CXC亞家族趨化因子13在乳腺癌組織中表達及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的生物信息學(xué)分析

李英蕊，李琴，解軍，馮皓楠，郭璇，傅松濤，4

1.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，山西太原030000；

2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院腫瘤科，北京100021；

3.山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，山西太原030000；

4.山西省生物醫(yī)藥健康研究生教育創(chuàng)新中心，山西太原030000

隨著傳統(tǒng)放化療、內(nèi)分泌治療及靶向藥物的應(yīng)用，乳腺癌患者5年生存率得到極大提高，但乳腺癌發(fā)病率及死亡率仍在增長［1］。從分子水平研究乳腺癌機制，尋找新的治療方法，是探索乳腺癌治療的重要方向。腫瘤細胞的增殖、浸潤由多種生長因子、趨化因子及細胞因子通過復(fù)雜的交互作用介導(dǎo)，其中趨化因子發(fā)揮重要的趨化作用，在多種炎癥反應(yīng)中激活特異性白細胞［2］。CXC亞家族趨化因子13（CXC subfamily chemokine 13，CXCL13）在腫瘤細胞生存及癌癥轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用［3］，CHU等［4］發(fā)現(xiàn)了兩種對乳腺癌起關(guān)鍵作用的分子，CXCL13為其中之一。近來有研究表明，CXCL13可促進乳腺癌的進展及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［5-6］。

本文采用生物信息學(xué)方法分析CXCL13在乳腺癌組織中的表達及潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為進一步探討CXCL13在乳腺癌中的作用機制提供參考。

1 數(shù)據(jù)來源及分析

基于在線數(shù)據(jù)庫分析乳腺癌組織中CXCL13。檢索Oncomine數(shù)據(jù)庫（https：／／www.oncomine.org／）分析CXCL13在乳腺癌組織中表達，獲得CXCL13在多種乳腺癌組織中的轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)，并對GLüCK等［7］、CURTIS等［8］的研究結(jié)果及TCGA數(shù)據(jù)庫中的乳腺癌組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析；檢索c-BioPortal數(shù)據(jù)庫（http：／／www.cbioportal.org／）分析乳腺癌樣本中CXCL13基因的變化，對頻率變化前50個CXCL13鄰近基因用FunRich軟件進行基因本體論（Gene Ontology，GO）的生物學(xué)過程（biological processes，BP）、細胞組分（cellular component，CC）及分子功能（molecular function，MF）分類分析，用京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）進行信號通路分析，進一步繪制并分析頻率改變較高的前15個基因的生物互作網(wǎng)絡(luò)；檢索LinkedOmics數(shù)據(jù)庫（http：／／www.linkedomics.org／login.php），使用皮爾森相關(guān)系數(shù)分析與CXCL13變化有關(guān)的基因，并對正相關(guān)的基因集進行GO及KEGG分析；使用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GESA）CXCL13正相關(guān)基因集在乳腺癌中的激酶、轉(zhuǎn)錄因子及miRNA的靶點網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 CXCL13在乳腺癌中的表達 結(jié)果顯示，乳腺癌組織中CXCL13基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常乳腺組織（P＜0.01），雖差異倍數(shù)小于3，但CXCL13基因mRNA轉(zhuǎn)錄頻率改變排在前6%；乳腺癌組織中CXCL13基因拷貝數(shù)變異總體高于正常乳腺組織，基因拷貝數(shù)變異排在前25%，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 不同乳腺癌組織與正常組織中CXCL13基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平和基因拷貝數(shù)的差異Fig.1 Difference of various breast cancer and normal tissues in CXCL13 gene mRNA transcription levels and gene copy numbers

2.2 CXCL13在乳腺癌中基因變化的頻率及類型 結(jié)果顯示，1 101例乳腺癌患者中23例發(fā)生CXCL13分子改變，占2.1%，其中17例為擴增突變，占1.5%，表明擴增是CXCL13在乳腺癌中最常見的突變類型，見圖2。

圖2 TCGA數(shù)據(jù)庫中CXCL13基因變化情況Fig.2 Variation of CXCL13 gene in TCGA database

2.3 CXCL13變化在乳腺癌中的生物互作網(wǎng)絡(luò) 經(jīng)GO分類分析，CXCL13鄰近50個發(fā)生突變的基因主要參與細胞通訊、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，定位于細胞質(zhì)或細胞膜，涉及G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptor，GPCR）活化、GTP酶活化、絲／蘇氨酸蛋白酶激活等功能；經(jīng)KEGG通路分析，這些基因富集在GPCR結(jié)合配體、肽受體結(jié)合配體及GPCR信號傳導(dǎo)過程。見表1。頻率變化較高的前15個鄰近基因生物互作網(wǎng)絡(luò)中，PTK2占25.6%，ERBB2占17.8%，NFAGT占16.3%，見圖3。

