核糖體蛋白RPL22在乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義*

朱一春，黃智奇，施靖天，顧長江，倪 侃，薛旦旦，張春輝

（1南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 226001；2南通大學(xué)附屬醫(yī)院甲乳外科；3南通市第一人民醫(yī)院甲乳外科）

乳腺癌(breast cancer,BC)是女性常見的惡性腫瘤,嚴(yán)重威脅女性健康[1]。目前乳腺癌的治療手段多種多樣,近年來人們逐漸將目光投向乳腺癌分子靶向領(lǐng)域[2]。核糖體蛋白L22(RPL22)在人體各種細(xì)胞中均有表達(dá)[3],有研究表明PRL22通過選擇性上調(diào)抑癌基因p53表達(dá),抑制癌細(xì)胞的集落形成,從而發(fā)揮抑癌作用[4]。本文選擇2015年—2019年于我科行乳腺癌改良根治術(shù)患者62例,研究RPL22在乳腺癌組織中的表達(dá)情況,并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 乳腺癌患者62例,均為女性,平均年齡57.3±11.8歲,中位年齡55.0歲,均未進(jìn)行術(shù)前治療,且無其他基礎(chǔ)疾病。手術(shù)獲取的乳腺癌組織及癌旁組織各62例標(biāo)本,-80℃下凍存。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)同意,并獲得患者知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫熒光法檢測RPL22表達(dá)：將石蠟切片在60℃下烤片1 h,隨后二甲苯脫蠟10 min。依次加入100%、95%、90%、85%、80%、75%、60%、50%、30%乙醇中進(jìn)行梯度脫水,自來水沖洗1 min,雙氧水沖洗1 min。將切片浸入0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖液中,微波最大火力98℃～100℃加熱至沸騰,冷卻5～10 min,反復(fù)2次。冷卻至室溫后PBS洗滌3次,每次5 min。然后加入5%牛血清白蛋白,室溫下封閉20 min,洗去多余液體。滴加按1∶100比例稀釋的RPL22抗體進(jìn)行孵育,4℃過夜。第2天PBS洗滌3次,每次5 min,再滴加二抗室溫孵育1 h,PBS洗滌3次,每次5 min。然后加入DAPI液染核及適量抗淬滅劑,蓋上蓋玻片,鏡下觀察。

1.2.2 組織RNA提取：將組織標(biāo)本放入1.5 mL離心管中,加入1 mL TRIzol試劑,研磨器研磨,隨后按照說明書步驟提取總RNA。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及qRT-PCR檢測RPL22 mRNA表達(dá)：使用分光光度計(jì)對樣品中RNA進(jìn)行定量,參照cDNA合成試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA,每個(gè)樣品設(shè)置2個(gè)重復(fù)孔。RPL22上游引物序列為5'-GACAACTGAAAGGGGCTACCAAGG-3',下游引物為5'-GCACCACAAGGCACCAGAGTC-3',GADPH上游引物為5'-CGCTGAGTACGTCGTGGAGTC-3',下游引物為5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3'。PCR反應(yīng)體系為20μL,反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min,95℃變性15 s,60℃退火30 s和72℃延伸30 s,共45個(gè)循環(huán)。以無菌雙蒸水代替cDNA作為陰性對照。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參,按2-△△CT方法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以±s表示,組間比較采用成組資料t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)。用Pearson相關(guān)系數(shù)分析相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存曲線分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳腺癌及癌旁組織中RPL22的表達(dá) 免疫熒光法檢測顯示,RPL22在乳腺癌組織中的表達(dá)低于癌旁組織(圖1A)。qRT-PCR法檢測顯示,RPL22 mRNA在乳腺癌組織中的表達(dá)量亦明顯低于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)(圖1B、C)。

圖1 RPL22在乳腺癌及癌旁組織中的表達(dá)

2.2 乳腺癌及癌旁組織中RPL22表達(dá)量與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性 對RPL22表達(dá)量與乳腺癌患者臨床病理參數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示乳腺癌組織中RPL22表達(dá)量與腫瘤直徑(r=-0.403)、HER-2陽性(r=-0.390)、Ki67表達(dá)(r=-0.370)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(r=-0.422)以及三陰性乳腺癌(TNBC)(r=-0.311)呈負(fù)相關(guān),而與患者年齡、腫瘤TNM分級、腫瘤Grade分期、ER、PR以及脈管侵犯等無相關(guān)性。見表1。HER-2陽性定義為免疫組化結(jié)果為Cerb-2 3+或原位雜交HER-2陽性(擴(kuò)增)[5]。

表1 RPL22表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系例

2.3 TCGA數(shù)據(jù)庫中RPL22在乳腺癌組織中的表達(dá)以及與預(yù)后的關(guān)系 通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫,發(fā)現(xiàn)與對照的乳腺組織相比,RPL22在乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯降低(圖2A)。Kaplan-Meier生存曲線分析顯示,RPL22低表達(dá)組總生存率低于高表達(dá)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.036)(圖2B)。

圖2 RPL22在乳腺癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

3 討 論

核糖體蛋白(RPs)是核糖體的主要成分,可催化細(xì)胞質(zhì)中蛋白質(zhì)生物合成。越來越多的證據(jù)表明,核糖體蛋白在調(diào)節(jié)發(fā)育和疾病進(jìn)展中起著關(guān)鍵作用[6],同時(shí)也參與細(xì)胞增殖和凋亡等生理過程[7]。人類部分癌癥可激活TOR(target of rapamycin)通路,驅(qū)動核糖體的生物合成,促使癌細(xì)胞不斷增長[8]。RPL22作為核糖體蛋白家族成員,參與人體內(nèi)多種生物途徑。已有研究表明其與抑癌基因p53密切相關(guān),它通過抑制MDM2而激活p53,進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖[4,9]。此外也有研究證實(shí)RPL22在體外與酪蛋白激酶2α(CK2α)相互作用,抑制其底物的磷酸化,導(dǎo)致CK2α的失調(diào),從而影響細(xì)胞增殖和凋亡,具備抑制癌癥的作用[10]。這些研究揭示了RPL22在腫瘤抑制上的多種作用機(jī)制,展現(xiàn)其巨大的研究價(jià)值。

本研究顯示,RPL22在乳腺癌組織中的表達(dá)水平低于癌旁組織,RPL22表達(dá)水平與腫瘤大小、HER-2陽性、Ki67表達(dá)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及三陰性乳腺癌的發(fā)生呈負(fù)相關(guān)。我們發(fā)現(xiàn)這些與RPL22表達(dá)差異相關(guān)的因素在臨床中往往預(yù)示患者腫瘤進(jìn)展程度以及術(shù)后風(fēng)險(xiǎn)。例如當(dāng)RPL22表達(dá)越低時(shí),腫瘤直徑就越大,TNM分期也就越高。術(shù)后病理檢測表明,在RPL22表達(dá)較低的腫瘤中,出現(xiàn)HER-2陽性、Ki67高表達(dá)以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移更多,三陰性乳腺癌也顯著增多,這些都與乳腺癌的惡性程度以及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)[11]。另外,我們檢索了TCGA數(shù)據(jù)庫,使用Kaplan-Meier生存曲線進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)低表達(dá)RPL22的患者總生存時(shí)間低于高表達(dá)的患者(P=0.036),提示RPL22在乳腺癌患者體內(nèi)的抑癌作用。RPL22有望成為乳腺癌診斷和預(yù)后新的標(biāo)志物,并為治療提供新的靶點(diǎn)。