊密，細(xì)胞凋亡率也較PAN組下降，存活的足細(xì)胞數(shù)量增加，提示FK506對足細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及功能具有保護(hù)作用，有效降低足細(xì)胞損傷，提高足細(xì)胞的存活率。FK506干預(yù)后，Park7 mRNA及其蛋白表達(dá)均明顯低于PAN組，說明FK506可通過改善Park7 mRNA的轉(zhuǎn)錄及蛋白翻譯，穩(wěn)定細(xì)胞Park7的表達(dá)，減輕PAN對足細(xì)胞的損傷，協(xié)助維持正常的足細(xì)胞mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白翻譯功能。與此同時(shí)，F(xiàn)K506干預(yù)后，免疫熒光結(jié)果顯示Park7在細(xì)胞膜內(nèi)分布較PAN組減少，細(xì)胞核周圍可見顆粒狀分布，較PAN組明顯減輕，與Western blot結(jié)果相一致，也證實(shí)FK506可有效拮抗PAN誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷，穩(wěn)定Park7蛋白的表達(dá)。綜合上述結(jié)果我們考慮可能的作用機(jī)制為：PAN可通過激活p38/MAPK信號通路，引起足細(xì)胞中促凋亡蛋白的高表達(dá)，而FK506參與p38/MAPK信號通路，有效降低p38/MAPK蛋白的水平，從而抑制下游相關(guān)基因的表達(dá)［17］。另外，F(xiàn)K506可通過調(diào)節(jié)Bax、caspase-3等蛋白的表達(dá)，減輕PAN引起線粒體功能障礙，從而使線粒體自噬維持在穩(wěn)定的水平［25］。

綜上，F(xiàn)K506通過非免疫機(jī)制發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞的功能，有效抑制PAN損傷足細(xì)胞，降低足細(xì)胞Park7表達(dá)。下一步研究將闡明FK506干預(yù)足細(xì)胞的具體分子通路，并探討Park7與足細(xì)胞突觸蛋白之間的調(diào)控作用。