棘皮動物性別決定與分化研究進展

孫志惠，崔洲平，宋堅，常亞青

(大連海洋大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室, 遼寧 大連 116023)

性別被譽為是“進化生物學中問題的皇后”，一直是生命科學領域的研究熱點[1]。性別形成包括性別決定和性別分化，性別決定是指未分化的雙向潛能性腺決定其是向卵巢方向發(fā)育，還是向精巢方向發(fā)育的過程。而性別分化是指未分化的雙向潛能性腺發(fā)育為卵巢或者精巢，并出現(xiàn)第二性征的過程[2]。在水產(chǎn)動物中，揭示性別決定機制，可有助于實現(xiàn)對其進行性別控制，進而在實際育種工作中開展單性養(yǎng)殖。研究表明，單性養(yǎng)殖在提高群體生長率、控制繁殖速度、延長有效生產(chǎn)期、縮短育種時間等方面具有顯著優(yōu)勢。目前，大多數(shù)脊椎動物的性別決定及性別分化機制已經(jīng)得到較為全面的闡述，其性別決定機制也展現(xiàn)出復雜性和多樣性。如哺乳動物的性別決定機制屬于遺傳型性別決定，其性別是由位于Y染色體上的SRY基因決定[3]；多數(shù)爬行動物的性別決定屬于溫度依賴型性別決定，龜鱉類的性別會受到孵化溫度的影響[4-5]；而許多魚類不僅受遺傳因素決定，還受到環(huán)境因素的調控。如半滑舌鰨Cynoglossussemilaevis具有明顯的性染色體，屬于ZW/ZZ型，在溫度過高或過低時雌魚會發(fā)生性逆轉[6-7]，在遺傳育種的過程中可通過人為改變環(huán)境因素得到偽雄魚，然后與正常ZW雌魚交配得到WW超雌魚，從而實現(xiàn)全雌化育種。棘皮動物是繼脊索動物的第二大類后口動物，在物種進化過程中處于重要位置。棘皮動物共分為海百合綱Crinoidea、海膽綱Echinoidea、海參綱Holothuroidea、海星綱Asteroidea和蛇尾綱Ophiuroidea 5個綱，現(xiàn)存共7 444種[8]，主要分布于海洋中。其中海膽、海參、海星、海蛇尾具有較高食藥用價值[9-11]，海參和海膽更是被譽為“海產(chǎn)八珍”，經(jīng)濟價值極高[12-13]，據(jù)2021年中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒顯示，2020年中國海參和海膽?zhàn)B殖產(chǎn)量分別為196 564 t和7 952.53 t[14]。在海參產(chǎn)業(yè)中，中國北方以刺參Apostichopusjaponicus為主，南方海參種類繁多，如糙海參Holothuriascabra、梅花參Thelenotaananas、花刺參Stichopusvariegatus、白底輻肛參Actinopygamauritiana和黑乳參Microthelenobilis等。海膽作為一種模式生物，除具有重要的經(jīng)濟價值外，還因胚胎透明、發(fā)育同步、孵化速度快、結構簡單等特點，成為研究受精[15]、胚胎早期發(fā)育[16]、免疫[17]和進化[18]的一個良好模型。海膽的主要養(yǎng)殖種類有光棘球海膽Mesocentrotusnudus、中間球海膽Strongylocentrotusintermedius和馬糞海膽Hemicentrotuspulcherrimus等。性腺是海膽唯一可食用部分，因此，早在20世紀初就有研究人員針對其性別決定及性腺發(fā)育展開相關研究。近年來，隨著高通量測序、基因敲除、基因敲降、性控育種等生物技術的發(fā)展，棘皮動物的性別相關研究發(fā)展迅速。本文中，綜述了有關棘皮動物性別決定和性別分化的遺傳基礎，以及性別控制育種在棘皮動物養(yǎng)殖中的應用、前景展望，以期推動經(jīng)濟棘皮動物性別控制育種工作的進程。

1 棘皮動物生殖策略

1.1 性別表型多樣性

棘皮動物的性別表型呈現(xiàn)物種特異性和多樣性。絕大多數(shù)棘皮動物屬于雌雄異體，少數(shù)會在整個生活史中發(fā)生性逆轉，存在雌雄同體現(xiàn)象(表1)。

