紫花苜?；ㄇ嘬蘸铣傻霓D(zhuǎn)錄組分析

潘新怡，史 昆，龔 攀，韋 寶，吳欣明，王 贊*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所, 北京 100193；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院, 北京 100193；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所, 山西 太原 030032)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，起源于“近東中心”，即小亞細(xì)亞、外高加索、伊朗和土庫曼的高地[1]。因其產(chǎn)量高、適口性好、消化率高、營養(yǎng)物質(zhì)豐富，素有“牧草之王”的美稱。一直以來，紫花苜蓿不僅作為優(yōu)質(zhì)的飼草為家畜提供營養(yǎng)，還在生態(tài)環(huán)境建設(shè)中發(fā)揮著重要的作用。紫花苜蓿作為高度雜合的同源四倍體，具有自交不親和性，遺傳背景復(fù)雜等特點(diǎn)，使得其復(fù)雜數(shù)量性狀的研究相對較難。

花色素苷是花青素糖基化衍生物的總稱，廣泛存在于植物的根、莖、葉、花、果實(shí)等器官中，是植物的重要性狀，可以賦予植物顏色[2]，在植物傳粉、果實(shí)色澤、芳香氣味等方面也有重要的作用。植物花青素還具有較強(qiáng)的自由基清除能力[3]，在植物對生物和非生物脅迫響應(yīng)中具有重要的作用，并且在人類疾病治療等方面也具有重要的作用[4]。目前，花青素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在葡萄風(fēng)信子(Muscaribotryoides)[5-6]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[7]等花卉植物中的研究比較清晰，但在豆科牧草上的研究較少?；ㄉ鳛橹匾谋硇托誀睿哂斜阌谟^察，遺傳穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，常常作為育種工作的參考指標(biāo)。紫花苜蓿的花一般以紫色、淺紫色為主，Barnes曾報(bào)道稀有的白花突變體存在[8]。我們在田間資源圃中發(fā)現(xiàn)來自哈薩克斯坦的紫花苜蓿野生材料中有一株白花突變體。但目前對于調(diào)控紫花苜?；ㄉ难芯枯^少，發(fā)掘調(diào)控花色的關(guān)鍵基因，探索紫花苜?；ㄉ招纬傻姆肿訖C(jī)制，對紫花苜蓿的相關(guān)性狀分子遺傳改良具有重要的意義。

在各種花色素苷的合成過程中，類黃酮羥化酶是合成花青素的一類關(guān)鍵酶，主要負(fù)責(zé)催化花瓣中產(chǎn)生不同的花青素類型，屬于細(xì)胞色素P450家族，包括類黃酮3′-羥化酶(Flavonoid 3′-hydroxylase,F3′H)和類黃酮3′5′羥化酶(Flavonoid 3′,5′-hydroxylases,F3′5′H)。其中，F(xiàn)3′5′H可以催化二氫黃酮醇B環(huán)3′5′位置發(fā)生羥基化，繼而DFR催化生成無色的花青素，再經(jīng)花青素合成酶(Anthocyanidinsynthase,ANS)和類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Flavonoid 3-O-glucosyltransferase,3GT)催化形成藍(lán)色的翠雀素-3-葡糖苷，最終形成藍(lán)紫色的花翠素[9-10]。研究表明，百合(Liliumbrownii)和月季(Rosachinensis)等花卉植物，由于F3′5′H的缺失，導(dǎo)致無法積累花翠素，從而不能產(chǎn)生藍(lán)色品系[11]。在康乃馨(Dianthuscaryophyllus)和玫瑰(Rosarugosa)等植物中異位表達(dá)F3′5′H，都獲得了藍(lán)紫色新品系[12]。王宇塵等的研究發(fā)現(xiàn)在超表達(dá)F3′5′H基因的煙草(Nicotianatabacum)株系花瓣都出現(xiàn)紫紅色[13]，在黑果枸杞(Lyciumruthenicum)中F3′5′H基因的表達(dá)量高于在白色枸杞中的表達(dá)水平2 391倍左右[14]。另外，研究表明，黃酮醇合酶(Flavonol synthase,FLS)可以和DFR競爭性催化底物，減少藍(lán)色色素沉積，通過調(diào)節(jié)FLS和DFR的表達(dá)，可以改變葡萄風(fēng)信子的藍(lán)色色素的沉積[15]。在植物中，花色苷的分解代謝途徑也被廣泛研究[16]，但是其分子機(jī)制尚不清楚，尤其是花色控制在不同物種中可以通過多種方式實(shí)現(xiàn)，例如在藍(lán)豬耳(Toreniafournieri)中，當(dāng)查爾酮合成酶(Chalcone synthase,CHS)和DFR基因共抑制后，藍(lán)豬耳產(chǎn)生白花和藍(lán)/白的花，而F3′5′H共抑制后則產(chǎn)生了粉紅色的花[17]，其調(diào)控機(jī)制尚不清晰。

