麻杏石甘湯和銀翹散體外抗流感病毒的作用機(jī)制分析

楊毅，洪智林

常德市第四人民醫(yī)院中西結(jié)合老干科，湖南常德 415000

麻杏石甘湯出自中醫(yī)經(jīng)典著作《傷寒論》，在風(fēng)寒郁而化熱或外感風(fēng)熱中應(yīng)用，銀翹散出自中醫(yī)經(jīng)典著作《溫病條辨》，在外感風(fēng)熱、熱邪犯肺證中應(yīng)用，二者均在外感病風(fēng)邪襲肺征中應(yīng)用[1]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明，麻杏石甘-銀翹散組方能夠在極大程度上有利于H1N1感染患者發(fā)熱時(shí)間的縮短，類似于奧司他韋組，這就將可靠依據(jù)提供給了臨床應(yīng)用二者治療流感[2-3]。相關(guān)醫(yī)學(xué)研究表明，麻杏石甘湯一方面能夠有效改善肺部超微結(jié)構(gòu)，另一方面還能夠有效改善甲型流感病毒感染引發(fā)的肺部炎癥，銀翹散能夠保護(hù)流感病毒FM1株感染的小鼠[4-5]。該研究2020年10月30日購(gòu)買(mǎi)石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供的麻杏石甘湯、銀翹散藥物粉劑，分析了麻杏石甘湯和銀翹散體外抗流感病毒的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

2020年10月30 日購(gòu)買(mǎi)石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司提供的麻杏石甘湯、銀翹散藥物粉劑。麻杏石甘湯具體藥方為炒苦杏仁170 g，炙麻黃170 g，甘草170 g，石膏510 g；銀翹散具體藥方為金銀花204 g，連翹204 g，魚(yú)腥草204 g，綿馬貫眾204 g，板藍(lán)根204 g，紅景天68 g，薄荷腦6 g。用70%乙醇加熱炙麻黃、魚(yú)腥草、連翹，回流提取2次，第1次、第2次分別2、1.5 h，濾過(guò)提取液，將乙醇回收過(guò)來(lái)，備用。用水煎煮2次，第1次、第2次分別1.5、1 h，濾過(guò)堿液，在60℃溫度下合并濃縮各濾液到相對(duì)密度1.10~1.15，在此過(guò)程中嚴(yán)格按藥物組成，然后將乙醇加入其中，使含醇量為70%，之后在4℃的溫度下冷藏1 d。將濃度為400 mg/mL的母液配制出來(lái)，儲(chǔ)存在4℃的溫度下備用。將Sigma公司生產(chǎn)的奧司他韋強(qiáng)酸鹽（批號(hào)：1717-003A9）設(shè)定為陽(yáng)性對(duì)照藥。購(gòu)買(mǎi)美國(guó)ATCC公司生產(chǎn)的人支氣管上皮細(xì)胞16HBE、狗腎細(xì)胞MDCK，將DMEM培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）作為細(xì)胞生長(zhǎng)液，并將1%青-鏈霉素添加其中。購(gòu)買(mǎi)美國(guó)ATCC公司生產(chǎn)的流感病毒株[A/PR/8/34（H1N1）、A/Chicken/Guangdong/1996（H9N2）、A/Guangzhou/GIRD02/09 （H1N1）、A/Duck/Guangdong/09（H6N2）、B/Lee/1940]，使用前用雞胚擴(kuò)增，對(duì)病毒半數(shù)組織感染量（TCID50）進(jìn)行測(cè)定，在此過(guò)程中運(yùn)用Reed-Muench法，在-80℃的溫度下儲(chǔ)存毒株備用。

1.2 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)所需的試劑與儀器見(jiàn)表1。

表1 試劑與儀器

1.3 方法

1.3.1 藥物對(duì)細(xì)胞半數(shù)毒性濃度（TC50）測(cè)定 在96孔板上每孔（5 000個(gè)細(xì)胞）中滴加0.1 mL MDCK細(xì)胞懸液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置，培養(yǎng)1 d，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，換無(wú)血清培養(yǎng)基，其含不同藥物濃度，其中麻杏石甘湯、銀翹散、奧司他韋分別為0.31～20 mg/mL、0.31～20 mg/mL、31.25～1 000μmol/L，2倍稀釋， 將6個(gè)復(fù)孔設(shè)置在每個(gè)藥物濃度。每天在倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞病變情況進(jìn)行觀察，2 d后將細(xì)胞病變（CPE）記錄下來(lái)，按6級(jí)標(biāo)準(zhǔn)記錄細(xì)胞出現(xiàn)CPE，即細(xì)胞未出現(xiàn)病變、具有正常的生長(zhǎng)評(píng)定為-，細(xì)胞病變/整個(gè)單層細(xì)胞＜10%、10%～24%、25%～49%、50%～74%、75%～100%分別評(píng)定為±、+、++、+++、++++。在病毒組細(xì)胞病變++++時(shí)用5 mg/mL MTT染色活細(xì)胞。在A490 nm波長(zhǎng)處采用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀對(duì)OD值進(jìn)行測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將TC50計(jì)算出來(lái)，在此過(guò)程中運(yùn)用Reed-Muench法。麻杏石甘湯、銀翹散、奧司他韋的TC0分別為3 mg/mL、0.5 mg/mL、＞1 000μM，TC50分別為6.16 mg/mL、0.73 mg/mL、＞1 000μM。

