第二代腸道病毒71型（EV71）抗原國家標(biāo)準(zhǔn)品的建立

高帆，卞蓮蓮，吳星，么山山，王一平，毛群穎，梁爭論

中國食品藥品檢定研究院，北京102629

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是一種常見于5歲以下嬰幼兒和兒童的傳染性疾病，少數(shù)患兒可并發(fā)病毒性腦炎、腦干腦炎、肺水腫和急性弛緩性麻痹等重癥，甚至死亡［1-2］。腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是導(dǎo)致重癥HFMD的主要病原體，90%以上的死亡HFMD病例均由EV71所致［3-4］。我國是迄今唯一生產(chǎn)EV71疫苗的國家，已有3家企業(yè)研發(fā)的EV71滅活疫苗（C4亞型）相繼獲批上市［1，4-5］，分別為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所（昆明所）、北京科興生物制品有限公司（科興公司）和武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司（武漢所）。目前EV71疫苗已簽發(fā)上市8 000余萬劑，顯著降低了我國EV71-HFMD死亡人數(shù)［6］。

EV71疫苗抗原含量檢測是質(zhì)量控制和劑量確定的關(guān)鍵指標(biāo)［7］。2010年，中國食品藥品檢定研究院（中檢院）與我國主要EV71疫苗研發(fā)實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合建立了第一代EV71抗原國家標(biāo)準(zhǔn)品，賦值1 600 U／mL［8］，并證明了抗原含量與疫苗免疫原性的相關(guān)性，直接支撐了我國EV71疫苗從臨床前研發(fā)、臨床研究到上市后的順利銜接，有效保證了我國EV71疫苗質(zhì)量的一致性和有效性。研究成果得到世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的高度認(rèn)可。隨后中檢院與英國國家生物制品檢定所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC）進(jìn)一步合作，以我國第一代EV71抗原國家標(biāo)準(zhǔn)品為依據(jù)創(chuàng)建了EV71抗原國際標(biāo)準(zhǔn)品，并于2019年獲得ECBS（Expert Committee on Biological Standardization）審批正式成為第1代EV71抗原國際標(biāo)準(zhǔn)品（賦值14 500 IU／mL）［9］，為全球EV71疫苗研發(fā)及應(yīng)用提供了科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

本研究對第一代EV71抗原國家標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行換代，建立第二代EV71抗原國家標(biāo)準(zhǔn)品。兩代標(biāo)準(zhǔn)品的生產(chǎn)及凍干工藝一致。第二代標(biāo)準(zhǔn)品以國家單位（U／mL）賦值，用于我國EV71疫苗生產(chǎn)企業(yè)依據(jù)國家藥品標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制，為EV71疫苗一致性評價(jià)提供保障；同時(shí)溯源至國際單位（IU／mL），為進(jìn)行WHO EV71疫苗指南［10］提出的全球范圍內(nèi)EV71疫苗質(zhì)量和保護(hù)效果標(biāo)準(zhǔn)化評價(jià)，促進(jìn)我國獨(dú)創(chuàng)EV71疫苗申請WHO預(yù)認(rèn)證、走入國際市場以及全球HFMD防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)品1stInternational Standard for Enterovirus A71 inactivated vaccine由NIBSC保存，code number：18／116，賦值：14 500 IU／mL，編號(hào)：WHO IS；第一代EV71抗原國家標(biāo)準(zhǔn)品由中檢院保存，品種編號(hào)：300016-201001，賦值：1 600 U／mL，編號(hào)：NS。

1.2 候選標(biāo)準(zhǔn)品 由科興公司依據(jù)《腸道病毒71型滅活疫苗（Vero細(xì)胞）制造及檢定規(guī)程》（YBS0-0332015），采用EV71病毒株（H07株）接種非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞），經(jīng)培養(yǎng)、收獲病毒液、滅活病毒、濃縮、純化和加入凍干劑后凍干制備而成。候選標(biāo)準(zhǔn)品編號(hào)：CS。裝量均勻性：裝量平均值為0.5187 g／瓶，CV為0.7%；抗原均勻性：抗原含量平均值為2 332 U／mL，CV為5%；水分為2.8%，CV為0.5%。

1.3 協(xié)作標(biāo)定 由中檢院肝炎室牽頭，依據(jù)《WHO manual for the establishment of national and other secondary standards for vaccines》［11］以及《中國藥典》三部（2020）版的相關(guān)要求和理念，聯(lián)合3家EV71滅活疫苗已獲批上市的生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定。4個(gè)協(xié)作實(shí)驗(yàn)室隨機(jī)編號(hào)為lab1~4。中檢院負(fù)責(zé)分發(fā)WHO IS、NS和CS，由4個(gè)協(xié)作實(shí)驗(yàn)室按各自試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作程序（standard operating procedure，SOP）對候選標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行6次獨(dú)立檢測。其中l(wèi)ab1采用通用試劑盒［9］，lab2~4采用企業(yè)內(nèi)控試劑盒。

