一種基于適配體傳感器的17β-雌二醇定量分析方法

史學(xué)麗，高輝，周永紅，趙偉

摘要：為了靈敏、特異地測定牛奶中17β-雌二醇（E2）的含量，解決傳統(tǒng)方法測定時因原位激發(fā)導(dǎo)致的熒光背景干擾、樣品預(yù)處理復(fù)雜等問題，基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理，結(jié)合適配體與靶標(biāo)的特異性識別，建立一種基于熒光適配體傳感器的E2定量分析方法。采用水熱合成法制備銪（Eu3+）摻雜的鎵酸鋅長余輝納米粒子，并將E2適配體修飾到納米粒子（PLNP）上，形成復(fù)合物（PLNP-Aptamer）。以PLNP-Aptamer為能量供體，以二硫化鉬納米片為能量受體，根據(jù)熒光強(qiáng)度與靶標(biāo)17β-雌二醇之間的線性關(guān)系實(shí)現(xiàn)對E2的檢測，并對檢測條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，當(dāng)PLNP-Aptamer、二硫化鉬的質(zhì)量濃度分別為0.1，0.8 mg/mL，E2與適配體的孵育時間為20 min，pH值為7.0時，雌二醇的線性檢測范圍為0.6～80 ng/mL，檢出限為0.4 ng/mL。通過加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，證明檢測體系對17β-雌二醇具有顯著的選擇性，可用于實(shí)際樣品的檢測。所提方法解決了樣品預(yù)處理復(fù)雜耗時，乳基質(zhì)熒光干擾等問題，可為基層衛(wèi)生監(jiān)督工作提供一種簡單、高效、成本低廉的雌激素檢測方法，對其他環(huán)境雌激素的檢測也具有參考價值和借鑒意義。

關(guān)鍵詞：應(yīng)用生物化學(xué);熒光;納米傳感器;二硫化鉬;鎵酸鋅

中圖分類號：R926文獻(xiàn)標(biāo)識碼：ADOI： 10.7535/hbgykj.2021yx05005

A quantitative analysis method for 17β-estradiol based on aptasensor

SHI Xueli1，GAO Hui1，ZHOU Yonghong1，ZHAO Wei2

（1.Shijiazhuang Maternity and Child Healthcare Hospital，Shijiazhuang，Hebei 050051，China;2.Shijiazhuang Center for Disease Control and Prevention，Shijiazhuang，Hebei 050019，China）

Abstract：In order to determine the content of 17β-estradiol （E2） in milk sensitively and specifically，and solve the problems such as the interference of fluorescence background caused by in-situ excitation and the complexity of sample pretreatment in the traditional method，a quantitative analysis method for 17β-estradiol based on fluorescence aptasensor was constructed on grounds of the fluorescence resonance energy transfer （FRET），combined with the specificity of the aptamer and target recognition.Persistent luminescence nanoparticles （PLNP） doped with Eu3+ were prepared by the hydrothermal method and modified with E2 aptamers onto PLNP to form the coupling complex PLNP-Aptamer.In this method，PLNP-Aptamer was used as energy donor.MoS2 was used as the acceptor.According to the linear relationship between phosphorescent intensity and target E2，the content of E2 was detected，and the detection conditions were optimized.The results show that when the concentrations of PLNP-Aptamer and MoS2 are 0.1 mg/mL and 0.8 mg/mL respectively，the reaction time of E2 and aptamer is 20 min，pH is 7.0，the linear detection scope of E2 concentration is from 0.6 ng/mL to 80 ng/mL and the detection limit is 0.4 ng/mL.The adding standard recovery experiment proves that the detection system has high specificity to E2，and can realize quantitative detection of E2 in actual samples.The method provides a simple，efficient and low-cost estrogen detection method for grass-roots health supervision by solving the problem of the complicated time-consuming of sample pretreatment and avoiding the fluorescence interference of milk matrix.It also provides a reference for other environmental estrogens detection.

