多糖疫苗中十六烷基三甲基溴化銨和去氧膽酸殘留量液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法的建立及驗(yàn)證

李茂光，龍珍，陳瓊，李月琪，許美鳳，王春娥，李亞南，葉強(qiáng)

1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京102629；2.島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司，北京100020

多糖疫苗是疫苗重要類型之一［1］，如23價(jià)肺炎球菌多糖疫苗（23-valent pneumococcal polysaccharide vaccine，PPSV-23）［2］。PPSV-23自上市以來，廣泛用于2歲以上人群的免疫，在預(yù)防肺炎球菌感染中發(fā)揮了重要作用，尤其對(duì)老年人和艾滋病患者［3］，PPSV-23是全球排名前十的高銷量疫苗品種之一。同時(shí)，多糖疫苗也是多糖蛋白結(jié)合疫苗的基礎(chǔ)，如腦膜炎球菌結(jié)合疫苗［4-5］和b型流感嗜血桿菌（Haemophilus influenzaetype b，Hib）結(jié)合疫苗［6］。多糖疫苗和多糖蛋白結(jié)合疫苗中的多糖生產(chǎn)過程相似［7］，去氧膽酸（deoxycholic acid，OBA）用于PPSV-23收獲液的殺菌，腦膜炎球菌多糖疫苗生產(chǎn)無需該試劑，但大部分多糖疫苗和多糖蛋白結(jié)合疫苗均以十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）作為多糖純化劑。

OBA和CTAB均為弱紫外（無紫外）吸收，未經(jīng)衍生難以用紫外／可見光檢測(cè)和定量。疫苗基質(zhì)復(fù)雜，紫外／可見光檢測(cè)受基質(zhì)干擾較大，靈敏度和重復(fù)性受到較大限制。通用型檢測(cè)器可用于弱紫外化合物的直接檢測(cè)［8-9］，無須衍生，但該類檢測(cè)器靈敏度較低且受基質(zhì)干擾較大，不適合疫苗基質(zhì)中微量殘留物質(zhì)的檢測(cè)。GIRARD等［10］研發(fā)了一種固相萃取-液相色譜方法用于流感疫苗中OBA的檢測(cè)，但該方法靈敏度較低，前處理過于繁瑣，不利于普及?！吨袊?guó)藥典》三部（2020版）采用衍生-紫外分光光度法檢測(cè)殘留的OBA［11］，但該方法無分離選擇性、易受基質(zhì)干擾，且靈敏度較低。目前未見CTAB的檢測(cè)方法相關(guān)報(bào)道。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS／MS）法兼具LC的分離能力及前體離子與產(chǎn)物離子雙重選擇性（MRM模式），可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度和抗基質(zhì)干擾能力，適用于快速檢測(cè)［2，12-13］。魏瑞成等［14］采用固相萃取-LCMS／MS法成功定量檢測(cè)出牛奶中殘留的CTAB。為了解多糖疫苗中CTAB和OBA的殘留情況，本研究建立采用液相分離及MRM模式的LC-MS／MS方法，并進(jìn)行方法的驗(yàn)證，以期用于多糖疫苗中OBA和CTAB殘留量的檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 對(duì)照品及樣品CTAB（57-09-0）和OBA（83-44-3）對(duì)照品購自美國(guó)Sigma公司；肺炎球菌多糖（1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17A、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型）、3批Hib粗糖及其對(duì)應(yīng)批次精糖、3批A、C、Y、W135群腦膜炎球菌粗糖及其對(duì)應(yīng)批次精糖均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，其中腦膜炎球菌多糖溶液和Hib多糖溶液含糖量為5 g／L。

1.2 主要試劑及儀器 甲酸銨（MS級(jí)）及甲酸（MS級(jí)）購自美國(guó)Acros公司；乙腈（HPLC級(jí)）購自美國(guó)默克公司；三氟乙酸購自美國(guó)Sigma公司；Kinetex C18（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）色譜柱購自美國(guó)菲羅門公司；液相色譜質(zhì)譜系統(tǒng)購自日本島津公司。