1.3.2 藥物對(duì)病毒半數(shù)有效濃度（IC50）測(cè)定 在96孔板上每孔（5 000個(gè)細(xì)胞）中滴加100μl MDCK細(xì)胞液，放置在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)1 d，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，用1×PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2次洗滌，將100μl 100 TCID50病毒液 （MEM培養(yǎng)基稀釋）加入到每孔中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置，孵育2 h，然后換用不同濃度藥液 （MEM培養(yǎng)基稀釋-含1.5μg/mL TPCK胰蛋白酶），其中麻杏石甘湯、銀翹散、奧司他韋分別為0.0625～4 mg/mL、0.015～1 mg/mL、3.125～200μmol/L，2倍比稀釋，繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d。對(duì)病毒組細(xì)胞病變情況進(jìn)行觀察，該過(guò)程在顯微鏡下進(jìn)行，2 d后在細(xì)胞病變?yōu)?+++時(shí)，將病變情況記錄下來(lái)，并用MTT染色活細(xì)胞，在A490 nm波長(zhǎng)處采用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀對(duì)OD值進(jìn)行測(cè)定，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，將IC50計(jì)算出來(lái)。用選擇指數(shù)（SI）表示藥物對(duì)病毒的有效性， 其計(jì)算方法為T(mén)C50/IC50，＜1、1～2、＞2分別表示無(wú)效、高毒低效、低毒高效[6]。

1.3.3 藥物對(duì)病毒誘導(dǎo)細(xì)胞因子及趨化因子基因調(diào)節(jié)作用的qPCR法測(cè)定 將1 mL 16HBE細(xì)胞懸液滴加到12孔板上的每孔中，每孔20 000個(gè)細(xì)胞，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，待細(xì)胞長(zhǎng)成單層，用1×PBS對(duì)細(xì)胞進(jìn)行2次洗滌，將500μl 104 TCID50 A/PR/8/34病毒液（DMEM培養(yǎng)基稀釋）加入到每孔中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中放置，孵育2 h，然后將病毒液吸走，之后將含不同濃度的藥物加入，麻杏石甘湯、銀翹散的最大無(wú)毒濃度TC0分別為3、0.5 mg/mL。繼續(xù)在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 d，之后將上清液收集起來(lái)，并用TRIZOL將細(xì)胞提取出來(lái)，在1.5 mL EP管中分裝，將細(xì)胞RNA提取出來(lái)，在此過(guò)程中運(yùn)用氯仿-異丙醇-乙醇抽提法，然后逆轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，在此過(guò)程中應(yīng)用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，之后運(yùn)用PCR法對(duì)每個(gè)樣品炎癥因子表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，在此過(guò)程中應(yīng)用TaKaRa qPCR試劑盒。在ABI 7500 real time PCR System機(jī)器傷對(duì)樣品的表達(dá)水平進(jìn)行測(cè)定，用CT值表示，用2-△△α方法計(jì)算的倍數(shù)變化表示結(jié)果 （和未感染細(xì)胞相比）[7]，將內(nèi)參設(shè)定為GAPDH。

1.3.4 藥物對(duì)病毒誘導(dǎo)IL-6、IP-10蛋白調(diào)節(jié)作用的ELISA法測(cè)定 對(duì)細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6、IP-10分泌進(jìn)行測(cè)定，在此過(guò)程中應(yīng)用ELISA檢測(cè)試劑盒。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件予以數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料用（±s）表示，組間差異比較采用t檢驗(yàn)、方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 麻杏石甘湯、銀翹散體外對(duì)流感病毒的藥效比較

麻 杏 石 甘 湯 對(duì)H1N1、H1N1、B/Lee/1940、H6N2、H9N2的IC50分別為 （0.142±0.040）、（0.380±0.081）、（0.432±0.015）、（0.395±0.051）、（0.724±0.204）， 對(duì)5種流感病毒的IC50在0.1～1 mg/mL之間，體外在一定程度上抑制流感病毒；銀翹散體外不直接抑制流感病毒。見(jiàn)表2、表3。