Keywords：applied biochemistry;fluorescence;nanosensor;MoS2;ZnGa2O4

17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）是一種具有內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的內(nèi)源性雌激素，過量攝入可嚴(yán)重干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)[1-2]。目前，在多種水源、食物中均檢測出E2[3-6]。雖然含量低，但可通過生物放大效應(yīng)引起體內(nèi)富集，具有較強(qiáng)的生物蓄積毒性。為保障食品安全，建立食品中E2的實(shí)時監(jiān)測意義重大。常用的E2檢測方法有色譜法[7-8]、免疫學(xué)方法[9]和適配體傳感法[10-11]等。

適配體是經(jīng)體外篩選得到的一段能與配體高親和力特異性結(jié)合的寡核苷酸序列，相對于以抗體作為生物識別分子的生物傳感器[12-13]，適配體易于修飾，穩(wěn)定性高，對目標(biāo)物具有極好的選擇性[14]，為分析識別配基提供了更好的選擇，且基于核酸適配體的生物傳感器在檢測領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[15-16]。熒光傳感器已應(yīng)用在多種食品檢測中[17-19]。然而，大多數(shù)熒光檢測都是在可見光范圍內(nèi)基于熒光猝滅模式進(jìn)行，其抗干擾能力較差，定量范圍比較窄，尤其對于牛奶這種復(fù)雜樣品的檢測，其無法避免原位激發(fā)導(dǎo)致的脂質(zhì)自體熒光等背景噪音的干擾。

隨著分析化學(xué)及材料科學(xué)的迅速發(fā)展，以長余輝納米粒子（PLNPs）為基礎(chǔ)的納米探針成為生物分析和生物成像的新一代光學(xué)探針[20-23]，可以在沒有進(jìn)一步激發(fā)的情況下，持續(xù)數(shù)小時發(fā)光[24]，并可重復(fù)利用，能有效避免原位激發(fā)產(chǎn)生的背景干擾，很大程度上增加了檢測的靈敏度及信噪比。稀土離子是發(fā)光材料中應(yīng)用最廣的一類激活劑，由于熒光效率高、熒光譜帶窄而被廣泛應(yīng)用于PLNPs的制備中。銪（Eu3+）離子作為激活劑摻雜到各種基質(zhì)中，通過改變?nèi)毕莸纳疃群兔芏?，使PLNPs余輝強(qiáng)度和余輝時間都普遍提高[25-26]。

因此，筆者基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）原理，通過水熱合成法制備了銪摻雜的鎵酸鋅長余輝納米粒子ZnGa2O4：Eu3+，將PLNP-Aptamer（適配體修飾的長余輝納米粒子）作為FRET供體，MoS2納米片為受體，結(jié)合適配體與靶標(biāo)的特異性識別，構(gòu)建了一種靈敏、特異的E2定量分析方法，有效避免了牛奶基質(zhì)等因素產(chǎn)生的背景干擾。

1主要材料與儀器

1.1藥品與試劑

實(shí)驗(yàn)所用的試劑均為分析純。硝酸鋅（Zn（NO3）2·6H2O）、氧化鎵（Ga2O3）、氧化銪（Eu2O3）、3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）、4-（N-馬來酰亞胺甲基）環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽（Sulfo-SMCC）、雙酚A（BPA）、孕酮（PRG）、己烯雌酚（DES）、雌三醇（E3）和17β-雌二醇（E2），均由上海阿拉丁生物技術(shù)有限公司提供;二硫化鉬納米片（MoS2），江蘇先豐納米材料科技有限公司提供;3%（體積分?jǐn)?shù)，下同）冰醋酸、二甲基甲酰（DMF）和氫氧化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。E2適配體序列：（5′-SH-GCT-TCC-AGC-TTA-TTG-AAT-TAC-ACG-CAG-AGG-GTA-GCG-GCT-CTG-CGC-ATT-CAA-TTG-CTG-CGC-GCT-GAA-GCG-CGG-AAG-C-3′），上海生工生物工程有限公司提供;牛奶，購于本地超市。

1.2儀器

JEM-2100透射電子顯微鏡、F-7000熒光分光光度計(jì)、SU8010掃描電子顯微鏡，日本日立公司提供;X-射線衍射儀，Zeta電位分析儀，德國布魯克公司提供;IS10傅里葉變化紅外光譜儀，美國熱電公司提供;恒溫加熱磁力攪拌器，山東甄城華魯電熱儀器有限公司提供;KQ-100DB型數(shù)控超聲波清洗儀器，昆山市超聲儀器有限公司提供;BSA124S電子天平，ST3100實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，奧豪斯儀器有限公司提供。