轉(zhuǎn)錄因子，是調(diào)控基因表達(dá)的一類調(diào)控因子，通過調(diào)控一個(gè)或多個(gè)下游基因的表達(dá)，參與植物的生長、發(fā)育、代謝和耐逆性等生理過程中[18]。在花青素合成的途徑中，轉(zhuǎn)錄因子同樣發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，研究表明(bHLH)/MYC，R2R3-MYB，WD40，WRKY，BZIP及MADS-Box等轉(zhuǎn)錄因子都參與花青素合成基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[19]。其中，以MYB，bHLH，WD40形成的MBW復(fù)合體調(diào)控花青素合成酶基因的轉(zhuǎn)錄是最主要的一個(gè)途徑。Ben-Simhon等在石榴(Punicagranatum)上證實(shí)了PgWD40基因能與bHLH轉(zhuǎn)錄因子(PgAn1)和MYB轉(zhuǎn)錄因子(PgAn2)相互作用，共同調(diào)控下游結(jié)構(gòu)基因DFR和無色花青素雙加氧酶(Leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX)的表達(dá)[20]。研究表明大麥(Hordeumvulgare)籽粒糊粉層中的藍(lán)色顆粒色素積累與MBW復(fù)合物相關(guān)[21]。葡萄(Vitisvinifera)中的VvMYBA2-VvMYC1可顯著增強(qiáng)類黃酮3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶(Anthocyanidin 3-O-glucosyltransferase，VvUFGT)的表達(dá)，VvMYBA1-VvMYC1可顯著增強(qiáng)花青素還原酶(Anthocyanidin reductase,ANR)和查爾酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)的表達(dá)，進(jìn)而增加植物原花青素或花青苷的合成[22]。Qi等在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)WD40/bHLH/MYB復(fù)合物可以相互作用，在茉莉酸的誘導(dǎo)下激活下游信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控花青素的積累，進(jìn)而增強(qiáng)植物應(yīng)對外界不良環(huán)境的能力[23]。不但如此，單個(gè)類型的轉(zhuǎn)錄因子也可以調(diào)控關(guān)鍵合成酶基因的表達(dá)，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道在植物苯丙氨酸和類黃酮的生物調(diào)節(jié)途徑中發(fā)揮重要的功能[24]。ZmC1是植物中第一個(gè)鑒定的MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控玉米(Zeamays)的花青素表達(dá)[25]。在苦蕎(Fagopyrumtataricum)中過表達(dá)FtMYB1和FtMYB2能夠顯著增加原花青素的積累[26]。Takos等的研究表明蘋果(Malusdomestica)MdMYB1基因是調(diào)控蘋果果皮花色苷生物合成的關(guān)鍵基因[27]。