表2 麻杏石甘湯、銀翹散體外對(duì)流感病毒的藥效比較（IC50）

表3 麻杏石甘湯、銀翹散體外對(duì)流感病毒的藥效比較（SI）

2.2 麻杏石甘湯、銀翹散體外對(duì)細(xì)胞因子基因表達(dá)的作用

麻杏石甘湯對(duì)IP-10、IL-6的基因表達(dá)下調(diào)作用顯著高于病毒組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=4.303、3.182，P＜0.05），麻杏石甘湯、銀翹散均將CCL5、IP-10、TNF-α、IL-6、IL-8的基因表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.965、4.541，P＜0.05）， 其中3 mg/mL麻杏石甘湯下調(diào)IP-10、IL-6的基因表達(dá)分別80倍、103倍左右，0.5 mg/mL銀翹散下調(diào)IP-10、IL-6的基因表達(dá)分別18倍、3.7倍左右。麻杏石甘湯能夠?qū)OX-2的基因表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），銀翹散能夠?qū)IG的基因表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 qPCR法檢測(cè)麻杏石甘湯和銀翹散對(duì)細(xì)胞因子基因的調(diào)節(jié)作用

2.3 麻杏石甘湯、銀翹散體外對(duì)IP-10、IL-6蛋白的調(diào)節(jié)作用

麻杏石甘湯、銀翹散均能夠?qū)P-10、IL-6的蛋白表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），3 mg/mL麻杏石甘湯下調(diào)IP-10、IL-6蛋白的表達(dá)分別11倍、97倍左右，0.5 mg/mL銀翹散下調(diào)IP-10、IL-6蛋白的表達(dá)分別11倍、3.5倍左右。見(jiàn)圖2。

圖2 ELISA法檢測(cè)麻杏石甘湯和銀翹散對(duì)IP-10和IL-6蛋白的調(diào)節(jié)作用

3 討論

麻杏石甘湯屬湯劑?？尚翛鲂?，清肺平喘。這樣的藥物主要是主要成份為麻黃堿，具有鎮(zhèn)咳、平喘、化痰、散熱的功效，臨床上對(duì)于風(fēng)寒感冒有一定的功效。麻杏石甘湯方中甘草能夠流感病毒吸附細(xì)胞進(jìn)行抑制，同時(shí)將病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞因子CCL5、IP-10、IL-6下調(diào)[8]。銀翹散的功效為辛涼透表、清熱解毒，主要用于小便灼熱等不適癥狀。銀翹散方中連翹、金銀花的主要功效為清熱解毒，能夠?qū)Σ《窘閷?dǎo)的炎癥進(jìn)行調(diào)節(jié)[9]。

楊菊芳等相關(guān)醫(yī)學(xué)學(xué)者比較了流感治療中麻杏石甘湯、銀翹散2個(gè)經(jīng)典復(fù)方的功效[10-11]，結(jié)果表明，麻杏石甘湯一方面能夠直接抗病毒 （對(duì)流感病毒的IC50在0.1 mg/mL以上），另一方面還能夠?qū)Σ《窘閷?dǎo)炎癥進(jìn)行抑制，但仍然需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步炎癥其作用機(jī)制，而銀翹散只將抗炎藥效發(fā)揮了出來(lái)。該研究結(jié)果表明，麻 杏 石 甘 湯 對(duì)H1N1、H1N1、B/Lee/1940、H6N2、H9N2的IC50分別為 （0.142±0.040）、（0.380±0.081）、（0.432±0.015）、（0.395±0.051）、（0.724±0.204），對(duì)5種流感病毒的IC50在0.1~1 mg/mL之間，體外在一定程度上抑制流感病毒；銀翹散體外不直接抑制流感病毒。麻杏石甘湯對(duì)IP-10、IL-6的基因表達(dá)下調(diào)作用顯著高于病毒組（P＜0.05），麻杏石甘湯、銀翹散均將CCL5、IP-10、TNF-α、IL-6、IL-8的基因表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。銀翹散能夠?qū)IG的基因表達(dá)下調(diào) （P＜0.05），麻杏石甘湯能夠?qū)OX-2的基因表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）。麻杏石甘湯、銀翹散均能夠?qū)P-10、IL-6的蛋白表達(dá)下調(diào)（P＜0.05），和上述研究結(jié)果一致。

綜上所述，麻杏石甘湯能夠直接抗病毒、對(duì)病毒介導(dǎo)炎癥進(jìn)行抑制，銀翹散只有抗炎藥效。