1.4 適用性EV71收獲液、原液和疫苗的編號(hào)分別為H、B和V，由武漢所、昆明所和科興公司自行制備。解離方法根據(jù)各實(shí)驗(yàn)室SOP執(zhí)行。3個(gè)實(shí)驗(yàn)室（編號(hào)lab2~4）依據(jù)各自內(nèi)控試劑盒SOP，以WHO IS、NC和CS為標(biāo)準(zhǔn)品，分別對企業(yè)自制的EV71收獲液、原液和疫苗各進(jìn)行6次獨(dú)立檢測。

1.5 穩(wěn)定性 采用3人3平行對CS抗原含量進(jìn)行檢測，共計(jì)27次，確定抗原含量基點(diǎn)值。加速穩(wěn)定性：將CS置2~8和37℃條件下0~56 d，各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次獨(dú)立檢測。以抗原含量基點(diǎn)值為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各時(shí)間點(diǎn)抗原含量殘留率。復(fù)溶穩(wěn)定性：將CS復(fù)溶后置2~8℃保存1、3、5和7 d后檢測抗原含量，并計(jì)算復(fù)溶后各時(shí)間點(diǎn)的抗原含量殘留率。凍融穩(wěn)定性：將CS復(fù)溶后置-20℃條件下反復(fù)凍融1~5次后，檢測抗原含量，計(jì)算反復(fù)凍融后的抗原含量殘留率。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 全部原始數(shù)據(jù)匯總至中檢院，由中檢院采用Statistic軟件進(jìn)行雙平行線法計(jì)算：在5%的顯著性水平下，雙平行線的平行性或線性出現(xiàn)顯著性差異，或獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的95%置信區(qū)間大于80%~120%時(shí)，檢測結(jié)果無效。對有效結(jié)果采用Microsoft Office Excel軟件計(jì)算平均值、CV和95%置信區(qū)間等。

2 結(jié)果

2.1 協(xié)作標(biāo)定WHO IS與CS以及NS與CS均具有良好的平行性和線性，見圖1。以WHO IS為標(biāo)準(zhǔn)檢測CS的結(jié)果顯示，CS檢測的平均值為2 316 IU／mL，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV為4.3%~9.3%，實(shí)驗(yàn)室間CV為7.1%，95%置信區(qū)間為2 229~2 403 IU／mL。以NS為標(biāo)準(zhǔn)檢測CS的結(jié)果顯示，CS檢測平均值為2 437 U／mL，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)CV為3.9%~10.7%，實(shí)驗(yàn)室間CV為5.3%，95%置信區(qū)間為2 355~2 519 U／mL。見表1。協(xié)作標(biāo)定累積圖顯示，各實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果分布均較為集中，見圖2。標(biāo)定結(jié)果，將候選標(biāo)準(zhǔn)品賦值為2 320 IU／mL（相當(dāng)于2 440 U／mL）。

圖2 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果的累積圖Fig.2 Cumulative graph of collaborative calibration result

表1 協(xié)作標(biāo)定結(jié)果（n=6）Tab.1 Result of collaborative calibration（n=6）

圖1 協(xié)作標(biāo)定的平行性和線性Fig.1 Parallelism and linearity in collaborative calibration

2.3 適用性

2.3.1 平行性和線性3家實(shí)驗(yàn)室（lab2~4）采用內(nèi)控試劑盒，對自制的EV71收獲液、原液和疫苗抗原含量進(jìn)行6次獨(dú)立檢測。結(jié)果顯示，以CS為標(biāo)準(zhǔn)檢測各種樣品均具有較好的平行性和線性，見圖3。

圖3 適用性的平行性和線性驗(yàn)證Fig.3 Parallelism and linearity in verification for suitability

2.3.2 準(zhǔn)確性 以CS為標(biāo)準(zhǔn)與以WHO IS為標(biāo)準(zhǔn)的檢測結(jié)果比較，準(zhǔn)確率為92%~101%；以CS為標(biāo)準(zhǔn)與以NS為標(biāo)準(zhǔn)的檢測結(jié)果比較，準(zhǔn)確率為93%~102%。準(zhǔn)確率均位于90%~110%之間，見表2。