本研究以紫花苜蓿及其白花突變體為研究材料，進(jìn)行RNA-Seq分析，探究可能影響紫花苜?；ㄉ纬傻年P(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和調(diào)控基因，為紫花苜蓿花色調(diào)控分子機(jī)制提供基因資源并奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為紫花苜蓿(‘ZW3236’)及其白花突變體，來自哈薩克斯坦野生紫花苜蓿材料，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所提供。于2018年5月于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)基地取樣，在人工氣候室扦插培養(yǎng)(光照強(qiáng)度>450 μmol·m-2；溫度25℃；16 h光照/8 h黑暗；空氣濕度 60%～80%)，將扦插成活的苗子移栽至中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平基地。在初花期時(shí)，分別采集紫花和白花2種材料的花作為試驗(yàn)材料，每種材料設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采集好的樣品立即置于液氮中，然后放在-80℃冰箱保存待用。

1.2 總RNA提取、cDNA文庫構(gòu)建及轉(zhuǎn)錄組測序

使用Eastep?Super總RNA提取試劑盒(購于Promega公司)提取花瓣RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，使用安捷倫2100 RNA Nano 6000 Assay Kit(Agilent Technologies,CA,USA)對RNA進(jìn)行精確質(zhì)檢。將合格的總RNA樣品送往銳博生物科技(廣州)有限公司進(jìn)行測序，構(gòu)建cDNA文庫，利用Illumina HiSeqTM-2500進(jìn)行測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)處理

測序所得的原始序列(Raw Reads)經(jīng)過去接頭、去冗余處理，進(jìn)一步拼接并對同源轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行聚類，得到最終的純凈序列，即高質(zhì)量序列，以FASTQ文件格式儲(chǔ)存。后續(xù)所有的研究都是基于高質(zhì)量序列進(jìn)行。

1.4 基因功能注釋

以‘中苜1號(hào)’紫花苜蓿的基因組作為參考基因組(NGDC,https://bigd.big.ac.cn/)。利用軟件HISAT2(v2.2.0.4)將clean reads比對到參考基因組序列，使用Cufflinks(v2.1.1)軟件將比對結(jié)果組裝構(gòu)建轉(zhuǎn)錄本，選擇最完整的轉(zhuǎn)錄本作為Unigene。使用Blast(v2.2.28)將Unigene序列與Nr(NCBI non-redundant protein sequences)，Nt(NCBI nucleotide sequences)，MTGD(Medicago truncatula Genome Database)，KOG(euKaryotic Ortholog Groups)等公共數(shù)據(jù)庫比對，匹配率≥70%且E-value≤1E-5，獲取Unigene注釋信息。

1.5 差異基因表達(dá)分析及功能富集

基因表達(dá)水平一般是通過該基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的數(shù)量來衡量的，轉(zhuǎn)錄本豐度越高則基因表達(dá)水平越高。通過FPKM法來計(jì)算基因的表達(dá)量，即每百萬fragments中來自某一基因每千堿基長度的fragments數(shù)目，通過FPKM值可直接表示差異基因的表達(dá)水平。差異基因篩選主要參考差異倍數(shù)(Fold change值)以及q值作為相關(guān)指標(biāo)，以|log2Fold change|≥1和q <0.05的差異基因作為差異表達(dá)基因，使用DESeq進(jìn)行差異基因分析，在基因本體數(shù)據(jù)庫(Gene ontology,GO)中對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集和功能注釋，并同時(shí)利用KOBAS(v2.0.12)軟件在京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)中搜索差異表達(dá)基因的KEGG注釋信息，確定差異表達(dá)基因參與的代謝途徑。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，選擇12個(gè)與花青苷合成相關(guān)的差異轉(zhuǎn)錄因子，利用NCBI網(wǎng)站在線設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。以RNA樣品為模板，利用TRANSGENE One-Step反轉(zhuǎn)錄體系合成模板cDNA，以MsActin為內(nèi)參基因，采用TRANS公司的PerfectStartTM Green qPCR SuperMix實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，利用ABI7500 Real-Time PCR system進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用2-ΔΔCT方法計(jì)算各基因的表達(dá)量[28]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量分析