表1 棘皮動物中雌雄同體種類及其性別逆轉方式

棘皮動物雌雄同體(hermaphroditism)可分為兩類：功能性雌雄同體(functional hermaphroditism)和順序性雌雄同體(sequential hermaphroditism)。功能性雌雄同體是指具備成熟精巢和卵巢，并能夠同時產(chǎn)生精子和卵子的雌雄同體。順序性雌雄同體是指階段性的雌雄同體現(xiàn)象，即一個生物在特定的刺激之下轉變性別的過程。Kubota[25]通過性腺組織學觀察揭示了卵板步錨參Patinaptaooplax在繁殖季節(jié)可由雄性轉變?yōu)榇菩?，之后再回轉為雄性。貝氏尼斑海星Nepanthiabelcheri既可進行無性生殖又可進行有性生殖，Ottesen等[19]通過性腺組織學觀察發(fā)現(xiàn)，所有貝氏尼斑海星的性腺中均存在卵母細胞，這些性腺有的起卵巢作用，有的起精巢作用，發(fā)生無性生殖后，部分個體的卵巢會轉變?yōu)榫?。此外，在雌雄異體的群體如紫色球海膽Strongylocentrotuspurpuratus和暗色刺參Isostichopusfuscus中也會有個別個體表現(xiàn)為功能性的雌雄同體，其群體中性別比例往往會偏離1︰1[22,26]。

1.2 生殖對策多樣性

在棘皮動物中，有兩個與繁殖有關的生理學閾值：1)如果低于維持生物個體基本生存的最低營養(yǎng)需求，性腺將不會發(fā)育生長，而高于這個水平，性腺發(fā)育且體細胞有限生長(外部限制)；2)性腺和體細胞的生長都在一定程度上受到獲取食物能力的限制(內(nèi)在限制)[27]。刺參在繁殖狀態(tài)下存在多種生殖代價，如繁殖狀態(tài)會抑制運動耐力和消化生理，提高代謝水平。但刺參也會有相應的適應策略，如行動可塑性與攝食食物的選擇性可以適應運動耐力的減退和高能量的需求[28]。多數(shù)棘皮動物進行有性生殖，無性生殖的情況僅出現(xiàn)在少數(shù)海參、海星和海蛇尾中。除冠海星Stephanasteriasalbula是僅進行無性生殖的物種外[29]，其余可以進行無性生殖的棘皮動物多為無性生殖與有性生殖交替進行。如地中海的Coscinasteriastenuispina海星兼具無性和有性生殖的能力，在長期進行無性繁殖的群體中其性腺仍然會保留生殖能力[30]。伯頓海燕Aquilonastraburtoni、多篩指海星Linckiamultifora、輻蛇尾Ophiactissavignyi和Ophiocomellaophiactoides海星可以通過分裂中央盤或切開身體的某一只臂產(chǎn)生新個體[31-34]。黑海參Holothuriaatra和黃疣海參H.hilla則可以將自己的身體扭斷生長為兩個新的個體[35-36]。目前，海膽中尚未發(fā)現(xiàn)無性生殖相關的報道。棘皮動物中天然單性生殖情況十分罕見。棘皮動物的性別表型及生殖對策的多樣性，暗示著其性別決定及性別分化機制的多樣性。

1.3 性別二態(tài)性

性別二態(tài)性是指同一物種雌雄兩性間的性狀差異[37]。大多數(shù)棘皮動物無明顯的性別二態(tài)性，僅有少數(shù)種類可從外觀分辨性別。Curunariafrondosa海參的雄性個體具有指狀或可延伸的生殖乳突[38]。梅氏長海膽Echinometramathaei雄性個體生殖乳突呈細長的管狀，而雌性個體生殖乳突為短而圓的錐形突起[39]。也有些種類在個體大小方面存在顯著的雌雄差異，如沙錢Echinarachniusparma、挎雄蛇尾Ophiodaphneformata雌性個體大于雄性[40-41]。在極端自然環(huán)境下長棘海星Acanthasterplanci雄性個體為了延長壽命會犧牲其繁殖能力，從而導致雌性個體性腺質量大于雄性[42]。海參和海膽作為棘皮動物中重要養(yǎng)殖物種，較難從外表分辨雌雄，這也增加了遺傳育種工作的難度。但海參和海膽中免疫力、激素含量等方面存在明顯的性別差異[43]。此外，雌海膽性成熟時性腺會產(chǎn)生一種苦味氨基酸，使得雌性海膽不如雄性味道鮮美[44]。因此，在海參和海膽中開發(fā)單性養(yǎng)殖具有重要的應用前景。

