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    APAP誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷中免疫細(xì)胞的動態(tài)變化

    2021-09-18 07:21:10包玉龍
    現(xiàn)代農(nóng)業(yè) 2021年4期
    關(guān)鍵詞:時相調(diào)節(jié)性樹突

    包玉龍

    (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

    APAP具有止痛和解熱特性,是最常用的藥物之一。推薦劑量下,安全有效,而過量可能導(dǎo)致急性藥物性肝損傷(DILI)[1]。實(shí)際上,APAP引起的肝損傷是許多國家DILI的最主要原因,占美國所有肝損傷病例的近50%和英國的60%[2-3]。盡管通常可以通過停止服用APAP來改善,但在某些情況下,嚴(yán)重APAP所致肝損傷可以致命[4]。

    人類肝臟包含多達(dá)1010個常駐淋巴細(xì)胞[5],由B細(xì)胞、T細(xì)胞、自然殺傷(NK)、自然殺傷T(NKT)細(xì)胞組成。NK/NKT細(xì)胞、巨噬細(xì)胞的病理作用已經(jīng)使用APAP誘導(dǎo)肝損傷小鼠模型進(jìn)行了深入研究[6]。淋巴細(xì)胞募集,炎癥增加,炎癥的性質(zhì)和程度決定了損傷的進(jìn)展和嚴(yán)重程度,同時,DILI與淋巴細(xì)胞浸潤有關(guān)。然而,這些細(xì)胞在損傷發(fā)病機(jī)制中的確切作用仍存在爭議[7]。目前,關(guān)于肝巨噬細(xì)胞的作用,已經(jīng)證明這些細(xì)胞通過產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和介質(zhì),包括腫瘤壞死因子(TNF)-α、IL-1β和一氧化氮,促進(jìn)APAP誘導(dǎo)肝毒性。肝巨噬細(xì)胞還通過產(chǎn)生細(xì)胞因子和介質(zhì)(如IL-10、IL-6和IL-18結(jié)合蛋白)發(fā)揮保肝作用,這些蛋白可以對抗炎癥事件并促進(jìn)肝臟再生[8]。與巨噬細(xì)胞一樣,中性粒細(xì)胞也會在組織損傷后清除細(xì)胞碎片。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對控制自身反應(yīng)性T細(xì)胞和緩解炎癥具有重要的意義。它們能夠維持穩(wěn)定的慢性炎癥并防止爆發(fā)性組織破壞。肝內(nèi)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的頻率和功能影響慢性病毒性肝炎和肝損傷的結(jié)果,肝臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞的募集和存活之間的平衡可能決定DILI的結(jié)果[9-11]。然而,以往的研究多數(shù)都局限在肝臟損傷過程中的某一個時相中,目前對于APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中的各類免疫細(xì)胞的動態(tài)變化尚未見報道。因此研究對APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中代謝時相、損傷時相和修復(fù)再生時相中固有免疫細(xì)胞和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的動態(tài)變化情況具有重要的臨床指導(dǎo)意義,為進(jìn)一步揭示APAP急性肝損傷的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 試驗材料。選擇6周齡的雄性C57BL/6野生型小鼠作為實(shí)驗動物,購自北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)有限公司。

    1.1.2 試劑。APAP(Sigma,美國),ALT、AST ELISA試劑盒(南京建城生物有限公司),TNF-α和IL-1 ELISAELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司),FITC-F4/80、PE-NKp46、APC-CD11c、FITC-CD3、PE-CD4、APC-CD8和Cy7-CD25流式抗體(Abcam,美國),DAB試劑盒、HE染色試劑(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)。

    1.1.3 儀器。智能型高效離心機(jī)(Beckman Coulter,美國),超純水制造系統(tǒng)(四川優(yōu)普超純科技有限公司),流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter,美國),酶標(biāo)儀(Bioteck,美國),倒置顯微鏡(Nikon,日本),切片機(jī)、包埋機(jī)、攤烤片機(jī)(Leica,德國)。