表2 準(zhǔn)確性結(jié)果Tab.2 Result of accuracy

2.2 候選標(biāo)準(zhǔn)品賦值 依據(jù)4個(gè)實(shí)驗(yàn)室完成的協(xié)作

2.4 穩(wěn)定性

2.4.1 加速穩(wěn)定性 采用3人3平行對CS抗原含量進(jìn)行檢測，共計(jì)27次，確定抗原含量基點(diǎn)值為2 256 U／mL（CV為6%）。在2~8和37℃條件下各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行3次獨(dú)立檢測，以抗原含量基點(diǎn)值為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算的各時(shí)間點(diǎn)的抗原含量殘留率均位于基點(diǎn)結(jié)果的90%~110 %之間，見表3。

表3 加速穩(wěn)定性結(jié)果Tab.3 Result of accelerated stability test

2.4.2 復(fù)溶穩(wěn)定性 以抗原含量基點(diǎn)值2 256 U／mL為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算復(fù)溶后各時(shí)間點(diǎn)的抗原含量殘留率，結(jié)果顯示，復(fù)溶后2~8℃保存1、3、5和7 d的抗原含量殘留率分別為101%、108%、108%和108%，均未超過90%~110%，見表4。

表4 復(fù)溶后2~8℃的穩(wěn)定性結(jié)果（n=3）Tab.4 Stability after reconstitution and storage at 2~8℃（n=3）

2.4.3 凍融穩(wěn)定性 以抗原含量基點(diǎn)值2 256 U／mL為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算反復(fù)凍融后候選標(biāo)準(zhǔn)品的抗原含量殘留率，結(jié)果顯示，反復(fù)凍融1、3和5次后，抗原含量殘留率分別為95%、96%和91%，未超過90%~110%，見表5。

表5 凍融穩(wěn)定性結(jié)果（n=3）Tab.5 Stability after freezing and thawing（n=3）

3 討論

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對疫苗的質(zhì)量控制和評價(jià)具有重要意義［12］。中檢院已建立了EV71疫苗抗原國家標(biāo)準(zhǔn)品［8］、中和抗體國家標(biāo)準(zhǔn)品［8］和效力國家參考品［13］共3個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以及EV71標(biāo)準(zhǔn)檢測毒株。一系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為EV71疫苗的全面質(zhì)量控制提供標(biāo)尺。同時(shí)，為了推動(dòng)我國EV71疫苗的國際化，中檢院聯(lián)合NIBSC共同主導(dǎo)成功研制了第一代EV71中和抗體國際標(biāo)準(zhǔn)品［14］和第一代EV71抗原國際標(biāo)準(zhǔn)品［15］，表明我國生物制品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制水平已與國際接軌，提升了我國在疫苗國際標(biāo)準(zhǔn)領(lǐng)域的話語權(quán)。

本研究建立的第二代EV71抗原國家標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)均勻性和穩(wěn)定性考核合格后，分發(fā)給4個(gè)實(shí)驗(yàn)室，采用通用試劑盒或內(nèi)控試劑盒進(jìn)行協(xié)作標(biāo)定和適用性研究，最終賦值為2 320 IU／mL（相當(dāng)于2 440 U／mL）。其中通用試劑盒為中檢院與NIBSC聯(lián)合研制，曾分發(fā)給全球14個(gè)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行第一代EV71抗原國際標(biāo)準(zhǔn)品的協(xié)作標(biāo)定［7］。結(jié)果顯示該試劑盒可適用于EV71不同基因型抗原含量檢測，檢測結(jié)果具有較好的一致性，且實(shí)驗(yàn)室間CV較內(nèi)控試劑盒更低，特別是檢測單抗CT11F9為具有中和活性的構(gòu)象單抗，具有交叉反應(yīng)性好、中和效價(jià)高、體內(nèi)保護(hù)效果好和位點(diǎn)清晰的特點(diǎn)［15-16］，可作為EV71疫苗體外效力評價(jià)的通用質(zhì)控方法。

EV71疫苗效力評價(jià)采用體外效力和體內(nèi)效力雙指標(biāo)［7］。其中體內(nèi)效力為用BALB／c小鼠檢測ED50，存在變異大、周期長以及使用大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不符合動(dòng)物倫理3R原則等問題，歐洲替代方法驗(yàn)證中心提倡研究體外相對效力的方法代替動(dòng)物體內(nèi)法。對于EV71疫苗，體外效力檢測抗原含量具有結(jié)果精密度高、檢測周期短、操作便捷、影響因素少，以及符合3R原則等優(yōu)勢，特別是采用中和活性單抗建立的通用試劑盒，對保證體外抗原與體內(nèi)效力一致性，提高疫苗生產(chǎn)和質(zhì)控準(zhǔn)確性，保證疫苗質(zhì)量可控和批間一致性具有重要意義。