2試驗(yàn)方法

2.1E2的檢測原理

熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)是指熒光供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜存在重疊，當(dāng)能量供體和能量受體之間的距離小于10 nm時，供體和受體之間發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移。因此，可以利用供-受體距離變化導(dǎo)致的熒光強(qiáng)度變化來反映分析物的含量。基于FRET的E2檢測原理如圖1所示。經(jīng)氨基修飾的PLNPS標(biāo)記E2適配體，形成PLNP-Aptamer作為能量供體，選擇MoS2納米片作為受體，PLNP-Aptamer吸附在MoS2表面而形成FRET體系，PLNP-Aptamer的熒光被猝滅;當(dāng)體系中存在E2時，E2與適配體標(biāo)記的PLNP-Aptamer特異性結(jié)合，從而破壞PLNP-Aptamer與MoS2之間熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系，使PLNP-Aptamer的熒光恢復(fù)，熒光強(qiáng)度與E2的濃度呈線性關(guān)系，據(jù)此實(shí)現(xiàn)對E2的檢測。

2.2PLNPs的制備與修飾

長余輝納米粒子（ZnGa2O4：Eu3+PLNPs）的制備：采用水熱法合成PLNPs[25，27]，首先按照ω（Zn）∶ω（Ga）∶ω（Eu）=1∶1.999∶0.001的化學(xué)計(jì)量比取適量Zn（NO3）2·6H2O和Ga2O3粉末混合，然后加入Eu2O3粉末，快速攪拌下緩慢滴加NaOH溶液，調(diào)節(jié)pH值至12，將混合溶液轉(zhuǎn)移至聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，于210? ℃中反應(yīng)72 h。反應(yīng)完成后，將產(chǎn)物離心分離（10 000 r/min，5 min），棄去上清液。用超純水和乙醇分別洗滌5次和3次，置于真空干燥箱中105 ℃干燥4 h。

羥基修飾的長余輝納米粒子PLNP-OH的制備：取ZnGa2O4：Eu3+ PLNPs 400 mg，超聲分散于80 mL的NaOH溶液（50 mmol/L），使其濃度為5 mg/mL，室溫條件下攪拌24 h，然后離心分離，用超純水洗滌3次，所得產(chǎn)物室溫真空干燥24 h，備用。

氨基修飾的長余輝納米粒子PLNP-NH2的制備：取250 mg PLNP-OH，超聲分散至二甲基甲酰胺（DMF），濃度為2.5 mg/mL。攪拌下加入10 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES），滴加完成后將反應(yīng)體系置于80 ℃水浴中，攪拌下反應(yīng)24 h，然后離心分離，用DMF洗滌3次，無水乙醇洗滌1次，所得產(chǎn)物真空干燥24 h，備用。

2.3氨基化納米粒子與雌二醇適配體的偶聯(lián)（PLNP-Aptamer）

稱量1 mg PLNP-NH2和0.2 mg Sulfo-SMCC，加入到1 mL 的HEPES緩沖液（10 mmol/L，pH=7.2），混合均勻后在25 ℃下振蕩30 min，使PLNPs表面修飾的氨基充分活化。離心收集活化的PLNPs-NH2， 用Tris-HCl緩沖液（10 mmol/L，pH=7.4）洗滌3次。然后將PLNPs-NH2加入含E2適配體（2 nmol/mL）的Tris-HCl緩沖溶液中，室溫下充分孵育12 h，離心收集備用。

2.4標(biāo)準(zhǔn)溶液及牛奶樣品的配置

配置不同濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)儲備液，溶劑為 Tris-HCl 緩沖溶液，備用。

10 mL本地市售牛奶樣品加入3%冰醋酸，10 ℃離心（10 000 r/min，10 min），取上清液。處理后的牛奶樣品用 Tris-HCl 緩沖溶液稀釋，-4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5E2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別取 500 μL的PLNP-Aptamer（0.1 mg/mL）和500 μL的MoS2納米片（0.8 mg/mL），混合均勻后37 ℃孵育15 min，后立即加入1 500 μL E2標(biāo)準(zhǔn)品溶液，混合均勻后37 ℃孵育15 min。使用熒光光譜儀測定樣品熒光光譜，選取紫外吸收峰的最大波長254 nm為激發(fā)波長[28]，考察發(fā)射峰710 nm處的熒光強(qiáng)度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3結(jié)果和討論