    1.1.4 培養(yǎng)基。RPMI-1640培養(yǎng)基(Sigma,美國)。

    1.2 方法

    1.2.1 急性肝損傷模型的構(gòu)建。將雄性C57BL/6野生型小鼠在可控的室溫下飼養(yǎng),溫度25±2℃,相對濕度55%±10%,進(jìn)行12 h的明暗循環(huán)。將70只小鼠隨機(jī)分為2大組:對照組,模型組。模型組分為損傷后1、2、3、5、7、14、21 d為時間點(diǎn),每個時間點(diǎn)有對照組5只,模型組5只。向模型組腹膜內(nèi)注射APAP溶液(200 mg/kg),引起急性肝損傷。建模后的每個時間點(diǎn),在小鼠中進(jìn)行異氟烷麻醉,從眼球收集血液并解剖肝臟。在解剖前,確保小鼠停止進(jìn)食12 h時并自由飲食。

    1.2.2 ELISA法檢測生物化學(xué)指標(biāo)。將血樣在4℃下凝結(jié),并在3000 g離心15 min后從血樣中分離血清樣品,-20℃保存,用于ELISA檢測。

    使用南京建城生物有限公司ELISA試劑盒,檢測血清中ALT和AST的水平,以反映ALT和AST的活性。

    使用南京建城生物有限公司ELISA試劑盒檢測ALT、AST;使用江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司ELISA試劑盒檢測TNF-α和IL-1,具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。在測定樣品前需繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成1000 pg/mL、500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.25 pg/mL、15.625 pg/mL濃度,各取100μL待測血清加到96孔板內(nèi),每孔重復(fù)3次,在室溫下孵育3 h。使用酶標(biāo)儀在450 nm測定光密度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清ALT、AST、TNF-α和IL-1的含量。

    1.2.3 HE染色。將切除的肝組織切成適當(dāng)?shù)拇笮。?%多聚甲醛固定,固定后石蠟包埋,將包埋后的組織切成4μm厚度,脫水,蘇木素-伊紅(HE)染色,用中性樹膠封片,顯微鏡下觀察組織。

    1.2.4 流式檢測免疫細(xì)胞。取小鼠的相同肝葉,將其放入含1640培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中。用注射器塞子在200目過濾器上擠壓肝臟以獲得細(xì)胞懸液。將獲得的細(xì)胞懸液連續(xù)過濾到帶有200目的過濾器的15 ml離心管中,并以1000 r/min離心8 min。密封后,分別加入FITC-F4/80、PE-NKp46、APC-CD11c、PE-CD4、APC-CD8和Cy7-CD25抗體,在4℃下在黑暗中孵育30 min,離心收集細(xì)胞,重懸于PBS中,并上機(jī)檢測。

    1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析。試驗數(shù)據(jù)以5只實(shí)驗動物的平均值±SD表示,采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。通過單因素方差分析進(jìn)行分析,并進(jìn)行Tukey檢驗,以檢驗各種處理之間的顯著差異,P<0.05為顯著差異。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 小鼠血清ALT、AST表達(dá)水平變化

    ELISA法檢測血清中ALT、AST表達(dá)水平,從圖1可以看出,與對照組Con相比,高劑量APAP處理小鼠第1d時,小鼠血清中ALT、AST水平升高并已達(dá)到峰值(ALT為372.71±1.58 U/L;AST為143.78±13.81 U/L),從APAP處理第2d,ALT、AST表達(dá)水平明顯下降(ALT為106.03±21.42 U/L;AST為20.10±2.27 U/L),在APAP誘導(dǎo)小鼠肝損傷后第3~14日ALT、AST水平與對照組無差異(對照組:ALT為8.37±1.78 U/L,AST為13.18±3.67 U/L;第14d ALT為9.84±3.15 U/L,AST為9.61±0.97 U/L)(見圖1)。表明APAP誘導(dǎo)的肝損傷模型成功。