“紫花”和“白花”的RNA樣品經(jīng)Illumina平臺(tái)測序后得到的原始序列為6 851.4～8 272.7萬條，經(jīng)過濾和質(zhì)控，分別得到了6 077.4～7 413.7萬條有效序列，占原始序列的88.7%～93.12%，Q30大于94.78%，說明測序質(zhì)量較好，可進(jìn)行后續(xù)分析。將獲得的clean reads比對到紫花苜?；蚪M，比對率為68.35%～74.19%，比對到基因組多個(gè)位置的序列占比為3.97%～4.47%，比對率相對較低的原因可能是由于紫花苜蓿遺傳背景復(fù)雜而導(dǎo)致的。

表1 樣品轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.2 差異表達(dá)基因的篩選

通過比較兩種材料間的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，選取|log2Fold change|≥1并且q <0.05的基因作為顯著差異表達(dá)基因，使用DESeq進(jìn)行差異基因分析。經(jīng)篩選得到“白花”和“紫花”兩種樣品中的差異基因一共為4 857個(gè)，與紫花相比，白花中2 294個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，2 563個(gè)基因下調(diào)表達(dá)，分別占差異基因數(shù)量的47.2%，52.8%，從圖1中可以看出兩組材料之間的基因表達(dá)水平具有顯著差異。

圖1 “紫花”和“白花”差異基因火山圖

2.3 差異表達(dá)基因的富集分析

2.3.1差異表達(dá)基因的GO富集分析 富集分析是全面描述生物體中基因及其產(chǎn)物屬性的分類系統(tǒng)。對獲得的基因進(jìn)行GO注釋之后，按照基因參與的生物學(xué)過程(Biological process)、所處的細(xì)胞組分(Cellular component)及具有的分子功能(molecular function)等3個(gè)方面對基因功能進(jìn)行分類。

如圖2所示，共分為54類，其中差異基因被注釋到23個(gè)生物學(xué)過程，17個(gè)細(xì)胞組分，14個(gè)分子功能中。細(xì)胞組分顯著富集在細(xì)胞膜和細(xì)胞器等5個(gè)組分類別；生物學(xué)過程主要顯著富集在代謝過程、細(xì)胞過程、對刺激的響應(yīng)以及生物學(xué)調(diào)控等方面；分子功能分析中差異基因主要富集在催化活性和結(jié)合組分2方面。

圖2 “紫花”和“白花”差異表達(dá)基因的GO富集分析

2.3.2差異表達(dá)基因的KEGG富集分析 為了進(jìn)一步研究差異基因所參與的代謝通路，利用MapMan工具對差異基因進(jìn)行Pathway富集分析，差異基因被注釋到125條代謝通路中。進(jìn)一步對KEGG中每個(gè)Pathway應(yīng)用超幾何檢驗(yàn)進(jìn)行富集分析，發(fā)現(xiàn)這些基因顯著富集到6條代謝通路中，分別是苯丙氨酸生物合成途徑、角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的生物合成、植物病原菌互作途徑、過氧化物酶體、脂肪酸降解以及α-亞麻酸代謝途徑。如圖3所示，苯丙氨酸途徑富集最顯著，包含了45個(gè)具有顯著差異的基因，其中20個(gè)基因顯著上調(diào)，25個(gè)基因顯著下調(diào)；其次是角質(zhì)層和蠟質(zhì)層的生物合成途徑，共包含24個(gè)差異顯著基因，其中11個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，13個(gè)基因下調(diào)表達(dá)；過氧化物酶途徑中，共24個(gè)基因的表達(dá)具有顯著差異，其中10個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)，其余基因顯著下調(diào)表達(dá)；α-亞麻酸代謝途徑中，6個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)，10個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)；脂肪酸降解途徑，共涵蓋16個(gè)差異表達(dá)基因，包括6個(gè)上調(diào)和10個(gè)下調(diào)表達(dá)的差異基因；植物病原菌互作途徑，共包括79個(gè)差異表達(dá)基因，30個(gè)基因顯著上調(diào)表達(dá)，49個(gè)基因顯著下調(diào)表達(dá)。