3.1PLNP納米粒子和MoS2納米片的表征

1）PLNP納米粒子的表征如圖2、圖3所示，透射電鏡（TEM）的結(jié)果顯示制備的納米粒子顆粒均勻，粒徑為10～20 nm （見圖2 a））;對PLNP，PLNP-NH2，PLNP-Aptamer 進(jìn)行X射線衍射表征，結(jié)果見圖2 b），XRD譜圖與ZnGa2O4的標(biāo)準(zhǔn)譜圖一致，未出現(xiàn)非均相峰，說明合成的ZnGa2O4：Eu3+為尖晶石構(gòu)型，純凈無雜質(zhì)。氨基修飾后的PLNP-NH2，F(xiàn)T-IR光譜（見圖2 c））可以看出波數(shù)為1 120 cm-1和1 040 cm-1的2個峰對應(yīng)于O-Si-O的伸縮振動吸收峰，2 929 cm-1和2 872 cm-1處出現(xiàn)了不對稱和對稱的-CH2的伸縮振動吸收峰，說明在ZnGa2O4：Eu3+ PLNPs顆粒表面修飾上了-NH2。由ZnGa2O4：Eu3+納米材料的發(fā)射光譜所示（見圖3 a）），其在254 nm激發(fā)波長下，最大發(fā)射波長為710 nm，Stokes位移高達(dá)460 nm，充分說明合成的納米材料背景干擾低、檢測靈敏度高，適用于本實(shí)驗(yàn)的定量檢測。

2）MoS2納米片及其與PLNP-Aptamer復(fù)合物的表征由圖3 a）粗線所示，MoS2占據(jù)UV-vis-NIR吸收譜，吸收光譜范圍廣，與PLNP-Aptamer的熒光發(fā)射光譜有很大的重疊交叉區(qū)域?；贔RET原理，PLNPs作為供體發(fā)射的熒光可以被MoS2受體吸收而發(fā)生熒光猝滅。此外，通過范德華力將帶負(fù)電荷的適體功能化的PLNP-Aptamer吸附到MoS2納米片上，進(jìn)一步縮短了PLNPs與MoS2之間的距離，有效產(chǎn)生了FRET。

3.2檢測條件的優(yōu)化

1）MoS2用量的優(yōu)化固定PLNP-Aptamer的MoS2質(zhì)量濃度（下同）為0.5 mg/mL，加入不同濃度的MoS2，從而對其用量進(jìn)行優(yōu)化，將MoS2的濃度從0逐漸添加到1.0 mg/mL時，PLNP熒光強(qiáng)度在254 nm的激發(fā)下逐漸下降，當(dāng)加入量為0.8 mg/mL時，體系的熒光淬滅強(qiáng)度進(jìn)入平臺期，熒光強(qiáng)度不再有明顯變化;當(dāng)加入量為1.0 mg/mL時，熒光強(qiáng)度的淬滅效率高于95%（見圖3 b））。綜合考慮光散射效應(yīng)及熒光猝滅強(qiáng)度因素，本實(shí)驗(yàn)選擇0.8 mg/mL作為隨后檢測中 MoS2的用量。

2）PLNP-Aptamer供體與MoS2受體孵育時間的優(yōu)化隨著孵育時間的增加，當(dāng)孵育時間為15 min時，熒光猝滅幾乎達(dá)到最大，PLNP-Aptamer供體與MoS2受體反應(yīng)接近飽和（見圖3 c）），圖中I0代表只有PLNP-Aptamer時的熒光強(qiáng)度，I代表加入MoS2時PLNP-Aptamer的熒光強(qiáng)度。

3）FRET體系pH值的優(yōu)化核酸適配體是一種具有特定空間構(gòu)型的單鏈DNA，其空間構(gòu)型對其與E2的結(jié)合能力有重要影響。pH值對單鏈 DNA 的三維空間結(jié)構(gòu)有很大影響。因此筆者考察了pH 值對檢測的影響。結(jié)果如圖4所示，當(dāng) pH值為7.0時，在0.8 mg/mL MoS2納米片中加入E2后，核酸適配體對E2的親和力最強(qiáng)。因此，選擇pH值7.0用于隨后的檢測。