1.3 方法的建立

1.3.1 色譜條件 色譜柱為Kinetex C18（2.1 mm×50 mm，2.6 μm）。流動(dòng)相A：5 mmol／L甲酸銨（pH 4.0）；流動(dòng)相B：乙腈，梯度：0~1.0 min 40%B，1.0~3.0 min 90%B，3.0~4.0 min 90%B，4.0~4.1 min 90%~40% B，4.1~6.0 min 40% B；柱溫：35℃；流速：0.3 mL／min；進(jìn)樣體積：2 μL；進(jìn)樣清洗：泵清洗（進(jìn)樣前后清洗），洗針方式為清洗口+清洗泵（針內(nèi)外清洗），先清洗泵，后清洗口。清洗口清洗液：R0為50%甲醇水，R1為0.1%甲酸水溶液，R2為100 mmol／L甲酸銨水溶液（pH 4）；清洗泵清洗液R3為甲醇、乙腈、乙醇、異丙醇、水、三氟乙酸的混合液（體積比200∶200∶200∶200∶200∶5）。

1.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：ESI，正負(fù)離子同時(shí)檢測(cè)模式；霧化氣流速：3.0 L／min；干燥氣流速：10 L／min；駐留時(shí)間：30 ms；接口溫度：300℃；DL溫度：220℃；接口電壓：4.0 kV；MRM參數(shù)：CTAB檢測(cè)離子（m／z）為284.3→60.1，Q1 Pre Bias-15 V，CE-29 V，Q3 Pre Bias-24V；OBA檢測(cè)離子（m／z）為391.3→345.2和391.3→327.1，Q1 Pre Bias均為15 V，CE分別為33和35 V，Q3 Pre Bias分別為22和20 V，其中391.3→345.2為定量離子。

1.4 方法的驗(yàn)證

分別稱取CTAB和OBA對(duì)照品10 mg，用50%乙腈水溶液配制成10 mg／L的對(duì)照品母液。

1.4.1 線性范圍 用50%乙腈水溶液將CTAB對(duì)照品母液配制成濃度為50、25、12.5、6.25、3.13、

1.56 μg／L的對(duì)照品溶液，將OBA對(duì)照品母液配制成濃度為100、50、25、12.5、6.25 μg／L的對(duì)照品溶液，采用1.3項(xiàng)色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)。以對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程，并計(jì)算R2值。

1.4.2 精密性 用50%乙腈水溶液分別將CTAB及OBA對(duì)照品母液稀釋為1.593和1.56 μg／L的對(duì)照品溶液，采用1.3項(xiàng)色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算出峰時(shí)間及峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.4.3 準(zhǔn)確度 分別取CTAB及OBA對(duì)照品母液100 μL，用50%乙腈水溶液稀釋至1 mL（對(duì)照）；分別取900 μL肺炎球菌多糖（1、3、4、5、6B和19A型）、腦膜炎球菌精糖（A、C群）及Hib精糖，加入100 μL 50%乙腈水（樣品）；分別取900 μL上述樣品，加入至100 μL對(duì)照品母液中（加標(biāo)樣品），采用1.3項(xiàng)色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)，并按下式計(jì)算回收率。

回收率（%）=（加標(biāo)樣品-樣品）／對(duì)照×100%

1.4.4 檢出限及定量限 參照ASTM法原則，即檢出限濃度目標(biāo)化合物S／N不小于3，定量限濃度目標(biāo)化合物S／N不小于10的原則確定方法的檢出限及定量限。分別取CTAB及OBA對(duì)照品母液，用50%乙腈水稀釋至1～2 μg／L，采用1.3項(xiàng)色譜及質(zhì)譜條件進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 方法的應(yīng)用 取23批肺炎球菌多糖（1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17A、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型）、3批Hib粗糖和精糖、3批A、C、Y、W135群腦膜炎球菌粗糖和精糖，用50%乙腈水溶液稀釋2～300倍，采用1.3項(xiàng)色譜及質(zhì)譜條件檢測(cè)CTAB及OBA殘留量。

2 結(jié)果

2.1 方法的驗(yàn)證

2.1.1 線性范圍CTAB和OBA典型色譜質(zhì)譜圖見圖1，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。CTAB濃度在1.56～50 μg／L范圍時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=133 056X-290 15，R2=0.999 9；OBA濃度在6.25～100 μg／L范圍時(shí)，與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=250.5X-59.1，R2=0.999 7。