2 棘皮動物性別決定和性別分化的遺傳基礎

通常性別決定可分為遺傳性別決定(genetic sex determination, GSD)和環(huán)境性別決定(environmental sex determination, ESD)。遺傳性別決定主要有基因性別決定和性染色體決定，性染色體又分為雄性異配性別決定和雌性異配性別決定；環(huán)境性別決定通常指生物的性別分化受到周圍環(huán)境因素影響，如溫度、pH、光照和周圍群體密度等環(huán)境因素控制[45]。許多物種在性別決定中包含了遺傳性別決定和環(huán)境性別決定兩種機制，且這兩種機制相互影響[6-7]。

2.1 染色體組成及異型性染色體

早在20世紀初，一些學者就針對棘皮動物的染色體展開了研究并試圖揭示其染色體的帶型。由于棘皮動物的染色體較小且緊聚，因此，進行染色體核型分析十分困難。棘皮動物的染色體數(shù)目在2n=36至2n=46之間，與其他物種相比，棘皮動物的染色體數(shù)目顯示出了高度的保守性，但是，穩(wěn)定的染色體數(shù)目并不一定意味著棘皮動物的進化過程中沒有染色體演化[46]。性染色體通常被認為是從一對常染色體演化而來，進化過程中積累的突變使得原始的常染色體上的某個或某幾個基因可以決定性別[47-48]。棘皮動物性染色體的研究一直是研究人員探究的熱點和難點。早期研究中，Pinney[49]用切片法觀察到Tripneustesventricosus海膽染色體數(shù)目為30、32、33，并推測海膽的性別決定類型屬于XO型。隨后，通過Lytechinuspictus海膽人工孤雌生殖試驗，發(fā)現(xiàn)存活個體都是雌性，由此推測，海膽的性別可能屬于雄性異配型[50]。Colombera等[51]通過染色體觀察推測，棘皮動物無可以區(qū)分的性染色體。但是，在紫色球海膽的胚胎時期進行切割可以獲得同樣性別的個體，意味著紫色球海膽性別可能是由染色體決定的[52]。直到1996年，Lipani等[53]在擬球海膽Paracentrotuslividus中發(fā)現(xiàn)了異型性染色體，并根據(jù)其核型分析提出擬球海膽性別決定機制屬于XX/XY型。隨后，在馬糞海膽、紫色球海膽中也觀察到了異型性染色體[54-55]。值得注意的是，Eno等[55]通過熒光原位雜交技術將雄性特異性表達的基因bindin定位到了紫色球海膽的一對同源染色體上，該染色體是否是性染色體還有待驗證。

2.2 性別相關分子標記的挖掘

目前，針對棘皮動物性別決定和性別分化的研究還處于起步階段。近年來，隨著高通量測序技術的迅猛發(fā)展，紫色球海膽、長棘海星和刺參相繼完成了全基因組測序工作[56-58]，這為棘皮動物性別標記基因的挖掘提供了海量的數(shù)據(jù)。目前，針對棘皮動物性別決定和性別分化的研究主要集中在性腺發(fā)育、配子發(fā)生及性腺轉錄組測序等層面。海參中性別分子標記相關報道甚少，近期，魏金亮等[59]基于全基因組水平經(jīng)過同源比對鑒定出dmrt1、nodal、foxl2、piwi等多個與性腺發(fā)育相關的基因，值得注意的是，nodal在卵巢中特異表達。此外，DNMT3作為一種DNA甲基轉移酶，在刺參的精巢中特異表達，暗示著刺參的性別發(fā)生可能與甲基化有關[60]。與海參相比，海膽中針對性別分子標記挖掘的工作相對較多，如在光棘球海膽卵巢轉錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出8個與卵巢成熟相關的基因，包括Mos、Cdc20、Rec8、YP30、cytochromeP450 2U1、ovoperoxidase、proteoliaisin和rendezvin[61]，47個雄性特異小分子RNA(MicroRNAs)和51個雌性特異小分子RNA[62]。此外，一些進化上高度保守的性別標記基因也通過高通量測序工作得以挖掘。相關學者通過性腺轉錄組測序在光棘球海膽中鑒定出多個性別差異表達基因，其中包括雄性特異表達基因dmrt1[63]、生殖細胞標記基因nanos2[64]與piwi[65]，以及與卵巢發(fā)育和維持相關的基因foxl2[66]等。值得注意的是，foxl2在光棘球海膽精巢中高表達，與脊椎動物同源的amh在卵巢中的表達量大于精巢，這與在脊椎動物中的表達情況相反，意味著其可能在棘皮動物性別決定和性別分化過程中發(fā)揮不同的作用[67]。本實驗室最新研究表明，通過簡化基因組測序技術，在刺參中鑒定出1個雄性特異DNA分子標記，可以快速、精準地鑒定刺參生理性別，并推測刺參的性別決定應該是XX/XY型[68]。采用同樣的方法，在光棘球海膽開發(fā)出3個可用于性別鑒定的雌性特異DNA分子標記，并推測光棘球海膽的性別決定類型為ZW/ZZ型[69]。