圖3 “紫花”和“白花”差異表達(dá)基因的KEGG pathway富集分析

類黃酮途徑是植物花青素合成中的關(guān)鍵通路。雖然類黃酮通路在KEGG富集分析結(jié)果中并未顯著富集，但本研究發(fā)現(xiàn)在類黃酮途徑中，合成花青素的關(guān)鍵合成酶基因DFR的表達(dá)量在“白花”中顯著低于“紫花”(圖4A)。qRT-PCR結(jié)果也表明，與“紫花”相比，白花突變體DFR的表達(dá)量降低了16倍左右，具有極顯著性差異，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致(圖4B)。因此，我們認(rèn)為DFR表達(dá)量顯著下降可能是導(dǎo)致白花產(chǎn)生的主要原因。我們在PlantCARE中分析了DFR基因的啟動(dòng)子，結(jié)果表明，在DFR啟動(dòng)子中存在許多基序類型，其中存在大量的MYB以及MYB-like轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合基序(圖4C)，包括參與干旱脅迫的MYB結(jié)合位點(diǎn)GTCAAC(MBS和Myb)、參與光響應(yīng)的MYB結(jié)合位點(diǎn)AACCTAA(MRE)，MYB及MYB-like結(jié)合基序CAACCA和TAACCA(MYB和MYB-like sequence)等。另外，在DFR的啟動(dòng)子中還存在著5個(gè)MYC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，包括CATTTG，CAATTG和CATGTG(MYC)。

圖4 “紫花”和“白花”中DFR基因的表達(dá)量及啟動(dòng)子分析

2.4 與類黃酮生物代謝發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

關(guān)鍵合成酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控對花青苷的合成具有重要的調(diào)控作用，因此我們分析了2組材料間轉(zhuǎn)錄因子的差異表達(dá)情況。試驗(yàn)中共預(yù)測出57個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，共包含2 577個(gè)差異轉(zhuǎn)錄因子，其中1 173個(gè)轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達(dá)，1 404個(gè)轉(zhuǎn)錄因子下調(diào)表達(dá)。數(shù)量最多的前十類轉(zhuǎn)錄因子家族分別為NAC，bHLH，B3，WRKY，C2H2，MYB-related，C3H，bZIP，M-type，MYB等，占總預(yù)測量的10.8%，8.3%，7.9%，5.9%，5.6%，5.1%，5.1%，4.8%，3.5%和2.9%，總計(jì)占總預(yù)測量的59.9%。在報(bào)道的調(diào)控花青素合成的轉(zhuǎn)錄因子中，R2R3-MYB，bHLH和WD40，可以單獨(dú)或形成復(fù)合體調(diào)控花青苷合成途徑中關(guān)鍵基因的表達(dá)，在花青苷合成中具有重要的作用[29]。因此，我們從差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子中挑選了5個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子、5個(gè)BHLH轉(zhuǎn)錄因子、2個(gè)WD40轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果如圖5所示，4個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子、3個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子、以及2個(gè)WD40轉(zhuǎn)錄因子在2組材料中都具有極顯著性差異(圖5A-5C)。將qRT-PCR試驗(yàn)中MYB，bHLH和WD40轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)量轉(zhuǎn)化為log2FC值，并與RNA-Seq測序得出的log2FC值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明2者之間顯著相關(guān)(R2=0.9267)，證明了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)具有較高的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性(圖5D)。

表2 轉(zhuǎn)錄因子引物信息

圖5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量及其與RNAseq數(shù)據(jù)的線性回歸分析

3 討論

植物的花型、花色和花期在植物的有性世代過程中起著至關(guān)重要的作用。其中花的顏色在植物授粉媒介的交流過程中提供了重要的視覺信號(hào)，花色的改變可能會(huì)導(dǎo)致授粉媒介改變，進(jìn)而影響植物授粉和種子形成[30]?；ㄉ饕苫ㄇ嘬辗e累所導(dǎo)致，花青素的積累受一系列環(huán)境條件和發(fā)育信號(hào)的調(diào)控?；ㄇ嘬兆鳛橐环N有效的活性氧清除劑[31]，也是植物響應(yīng)脅迫的重要物質(zhì)[32]?？梢?，對于紫花苜?；ㄉ难芯坎粌H有助于我們了解紫花苜?；ㄇ嘬招纬傻姆肿訖C(jī)制，在紫花苜蓿與環(huán)境因子間的互作和對生物與非生物脅迫的響應(yīng)等方面都具有重要的意義。