圖1 OBA和CTAB的色譜圖Fig.1 Chromatogram of OBA and CTAB

圖2 CTAB（A）和OBA（B）的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of CTAB（A）and OBA（B）

2.1.2 精密性O(shè)BA對(duì)照品溶液6次重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)的保留時(shí)間和峰面積的RSD分別為0.15%和1.42%，CTAB對(duì)照品溶液6次重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)的保留時(shí)間和峰面積RSD分別為0.16%和1.50%，均＜2%，見表1。表明該方法具有良好的精密性。

表1 精密性驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 Verification for precision

2.1.3 準(zhǔn)確度OBA和CTAB加標(biāo)回收率在91.8%～103.5%之間，均在80%～115%范圍內(nèi)，見表2。表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表2 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果（%）Tab.2 Verification for accuracy（%）

2.1.4 定量限及檢出限OBA的檢出限為1.02 μg／L（S／N=5.6），定量限為2.04 μg／L（S／N=10.2）；CTAB的定量限為1.56 μg／L（S／N=77.4）。

2.2 方法的應(yīng)用

2.2.1 肺炎球菌多糖4、9N、9V和15B型肺炎球菌多糖無明顯CTAB檢出，其他血清型均有不同程度檢出。與CTAB比較，OBA的殘留較少，甚至大部分血清型的肺炎球菌多糖中無明顯OBA檢出。見圖3（以19A和23F型為例）和表3。

表3 23種血清型肺炎球菌多糖中OBA和CTAB的殘留量（μg／L）Tab.3 Residual contents of OBA and CTAB in 23 serotypes of pneumococcal polysaccharides（μg／L）

圖3 19A（A）和23F型（B）肺炎球菌多糖中OBA和CTAB殘留量的檢測(cè)Fig.3 Determination of residual OBA and CTAB contents in pneumococcal polysaccharide of serotypes 19A（A）and 23F（B）

2.2.2 腦膜炎球菌多糖3批A、C、Y、W135腦膜炎球菌粗糖中CTAB殘留量為112.40~1 709.60 μg／L，對(duì)應(yīng)批次精糖中CTAB殘留量為0.08~43.20 μg／L，見表4。

表4 腦膜炎球菌粗糖和精糖中CTAB的殘留量Tab 4.Residual CTAB contents in crude and purified meningococcal polysaccharides

2.2.3 Hib多糖3批Hib粗糖中CTAB殘留量分別為1 265.10、1 189.00和1 513.30 μg／L，對(duì)應(yīng)批次粗糖中CTAB殘留量分別為6.50、166.60、6.65 μg／L。

3 討論

本研究建立了用于同時(shí)定量測(cè)定CTAB和OBA的快速、高選擇性和高靈敏度的LC-MS／MS方法，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定OBA檢測(cè)離子（m／z）為391.3→345.2和391.3→327.1，CTAB檢測(cè)離子（m／z）為284.3→60.1，該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符［14］。CTAB等季胺型表面活性劑極易在系統(tǒng)中殘留，導(dǎo)致測(cè)試結(jié)果出現(xiàn)偏差，前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定CTAB最易殘留的位置為進(jìn)樣系統(tǒng)。因此，本實(shí)驗(yàn)采用清洗泵+清洗口的清洗方式進(jìn)行清洗，該方式可利用清洗泵清洗液的強(qiáng)清洗能力去除殘留的三氟乙酸消除洗針液對(duì)OBA檢測(cè)的影響。