3 性別控制育種技術在棘皮動物養(yǎng)殖中的應用

3.1 人工誘導雌核發(fā)育

天然單性種群多采用雌核生殖、孤雌生殖或雜種生殖的方法繁衍后代[70]。海膽性腺是唯一可食用部分，培養(yǎng)不育的三倍體海膽可以抑制配子發(fā)生，延長上市時間。為了達到上述目的，常亞青等[71]率先提出利用靜水壓法獲得四倍體海膽，之后與正常的二倍體雜交，最終獲得三倍體海膽。隨后，B?ttger等[72]采用另外一種完全不同的方式培育三倍體海膽，即先把兩個成熟卵融合，再用高度稀釋的精子使卵融合產(chǎn)物受精。多倍體育種過程中會由于無法正常進行減數(shù)分裂而不能正常繁育后代[73]，這正是多倍體育種面臨的主要障礙，解決方式之一就是人工誘導雌核發(fā)育。雌核發(fā)育是水產(chǎn)經(jīng)濟動物種質改良、建立全雌化后代、縮短育種年限的有效方法，且已經(jīng)成功運用在多種水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。例如，利用熱休克或靜水壓法抑制卵母細胞第二極體排出誘導虹鱒雌核發(fā)育[74]，使用電刺激誘導櫛孔扇貝Chlamysfarreri雌核發(fā)育[75]。與魚類和貝類不同，海膽成熟卵的第一極體和第二極體在卵巢中已排出，因此，無法通過抑制第一極體和第二極體的方式誘導雌核發(fā)育二倍體，只能通過抑制第一次卵裂誘導雌核發(fā)育二倍體[76]。早在1975年，Brandriff等[50]就使用NH4OH和離子載體A23187激活海膽成熟卵，隨后進行二次高滲處理，成功誘導Lytechinuspictus海膽雌核發(fā)育并最終獲得了成年的雌性二倍體。盡管此方面的研究開始較早，但棘皮動物單性養(yǎng)殖、多倍體育種的案例仍鮮有報道，相關研究中，曹學彬等[77]通過紫外線照射滅活精子，隨后采用熱休克處理激活的卵子進而抑制其第一次卵裂使染色體加倍，獲得了海膽雌核發(fā)育胚胎。

3.2 性激素水平與性腺發(fā)育

性激素，尤其是雌二醇和睪酮在脊椎動物性別分化的過程中行使重要功能[78-79]。近年來，針對無脊椎動物性激素的研究成了熱點，且多集中在性激素種類的鑒定及對基因表達的影響兩個層面。Botticelli等[80]利用蒸餾和層析等方法證實，巨紫球海膽Strongylocentrotusfranciscanus性腺中存在雌激素，其中，17-β雌二醇活性最強；Sclerasteriasmollis海星的幽門盲腸可以合成17-β雌二醇[81]；在紅海盤車Asteriasrubens的幽門盲腸與性腺中均檢測到了雌酮和黃體酮，且兩者的含量呈季節(jié)性變化，卵黃開始形成時黃體酮含量會顯著升高，由此推測，黃體酮可能參與卵母細胞的發(fā)生[82]。此外，在胚胎發(fā)育早期用雌酮處理馬糞海膽與光棘球海膽，MYP基因表達會受到顯著的抑制[83]。