圖3 乳腺癌中CXCL13與鄰近基因生物相互作用網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Interaction network of CXCL13 gene and its adjacent genes in breast cancer

表1 乳腺癌中CXCL13鄰近變化基因的富集分析Tab.1 Enrichment analysis of changed genes adjacent to CXCL13 gene in breast cancer

2.4 CXCL13在乳腺癌中的功能網(wǎng)絡(luò) 富集分析顯示，1 093例乳腺癌患者的測序數(shù)據(jù)中，5 579個基因與CXCL13變化呈正相關(guān)，3 591個基因呈負相關(guān)［錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.01］，見圖4。經(jīng)GO、KEGG分析，CXCL13正相關(guān)基因主要定位于細胞膜、免疫突觸及受體復(fù)合體；主要參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)、對趨化因子的反應(yīng)、T細胞激活等過程，涉及細胞因子受體結(jié)合、活化等功能；主要富集在原發(fā)性免疫缺陷、T細胞受體信號通路、趨化因子信號通路、細胞因子與受體相關(guān)作用、造血干細胞譜系等過程。見圖5。

圖4 乳腺癌中與CXCL13相關(guān)的差異表達基因Fig.4 Differentially expressed genes associated with CXCL13 in breast cancer

圖5 乳腺癌中CXCL13共表達基因的GO注釋BP（A）、CC（B）、MF（C）及KEGG信號通路（D）分析（FDR＜0.03）Fig.5 GO annotation of biological process（A），cell component（B），molecularfunction（C）and KEGG signaling pathway（D）of genes co-expressed with CXCL13 in breast cancer（FDR＜0.03）

2.5 CXCL13在乳腺癌中的激酶、轉(zhuǎn)錄因子及miRNA的靶點網(wǎng)絡(luò)CXCL13正相關(guān)基因集最重要的3個激酶靶點網(wǎng)絡(luò)為FYN、LYN及LCK，均屬于src家族酪氨酸激酶；miRNA靶點網(wǎng)絡(luò)包括miR-146a和miR-519E等；轉(zhuǎn)錄因子靶點網(wǎng)絡(luò)與NF-κB通路有關(guān)，包括V$NFKAPPAB_01和GGGNNTTTCC_V$NFKB_Q6_01。見表2。

表2 CXCL13正相關(guān)基因集的激酶、轉(zhuǎn)錄因子和miRNA的靶點網(wǎng)絡(luò)Tab.2 Target networks of kinases，transcription factors and miRNAs of gene clusters positively related to CXCL13

3 討論

趨化因子協(xié)調(diào)細胞遷移能力被惡性腫瘤不同的生物作用網(wǎng)絡(luò)利用，但腫瘤的進展與腫瘤相關(guān)趨化因子表達的關(guān)系研究較少。PANSE等［9］發(fā)現(xiàn)，CXCL13在乳腺癌組織中過表達，轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者血清中該細胞因子表達升高，表明CXCL13在乳腺癌的進展中發(fā)揮作用，其可能作為一個有效的治療靶點或惡性腫瘤的診斷指標(biāo)。BISWAS等［10］研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13刺激乳腺癌細胞可促進乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，其可作為乳腺癌的不良預(yù)后指標(biāo)。

本研究對TCGA數(shù)據(jù)庫中1 101份臨床樣本的轉(zhuǎn)錄測序數(shù)據(jù)進行分析，證實CXCL13基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平及拷貝數(shù)變異程度在癌組織中高于正常乳腺組織，CXCL13作為一種潛在的診斷及預(yù)后標(biāo)志物值得進一步進行臨床驗證?；蚩截悢?shù)變異是基因組變異的主要來源，對癌癥的發(fā)生發(fā)展有一定的影響。SAFONOV等［11］研究表明，拷貝數(shù)變異與腫瘤的免疫浸潤呈正相關(guān)。本研究證實，CXCL13在乳腺癌中的拷貝數(shù)變異增加，其突變類型主要是擴增。因CXCL13具有重要的生理學(xué)功能，其基因改變可能造成多個下游信號通路的改變，涉及的相關(guān)功能網(wǎng)絡(luò)包括GPCR的結(jié)合及信號傳遞，肽配體受體結(jié)合等過程，這與CXCL13的生理功能一致［12-13］。

本研究前期發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1（neuroregulin 1，NRG1）激活可導(dǎo)致人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）陽性乳腺癌曲妥珠單抗原發(fā)耐藥，NRG1可能作為預(yù)測曲妥珠單抗原發(fā)耐藥的一個分子標(biāo)記物［14］。本次分析也發(fā)現(xiàn)CXCL13與HER2及NRG1的變異有很大相關(guān)性，且生物互作圖顯示，這3個基因有很多相同作用靶點，提示CXCL13可能是導(dǎo)致曲妥珠單抗耐藥的一個因素，值得進一步實驗確證。有學(xué)者報道，CXCL13與CXC亞家族趨化因子受體-5（CXC chemokine receptor-5，CXCR5）相互作用遵循經(jīng)典的GPCR激活模式［13］，本文中CXCL13參與原發(fā)性免疫缺陷、T細胞受體信號通路、趨化因子信號通路、細胞因子與受體相關(guān)作用及造血干細胞譜系等過程，與前期報道一致。這些發(fā)現(xiàn)對探討CXCL13在疾病中功能失調(diào)及癌癥的發(fā)生機制具有重要意義。