本研究線性驗(yàn)證結(jié)果表明，CTAB濃度在1.56～50 μg／L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=133 056X-290 15，R2=0.999 9；OBA濃度在6.25～100 μg／L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=250.5X-59.1，R2=0.999 7。OBA及CTAB對(duì)照品6次重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)的保留時(shí)間和峰面積RSD均＜2%，表明該方法具有良好的精密性。OBA和CTAB加標(biāo)回收率均在80%～115%范圍內(nèi)，表明該方法具有良好的準(zhǔn)確度。準(zhǔn)確度驗(yàn)證中采用的樣品分別為肺炎球菌多糖1、3、4、5、6B和19A型，涵蓋了弱酸性多糖（含有羧基，1型-三分之二糖單元含羧基、3型-二分之一糖單元含羧基、4型-四分之一糖單元含羧基、5型-五分之一糖單元含羧基）和中強(qiáng)酸性多糖（含有磷酸基團(tuán)，6B型-四分之一糖單元含磷酸基團(tuán)、19A型-三分之一糖單元含磷酸基團(tuán)），用這些典型的樣品代替全部樣品進(jìn)行驗(yàn)證。OBA的檢出限為1.02 μg／L，定量限為2.04 μg／L；受CTAB殘留影響，無法測(cè)試CTAB的檢出限和定量限，本研究以不干擾CTAB線性測(cè)試的最低濃度1.56 μg／L作為CTAB的方法定量限。采用低殘留進(jìn)樣系統(tǒng)和獨(dú)特的洗針方式后，CTAB的殘留較小，與已報(bào)道的LC-MS／MS定量法比較［15］，靈敏度有所提升，且無需復(fù)雜前處理步驟。

肺炎球菌多糖中OBA和CTAB定量檢測(cè)結(jié)果顯示，除4、9N、9V和15B型多糖無明顯CTAB檢出外，其他型別均有不同程度檢出，其中3型肺炎球菌多糖CTAB的含量高達(dá)12.1 mg／L。不同血清型多糖純化工藝中CTAB的添加量及后續(xù)純化步驟的差異均會(huì)導(dǎo)致最終CTAB殘留量的不同。從結(jié)構(gòu)分析，3型多糖疫苗中50%以上糖單元含有羧基，4、9N、9V和15B型多糖疫苗結(jié)構(gòu)中，負(fù)電荷基團(tuán)所占比例均較低（摩爾比為1／4～1／5）。負(fù)電荷基團(tuán)（如羧基）越多表明與CTAB的結(jié)合率越高，可能是導(dǎo)致不同血清型多糖疫苗中CTAB殘留量不同的原因之一。另外，CTAB易在系統(tǒng)中殘留，若使用CTAB進(jìn)行純化多糖的容器清洗不充分，該容器在承裝其他不采用CTAB純化的多糖時(shí)，可能會(huì)造成CTAB污染。本實(shí)驗(yàn)中肺炎球菌多糖除3型以外，其他多糖未采用CTAB純化，但在多種多糖中均有不同程度CTAB檢出，推測(cè)可能由于容器去除CTAB不徹底所致。與CTAB比較，OBA的殘留較少，甚至大部分血清型的多糖疫苗中無明顯OBA檢出。其原因可能為：OBA的添加量較少；OBA在多糖疫苗工藝中最早添加（培養(yǎng)終止時(shí)即已添加），后續(xù)純化工藝中添加的試劑（如CTAB、乙醇和丙酮）均可去除殘留的OBA。腦膜炎球菌粗糖樣品中，同血清型樣品的殘留CTAB含量差異可反應(yīng)純化工藝的差異和批間穩(wěn)定性，3批腦膜炎球菌粗糖和對(duì)應(yīng)批次精糖均有不同程度的CTAB檢出。與粗糖比較，各血清型精糖樣品中CTAB的含量均有大幅降低，均＜50 μg／L，按雜質(zhì)含量百分比計(jì)算不足0.001%，表明精制步驟可有效去除CTAB。3批Hib多糖的粗糖中CTAB殘留量為1 100～1 600 μg／L，精糖中CTAB殘留量顯著降低，精制步驟可有效去除CTAB。雖然精制多糖中殘留CTAB占產(chǎn)品質(zhì)量百分比不到0.004%，但第2批CTAB殘留量顯著高于1和3批，一定程度上反應(yīng)了純化工藝穩(wěn)定性尚有提升空間。

綜上所述，本研究建立的LC-MS／MS法可同時(shí)定量CTAB和OBA，上機(jī)分析前僅需溶解和稀釋樣品即可，無需復(fù)雜前處理。同時(shí)，該方法耗時(shí)短，9 min內(nèi)可完成CTAB和OBA的同時(shí)測(cè)定，并具有良好的精密性及準(zhǔn)確度，可用于多種多糖疫苗及多糖結(jié)合疫苗的粗糖和精糖中CTAB和OBA殘留量的測(cè)定。