4）E2與適配體的孵育時間的優(yōu)化PLNP-Aptamer與MoS2發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致 PLNP-Aptamer 的熒光猝滅;而E2的加入會使得其適配體空間結(jié)構(gòu)改變，使得PLNP-Aptamer與MoS2分離，PLNP-Aptamer的熒光得到恢復(fù)。為了達(dá)到最佳的熒光恢復(fù)效果，需對E2的孵育時間進(jìn)行優(yōu)化。隨著孵育時間的增加，PLNP-Aptamer在710 nm處的熒光強(qiáng)度ΔI/I0不斷增加。當(dāng)孵育20 min時，熒光強(qiáng)度恢復(fù)到最大，之后基本保持不變（見圖5），因此孵育時間選擇為20 min。

3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線

為考察該方法的靈敏度，測定其線性范圍和檢出限。在最佳條件下，將不同濃度（0.6～1 100 ng/mL）E2加入檢測體系，考察710 nm處熒光強(qiáng)度的變化，分析定量范圍。結(jié)果如圖6所示，無E2時熒光發(fā)射強(qiáng)度最低，隨著E2濃度增加體系熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)（見圖6a））;采用線性擬合，雌二醇的線性檢測范圍為0.6～80 ng/mL，檢出限為0.4 ng/mL（見圖6 b））。

3.4特異性考察

為評價本方法對E2檢測的特異性，選擇E2結(jié)構(gòu)類似物雙酚A （BPA）、孕酮（PRG）、己烯雌酚（DES）、雌三醇（estriol）4種環(huán)境雌激素進(jìn)行研究，分別測定了質(zhì)量濃度均為50 ng/mL的E2和其他4種環(huán)境雌激素，以牛奶為空白樣本做陰性對照。結(jié)果如圖7所示，適配體對E2具有較高的親和性，特異性結(jié)合使PLNP脫離MoS2表面，PLNP熒光恢復(fù)，發(fā)射強(qiáng)度大幅度增強(qiáng)。由于E2適配體強(qiáng)特異性，對E2的結(jié)構(gòu)類似物雙酚A、己烯雌酚、雌三醇進(jìn)行測定時親和力弱，不能引起PLNP-Aptamer脫離MoS2表面，熒光強(qiáng)度恢復(fù)不明顯。以上結(jié)果表明，本文所建立的基于FRET的熒光傳感器對E2具有良好的選擇性。

4回收試驗(yàn)

為了考察E2檢測方法的準(zhǔn)確性和在實(shí)際牛奶樣品檢測中的分析能力，對牛奶樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)。在牛奶樣品中加入不同濃度的E2標(biāo)準(zhǔn)品，按本方法測定E2含量，結(jié)果如表1所示，回收率在91.2%～100.5%。試驗(yàn)結(jié)果表明，本文所建立的基于適配體的熒光傳感器對E2實(shí)際樣品的檢測具有良好的準(zhǔn)確性，可實(shí)現(xiàn)無色譜分離情況下對牛奶中E2的檢測。

5結(jié)語

筆者基于FRET原理，采用水熱合成法制備了銪摻雜的鎵酸鋅長余輝納米粒子，并通過適配體與靶標(biāo)E2的特異性結(jié)合構(gòu)建了一種E2定量分析方法，主要結(jié)論如下。

1）實(shí)驗(yàn)合成的納米粒子顆粒均勻，純度高，與MoS2的熒光發(fā)射光譜有很大的重疊交叉區(qū)域，可實(shí)現(xiàn)FRET。

2）通過標(biāo)記E2適配體的長余輝ZnGa2O4：Eu3+納米粒子（PLNP-Aptamer）與MoS2納米片，構(gòu)建了熒光共振能量轉(zhuǎn)移檢測體系，結(jié)果表明當(dāng)納米粒子與雌二醇適配體的偶聯(lián)復(fù)合物、二硫化鉬質(zhì)量濃度分別為0.1，0.8 mg/mL，孵育時間為20 min，pH值為7.0時，雌二醇的線性檢測范圍為0.6～80 ng/mL，檢出限為0.4 ng/mL。該適配體傳感器能夠高靈敏度、高特異性地檢測目標(biāo)分子，并能夠避免乳基質(zhì)和類似物的熒光干擾。

3）特異性考察結(jié)果顯示本研究建立的檢測體系對E2的結(jié)構(gòu)類似物雙酚A、己烯雌酚、孕酮、雌三醇的親和力弱，可在無色譜分離的情況下，實(shí)現(xiàn)對牛奶這類復(fù)雜樣品中E2的高選擇性定量檢測。