    圖1 ALT、AST表達(dá)變化情況

    2.2 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中組織病理學(xué)變化

    利用光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理改變,病理檢測圖片如圖2所示。從圖中可以看出,APAP處理2 d肝門靜脈區(qū)1/3以上面積的肝細(xì)胞凝固型壞死。APAP處理5 d,損傷修復(fù)區(qū)肝靜脈至肝血竇軸系上可見大量炎性細(xì)胞浸潤,炎癥可造成肝損傷修復(fù)后炎癥的持續(xù)性損傷。APAP處理7 d炎癥消退,肝組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)正常,只是在少量靜脈區(qū)還存在一定的炎細(xì)胞浸潤(見圖2)。上述結(jié)果表明,APAP誘導(dǎo)的肝損傷第7日已基本完成肝損傷修復(fù)。

    圖2 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷中組織病理學(xué)變化

    2.3 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中炎癥因子表達(dá)變化

    ELISA法檢測血清中IL-1β、TNF-α的含量,從圖3可以看出,IL-1β對照組含量為37.21±0.25,TNF-α對照組為234.2±12.02。高劑量APAP處理小鼠第2 d時,小鼠血清中IL-1β、TNF-α水平顯著升高,IL-1β升高至82.44±6.40,TNF-α為345.51±39.79(P<0.05),在之后5d、7d、14d仍維持較高的水平(P<0.05)(見圖3A、B)。表明IL-1β、TNF-α在肝損傷及肝損傷修復(fù)中起著主要的作用。

    圖3 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷中炎癥因子表達(dá)變化

    2.4 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中固有免疫細(xì)胞動態(tài)變化

    流式細(xì)胞術(shù)法測定肝臟組織中的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞含量,從圖4可以看出,與對照組相比(NK細(xì)胞數(shù)量254±22.11,巨噬細(xì)胞數(shù)量356.33±31.89),高劑量APAP處理小鼠第3日時,NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞水平顯著升高(NK細(xì)胞數(shù)量1353±50.76,巨噬細(xì)胞數(shù)量4640±122.87)(P<0.05),從APAP處理第5日,NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞明顯下降(NK細(xì)胞數(shù)量547±172.81,巨噬細(xì)胞數(shù)量1063.33±221.22),并與對照組無明顯差異。而樹突細(xì)胞在APAP處理小鼠第2日顯著升高,對照組樹突細(xì)胞數(shù)量為3049.66±200.4,第2日為4532.43±187.54;從第3日開始明顯下降,第5日時(1577±312.78)與對照組比較差異顯著(P<0.05)。表明NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的數(shù)量在肝損傷及肝損傷修復(fù)過程中發(fā)生顯著的變化。

    圖4 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中固有免疫細(xì)胞動態(tài)變化

    2.5 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中適應(yīng)性免疫細(xì)胞動態(tài)變化

    流式細(xì)胞術(shù)法測定肝臟組織中成熟T淋巴細(xì)胞含量,從圖5可以看出,與對照組相比,高劑量APAP處理小鼠第5日時,CD3+成熟T細(xì)胞、輔助性CD3+CD4+T細(xì)胞和CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量顯著升高(P<0.05),第7日仍處于較高狀態(tài),與對照組有顯著差異(P<0.05),第14日已降低,與對照組無差異。而對于抑制性CD3+CD8+T細(xì)胞而言,高劑量APAP處理小鼠第3 d時,細(xì)胞數(shù)量顯著升高(132.5±16.74)(P<0.05),第5日和第7日仍處于較高狀態(tài),與對照組(33±7.21)有顯著差異(P<0.05),第14日已降低(56.67±4.18),與C無差異。表明,抑制性CD3+CD8+T和CD3+成熟T細(xì)胞、輔助性CD3+CD4+T細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在肝臟修復(fù)不同時相產(chǎn)生動態(tài)變化。

    圖5 APAP誘導(dǎo)急性肝損傷過程中適應(yīng)性免疫細(xì)胞動態(tài)變

    3 討論

    肝臟是人體藥物代謝的場所,容易受到藥物代謝損傷,近年來藥物導(dǎo)致的肝損傷備受關(guān)注。APAP是臨床廣泛運(yùn)用的陣痛解熱藥物,APAP過量是急性肝功能衰竭的最常見原因之一[12]。APAP所致肝損傷的時相分為三個階段,代謝時相,損傷時相和修復(fù)再生時相[13]。本文主要探討三個時相中,先天免疫細(xì)胞,包括巨噬細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、樹突細(xì)胞、炎癥因子發(fā)揮的作用。