本研究對紫花苜蓿及其白花突變體的花進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，共發(fā)現(xiàn)了4 857個(gè)差異表達(dá)基因，主要富集在代謝過程、細(xì)胞過程、對刺激的響應(yīng)以及生物學(xué)調(diào)控等生物學(xué)過程及催化活性和結(jié)合組分2方面分子功能中。這些都表明了關(guān)鍵的花青苷合成代謝途徑及其關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的差異可能是產(chǎn)生白花突變體的主要原因。進(jìn)一步差異表達(dá)基因的KEGG pathway富集分析結(jié)果表明苯丙氨酸途徑在2組材料間存在顯著差異，可能是引起花色喪失的一個(gè)原因。眾所周知，苯丙氨酸途徑是類黃酮途徑中第一步底物4-香豆酰CoA的來源[33]，因此白花突變體的產(chǎn)生可能是由于影響了最初底物的合成，從而造成顏色缺失。

類黃酮羥化酶是合成花青素的一類關(guān)鍵酶，其中F3′5′H在多種植物中都被報(bào)道是調(diào)控藍(lán)色花形成的主要結(jié)構(gòu)基因[2]。例如，Guo等在大豆(Glycinemax)上證明了F3′5′H基因與大豆的花色相關(guān)，并開發(fā)了基因標(biāo)記[34]。在藍(lán)色葡萄漿果中，F(xiàn)3′5′H/F3′H的比例較高，導(dǎo)致花翠素衍生物的產(chǎn)量高于紅色或白色品種[35]，類似結(jié)果在瓜葉菊(Pericallishybrid)和洋蔥(Alliumcepa)中也有報(bào)道[36]。本試驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，F(xiàn)3′5′H的表達(dá)量未有顯著性差異，表明F3′5′H可能不是產(chǎn)生白花突變體的主要原因，但這需要結(jié)合蛋白組和代謝組的相關(guān)研究進(jìn)一步確定。

另外，DFR是類黃酮途徑中合成藍(lán)紫色花翠素的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因[37]。大量的研究結(jié)果表明，DFR功能缺失或表達(dá)量下降都會(huì)使得植物花色變白。例如，在葡萄風(fēng)信子中DFR的下調(diào)是藍(lán)色色素減少，形成白色花的原因[5-6]。Yan等人在大豆上發(fā)現(xiàn)，大豆花色受編碼二氫黃酮醇4-還原酶2(DFR2)的w4位點(diǎn)的隱性等位基因(w4)控制，DFR2完全喪失功能導(dǎo)致大豆花色變白[38]。DFR基因在葡萄風(fēng)信子中的表達(dá)具有組織特異性，與花青苷的積累高度協(xié)同，在月季花瓣上瞬時(shí)轉(zhuǎn)化DFR基因，該花瓣上出現(xiàn)了明顯的藍(lán)色斑塊[5]。此外，在2個(gè)不同顏色的海棠品種中，過表達(dá)DFR或沉默F(xiàn)LS會(huì)增加花青素的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致海棠紅色葉片和紅色果皮的表型[39]。不僅如此，Qi等在枸杞上研究發(fā)現(xiàn)，CHS，CHI，F(xiàn)3′5′H，DFR，ANS和UFGT與黑果枸杞的花青素積累水平成顯著正相關(guān)，特別是F3′5′H和DFR表達(dá)水平分別比白色枸杞高2 391和85倍[14]。我們的研究中也發(fā)現(xiàn)在紫色花瓣中DFR的表達(dá)量顯著高于白色花瓣中，與上述報(bào)道結(jié)果一致，這可能是白花突變體產(chǎn)生的另一個(gè)原因。