4）加標(biāo)回收試驗(yàn)顯示牛奶樣品的回收率為91.2%～100.5%，本法在實(shí)際樣品檢測中具有較好的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和檢測特異性，可以實(shí)現(xiàn)E2的靈敏檢測。

本方法無需復(fù)雜的樣本預(yù)處理，操作簡單、快捷，可避免原位激發(fā)導(dǎo)致的熒光干擾，檢測特異性高;同時適配體價格低、性質(zhì)穩(wěn)定，是一種簡單、高效、成本低廉的雌激素檢測方法。但該研究樣本較為單一，今后將進(jìn)一步擴(kuò)大研究樣本，建立更多食品樣本中雌激素的檢測方法，為健全食品安全標(biāo)準(zhǔn)體系提供參考借鑒。

參考文獻(xiàn)/References：

[1]FAN Lifang，ZHAO Guohua，SHI Huijie，et al.A simple and label-free aptasensor based on nickel hexacyanoferrate nanoparticles as signal probe for highly sensitive detection of 17β-estradiol[J]. Biosensors & Bioelectronics，2015，68：303-309.

[2]BUSAYAPONGCHAI P，SIRI S.Sensitive detection of estradiol based on ligand binding domain of estrogen receptor and gold nanoparticles[J]. Analytical Biochemistry，2017，518：60-68.

[3]JIANG Tianhe，ZHAO Lixia，CHU Baolin，et al.Molecularly imprinted solid-phase extraction for the selective determination of 17 beta-estradiol in fishery samples with high performance liquid chromatography[J].Talanta，2009，78（2）：442-447.

[4]YILDIRIM N，LONG Feng，GAO Ce，et al.Aptamer-based optical biosensor for rapid and sensitive detection of 17β-estradiol in water samples[J].Environmental Science & Technology，2012，46（6）：3288-3294.

[5]LIN Zhenyu，CHEN Lifen，ZHANG Guiyun，et al.Label-free aptamer-based electrochemical impedance biosensor for 17β-estradiol[J].Analyst，2012，137（4）：819-822.

[6]LU Hongzhi，XU Shoufang.Mesoporous structured estrone imprinted Fe3O4@SiO2@mSiO2 for highly sensitive and selective detection of estrogens from water samples by HPLC[J].Talanta，2015，144：303-311.

[7]JANSSENS G，MANGELINCKX S，COURTHEYN D，et al.Simultaneous detection of androgen and estrogen abuse in breeding animals by gas chromatography-mass spectrometry/combustion/isotope ratio mass spectrometry （GC-MS/C/IRMS） evaluated against alternative methods[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2015，63（34）：7574-7581.

[8]WANG Quanlin，ZHANG Aizhi，PAN Xu，et al.Simultaneous determination of sex hormones in egg products by ZnCl2 depositing lipid，solid-phase extraction and ultra performance liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry[J].Analytica Chimica Acta，2010，678（1）：108-116.

[9]WANG Shuhao，ZHUANG Huisheng，DU Lingyun，et al.Determination of estradiol by biotin-avidin-amplified electrochemical enzyme immunoassay[J]. Analytical Letters，2007，40（5）：887-896.

[10]LONG Feng，ZHU Anna，SHI Hanchang，et al.Hapten-grafted graphene as a transducer for homogeneous competitive immunoassay of small molecules[J].Analytical Chemistry，2014，86（6）：2862-2866.

[11]HUANG Hailiang，SHI Shuo，GAO Xing，et al.A universal label-free fluorescent aptasensor based on Ru complex and quantum dots for adenosine，dopamine and 17β-estradiol detection[J]. Biosensors and Bioelectronics，2016，79：198-204.

[12]SUN Meimei，DU Lingyun，GAO Suqin，et al. Determination of 17β-oestradiol by fluorescence immunoassay with streptavidin-conjugated quantum dots as label[J].Steroids，2010，75（6）：400-403.

[13]MIYASHITA M，SHIMADA T，MIYAGAWA H，et al.Surface plasmon resonance-based immunoassay for 17β-estradiol and its application to the measurement of estrogen receptor-binding activity[J].Analytical and Bioanalytical Chemistry，2005，381（3）：667-673.