基因組不穩(wěn)定性及突變是癌細胞的基本特點，激酶及相關(guān)的信號通路可幫助穩(wěn)定和修復(fù)基因組DNA［15-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌中CXCL13的激酶靶點網(wǎng)絡(luò)中包括FYN激酶；XIE等［17］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)YN在乳腺癌中過表達，敲減FYN的表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移及浸潤，并證明FYN可通過PI3K／AKT及ERK／MAPK通路誘導(dǎo)乳腺癌細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。FYN在癌細胞對某些抗癌藥物的耐藥性或敏感性中具有重要意義；ELIAS等［18］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)YN在他莫昔芬耐藥的乳腺癌細胞系中上調(diào)，并證明其在耐藥機制中起關(guān)鍵作用。有研究表明，F(xiàn)YN參與T淋巴細胞的發(fā)育及激活［19］。SUGIE等［20］證明，F(xiàn)YN參與抗原特異性激活T細胞過程，抑制FYN嚴(yán)重損害T細胞反應(yīng)。乳腺癌中CXCL13可能通過FYN激酶調(diào)控乳腺癌的發(fā)生發(fā)展或激活T細胞抗腫瘤反應(yīng)，具體機制有待進一步驗證。

轉(zhuǎn)錄因子對于細胞發(fā)育至關(guān)重要，轉(zhuǎn)錄因子包括多種蛋白質(zhì)，它們可與順式作用元件相互作用激活或抑制轉(zhuǎn)錄過程，惡性腫瘤的發(fā)生可能依賴于正常細胞發(fā)育程序，但疊加了潛在的基因變異。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌中CXCL13呈正相關(guān)變化的轉(zhuǎn)錄因子靶點網(wǎng)絡(luò)中包含NF-κB通路。NF-κB途徑在先天和適應(yīng)性免疫、細胞增殖和存活、炎癥和腫瘤發(fā)展中起關(guān)鍵作用［21-22］。常用的化療及放療方法激活NFκB，導(dǎo)致侵襲性乳腺癌的發(fā)展，表現(xiàn)出對化療、放療及內(nèi)分泌治療的耐藥性［23-24］。CXCL13與受體結(jié)合可能增強NF-κB配體在乳腺癌細胞中的表達［10，25］，它們之間的作用關(guān)系有待進一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13miRNA靶網(wǎng)絡(luò)中包括miR-146a，其為一種免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)劑，與癌癥、病毒感染及自身免疫性疾病等多種疾病相關(guān)［26］。CHENG等［27］發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌干細胞可通過分泌負載miR-146a的致癌外泌體，編碼結(jié)直腸癌細胞的干細胞特性及致瘤性。SUBRAMANIAN等［28］分析乳腺癌患者與健康成年人血漿中miR-146a表達，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者血漿中miR-146a水平明顯升高，可能對乳腺癌具有診斷作用。TAN等［29］認為，miR-146a是多藥耐藥性肺癌的潛在治療靶標(biāo)。ASSUNTA等［30］研究表明，NF-κB與miR-146a協(xié)同作用使病毒DNA在細胞中的積累和傳染顆粒產(chǎn)生。NF-κB與miR-146a在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中均有變化，兩者之間的相互作用也是下一步研究的重點。

本研究基于TCGA數(shù)據(jù)庫，采用生物信息學(xué)在線工具，對腫瘤數(shù)據(jù)進行目標(biāo)基因分析，使得大規(guī)模的乳腺癌基因組研究和隨后的功能研究成為可能。但本研究仍存在局限性，如乳腺癌測序數(shù)據(jù)來源分組不同，患者的遺傳背景及病因可能存在顯著差異，轉(zhuǎn)錄組測序僅能檢測到靜態(tài)突變，不能直接提供蛋白質(zhì)活性或表達水平的信息。因此，需進一步使用臨床樣本進行相關(guān)的分子生物學(xué)研究。

綜上所述，CXCL13在乳腺癌組織中高表達，該變化對GPCR的激活、信號傳遞及T細胞激活等多個步驟具有深遠的影響；CXCL13與幾種腫瘤相關(guān)激酶（如FYN）、轉(zhuǎn)錄因子（如NF-κB）及miRNA（如miRNA-146a）特異相關(guān)。本研究為CXCL13在乳腺癌發(fā)生中的重要作用及其作為乳腺癌標(biāo)志物的潛能提供了參考。