    APAP肝損傷模型是一種顯著臨床相關(guān)性的藥物肝損傷模型[14],在APAP肝損傷模型中,AST和ALT絕大部分分布在肝細(xì)胞內(nèi),當(dāng)肝臟受損時,肝細(xì)胞膜破壞,AST和ALT進(jìn)入血液,血液中AST和ALT水平升高[15]。本研究APAP處理后24 h,血清中ALT、AST水平升高并達(dá)到峰值,APAP組小鼠肝臟損傷明顯,表面有點(diǎn)狀充血、變性和壞死,說明造模成功。

    從本實(shí)驗HE圖看出,肝臟第2日,第5日肝臟損傷,處于損傷時相,期間TNF-α、IL-1β升高,NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞第2日升高,第3日開始降低,CD3+成熟T細(xì)胞、輔助性CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞從第5日升高。HE圖中肝臟第7日肝臟狀態(tài)與對照相當(dāng),處于修復(fù)再生時相,期間TNF-α、IL-1β仍處于較高狀態(tài),NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞降低;CD3+成熟T細(xì)胞、輔助性CD3+CD4+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞仍處于較高狀態(tài)。IL-1β是巨噬細(xì)胞的產(chǎn)物,有研究發(fā)現(xiàn)[16-19],APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷模型中,IL-1β主要依賴NK細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α所誘導(dǎo),從而導(dǎo)致嚴(yán)重的急性肝損傷。同時,肝臟巨噬細(xì)胞的作用一直在爭議之中。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)APAP處理后巨噬細(xì)胞,NK細(xì)胞在第3日顯著增加,隨后下降,樹突細(xì)胞在處理后的第2日明顯升高。也有研究表明[20],樹突狀細(xì)胞耗竭也加劇了對乙酰氨基酚的肝毒性。從本實(shí)驗中也能夠看出,樹突細(xì)胞在損傷后第2日后開始急劇下降,肝臟損失嚴(yán)重。

    研究還發(fā)現(xiàn)NK細(xì)胞可以通過殺傷非成熟的DC和分泌促炎癥因子,促進(jìn)T細(xì)胞的活化并能招募免疫細(xì)胞到達(dá)感染部位[21-22]。本實(shí)驗中發(fā)現(xiàn),成熟T細(xì)胞總數(shù)在5日開始急劇的增加,在第7日達(dá)到最高峰后,在14日時又恢復(fù)到對照組的水平。研究發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對控制自身反應(yīng)性T細(xì)胞和緩解炎癥很重要,它們維持穩(wěn)定的慢性炎癥并防止爆發(fā)性組織破壞[17]。由此可以看出,在APAP急性肝損傷過程中,在損傷早期固有免疫細(xì)胞在炎性損傷中發(fā)揮重要作用,而在損傷修復(fù)期由成熟T細(xì)胞發(fā)揮主要作用。但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

    4 結(jié)論

    高劑量APAP處理小鼠后,血清中ALT、AST水平升高,肝細(xì)胞損傷。在APAP肝臟損傷不同時相中,固有免疫、適應(yīng)性免疫發(fā)揮著不同的作用。壞死的肝細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子IL-1β、TNF,在肝損傷修復(fù)期仍處于較高狀態(tài);同時固有免疫細(xì)胞巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞、樹突細(xì)胞在損傷時相升高,修復(fù)再生時相降低至正常水平;T細(xì)胞發(fā)生動態(tài)變化,在損傷時相和修復(fù)再生時相處于升高狀態(tài),14日后降低至正常狀態(tài)。本研究證實(shí)了肝損傷過程中,免疫因子、固有免疫細(xì)胞、適應(yīng)性免疫細(xì)胞在肝損傷修復(fù)中的動態(tài)變化,并長時間觀察了APAP肝損傷的修復(fù)過程,但具體的關(guān)聯(lián)性仍需要進(jìn)一步探索。

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