[14]ELLINGTON A D，SZOSTAK J W.Selection in vitro of single-stranded DNA molecules that fold into specific ligand-binding structures[J].Nature，1992，355（6363）：850-852.

[15]LUZI E，MINUNNI M，TOMBELLI S，et al.New trends in affinity sensing：Aptamers for ligand binding[J].Trac Trends in Analytical Chemistry，2003，22（11）：810-818.

[16]KIM Y S，JUNG H S，MATSUURA T，et al.Electrochemical detection of 17β-estradiol using DNA aptamer immobilized gold electrode chip[J].Biosensors and Bioelectronics，2007，22（11）：2525-2531.

[17]BAI Wenhui，ZHU Chao，LIU Jinchuan，et al.Split aptamer-based sandwich fluorescence resonance energy transfer assay for 19-nortestosterone[J].Microchimica Acta，2016，183（9）：2533-2538.

[18]KHAN I M，NIAZI S，YU Ye，et al.Aptamer induced multicolored AuNCs-WS2 "Turn on" FRET nano platform for dual-color simultaneous detection of aflatoxin B1 and zearalenone[J].Analytical Chemistry，2019，91（21）：14085-14092.

[19]劉曉，朱成龍，龐月紅，等.基于黑磷納米片的熒光適配體傳感器檢測雌激素17β-雌二醇[J].食品工業(yè)科技，2021，42（11）：248-254.

LIU Xiao，ZHU Chenglong，PANG Yuehong，et al.Fluorescence aptasensor for 17β-estradiol determination based on black phosphorus nanosheets[J].Science and Technology of Food Industry，2021，42（11）：248-254.

[20]WANG Yu，YANG Chengxiong，YAN Xiuping.Hydrothermal and biomineralization synthesis of a dual-modal nanoprobe for targeted near-infrared persistent luminescence and magnetic resonance imaging[J].Nanoscale，2017，9（26）：9049-9055.

[21]YUAN Quan，WU Yuan，WANG Jie，et al.Targeted bioimaging and photodynamic therapy nanoplatform using an aptamer-guided G-quadruplex DNA carrier and near-infrared light[J].Angewandte Chemie International Edition，2013，52（52）：13965-13969.

[22]LU Chang，LIU Yibo，YING Yibin，et al.Comparison of MoS2，WS2，and graphene oxide for DNA adsorption and sensing[J].Langmuir，2017，33（2）：630-637.

[23]吳世嘉，聶雨，張輝，等.基于KGdF4：Dy3+納米材料檢測土霉素的生物傳感新方法[J].食品與機(jī)械，2014，30（6）：64-68.

WU Shijia，NIE Yu，ZHANG Hui，et al.A biosensor based on KGdF4：Dy3+ nanoparticals for oxytetracycline determination[J].Food & Machinery，2014，30（6）：64-68.

[24]ABDUKAYUM A，CHEN Jiatong，ZHAO Qiang，et al.Functional near infrared-emitting Cr3+/Pr3+co-doped zinc gallogermanate persistent luminescent nanoparticles with superlong afterglow for in vivo targeted bioimaging[J]. Journal of the American Chemical Society，2013，135（38）：14125-14133.

[25]VASILE M，VLAZAN P，AVRAM N M.Characterization and optical properties of ZnGa2O4：Eu3+ nanophosphor grown by hydrothermal method[J].Journal of Alloys and Compounds，2010，500（2）：185-189.

[26]時建偉，騰曉旭，王琳玲，等.新型稀土配合物的固相合成、表征及熒光性能研究[J].河北科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，36（2）：182-187.

SHI Jianwei，TENG Xiaoxu，WANG Linling，et al.Studies on solid phase synthesis，characterization and fluorescent property of the new rare earth complexes[J].Journal of Hebei University of Science and Technology，2015，36（2）：182-187.

[27]VASILE M，AVRAM N，VLAZAN P，et al.Characterization and calculation of energy levels scheme for Er3+：ZnGa2O4[J].Journal of Optoelectronics and Advanced Materials，2008，10（11）：2898-2901.

[28]SHI Qiang，ZHANG Junying，CAI Chao，et al.Synthesis and photoluminescent properties of Eu3+-doped ZnGa2O4 nanophosphors[J].Materials Science and Engineering：B，2007，149（1）：82-86.