轉(zhuǎn)錄因子在花青素合成途徑中也具有重要作用。其中，R2R3-MYB，bHLH和WD40，3種類型的轉(zhuǎn)錄因子可以通過形成MBW復(fù)合體，共同與結(jié)構(gòu)基因的啟動(dòng)子結(jié)合并誘導(dǎo)其表達(dá)，從而控制花青苷的合成[40]。尤其，MYB轉(zhuǎn)錄因子已經(jīng)被廣泛報(bào)道參與花青苷的生物合成。例如，Jin研究表明，R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子PavMYB10.1與PavbH-LH和PavWD40蛋白相互作用，結(jié)合了花青素生物合成基因PavANS和PavUFGT的啟動(dòng)子區(qū)域，決定了櫻桃(Prunuspseudocerasus)成熟期果皮的顏色[41]。李春燕在白羊草上挖掘了43個(gè)R2R3-MYB型轉(zhuǎn)錄因子，他們主要參與植物的生長發(fā)育、次生代謝和逆境相應(yīng)等生物學(xué)過程[42]。Peng等在獼猴桃(Actinidiachinensis)中研究發(fā)現(xiàn)，MYB110轉(zhuǎn)錄因子在3個(gè)紫色獼猴桃的果皮中均有高表達(dá)，而在黃色獼猴桃品種中無表達(dá)；并且MYB110的過表達(dá)可以提高F3′5′H基因的表達(dá)，從而促進(jìn)花翠素衍生物的形成，表明了MYB110可能是紫色獼猴桃形成的正調(diào)控因子[43]。Rinaldo等在葡萄上證實(shí)了VvMYBA1和VvMYBA2能夠激活葡萄中花青素的生物合成，是花青素合成、修飾和后期轉(zhuǎn)運(yùn)的正向調(diào)節(jié)因子[44]。我們也分析了紫花苜類黃酮途徑中CHS，DFR，F(xiàn)LS和F3′5′H等基因的啟動(dòng)子序列，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些基因的啟動(dòng)子區(qū)都不同程度的包含著MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)或結(jié)合基序。尤其是具有顯著差異表達(dá)的DFR基因啟動(dòng)子區(qū)域含有多個(gè)MYB，MBS以及MYB-Like Sequence等基序，這進(jìn)一步表明MYB轉(zhuǎn)錄因子或者M(jìn)BW復(fù)合物可能在紫花苜?；ㄉ纬芍芯哂兄匾饔谩＾D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也表明，許多MYB，bHLH以及WD40等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量在兩組材料中具有顯著性差異，并且qPCR的結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基本一致，表明這些轉(zhuǎn)錄因子可能通過調(diào)控DFR基因的表達(dá)，從而控制紫色的形成，但這都需要進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證和確認(rèn)。

4 結(jié)論

本研究利用RNA-Seq技術(shù)，以紫花苜蓿及其白花突變體為研究材料，探究2種材料在轉(zhuǎn)錄水平上的差異，結(jié)果表明，紫花和白花之間共有差異表達(dá)基因4 857個(gè)，其中上調(diào)基因2 294個(gè)，下調(diào)基因2 563個(gè)；通過對差異表達(dá)基因的分析，初步確認(rèn)了可能影響紫花苜蓿花色形成的結(jié)構(gòu)基因和轉(zhuǎn)錄因子，研究發(fā)現(xiàn)類黃酮合成通路中關(guān)鍵基因DFR在白花突變體中的表達(dá)量顯著性下調(diào)，其啟動(dòng)子中存在大量的MYB類轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)核基序，以及5個(gè)MYC轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)，并且轉(zhuǎn)錄組學(xué)和熒光定量PCR等結(jié)果均表明MYB轉(zhuǎn)錄因子或MBW復(fù)合物可能通過調(diào)控DFR基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而影響紫花苜?；ㄉ剀盏男纬?，這將為紫花苜?；ㄉ纬蓹C(jī)制的研究提供一定的理論基礎(chǔ)，對全面了解紫花苜?；ㄉ{(diào)控的分子機(jī)制具有重要意義。