3.3 性別相關基因與性腺發(fā)育

性別決定基因是在性腺發(fā)育的早期瞬時表達并指導個體朝不同性別發(fā)育的基因，哺乳動物的Sry基因、紅鰭東方鲀Takifugurubripes的Amhr2基因[84]、非洲爪蟾Xenopuslaevis的DM-W基因等均為性別決定基因[85]。采用基因敲除或基因敲降技術缺失或沉默性別決定基因，會使該物種發(fā)生性反轉，進而產(chǎn)生遺傳背景與性別表型不一致的現(xiàn)象。例如，在青鳉Oryziaslatipes中注射Dmy基因的反義RNA，會影響Gsdf、Sox9a2和Rspo1基因等的表達，同時會使雄魚發(fā)生性逆轉[86]。目前，棘皮動物中尚未有性別決定基因的報道，也無利用基因敲除獲得基因缺失的成體案例。但利用RNA干擾等技術使性別相關基因表達沉默，在海參和海膽中均有報道。光棘球海膽中，通過向體腔內(nèi)注射靶向特異的雙鏈RNA(dsRNA)可以成功敲降靶基因nanos2，同時降低boule和foxl2基因表達量[64]。在刺參中，運用同樣的方法也可以降低靶基因及性腺發(fā)育有關基因表達[87]。這些研究為在成體水平研究棘皮動物性別標記基因與性腺發(fā)育之間的關系奠定了基礎。

4 未來重點研究方向

近年來，棘皮動物性別決定與分化的研究已經(jīng)取得了一些初步的進展，特別是全基因組、轉錄組、蛋白質組及代謝組等大數(shù)據(jù)信息的不斷完善，為棘皮動物性別決定的基礎研究提供了海量的數(shù)據(jù)支撐，熒光原位雜交、染色體切割、基因敲降、基因敲除等技術的快速發(fā)展也為在棘皮動物中研究基因的定位及功能奠定了基礎。但是棘皮動物性別決定和性別分化的機制仍不明確，未來應在以下方面開展深入研究：

1)性染色體的確定。盡管在一些棘皮動物的物種中，通過顯微觀察等技術觀察到了異型染色體，但棘皮動物中是否存在性染色體仍不明確。后期可改進染色體制備技術，盡量避免染色體丟失，并結合熒光原位雜交技術把性別連鎖基因定位在染色體上，隨后通過顯微切割、單染色體測序等工作分離鑒定棘皮動物的性染色體。

2)性別連鎖分子標記的開發(fā)與應用。多數(shù)棘皮動物不具備性別二態(tài)型，這大大增加了遺傳育種工作的難度。可以通過簡化基因組測序及構建遺傳連鎖圖譜等開發(fā)穩(wěn)定的性別特異的分子標記，如SNP位點，以應用于分子標記輔助育種。

3)基因編輯技術的應用。隨著高通量測序的蓬勃發(fā)展，棘皮動物如海參、海膽中都鑒定出了大量與性腺發(fā)育相關的基因，接下來如何揭示基因功能成為重中之重。海參、海膽研究中都有胚胎發(fā)育時期成功進行基因敲除的案例，由于成活率低，基因敲除的胚胎較難發(fā)育到成體階段。針對基因敲除難以進行的現(xiàn)狀，可以使用RNA干擾、慢病毒干擾等試驗技術研究棘皮動物性別相關基因的功能。

4)性激素誘導單性養(yǎng)殖。利用性激素誘導使脊椎動物發(fā)生性轉變是使用最為廣泛的單性育種技術，在棘皮動物中是否也可進行類似操作尚有待驗證。目前，在多種棘皮動物中都鑒定出了與棘皮動物同源的性激素，如雌二醇和睪酮，隨后，可以采用浸泡、口服、注射等方法用性激素誘導棘皮動物，開發(fā)單性養(yǎng)殖。

5)多倍體良種培育。利用三倍體不育的特性，培育三倍體刺參。三倍體刺參能有效限制性腺發(fā)育與體壁發(fā)育的營養(yǎng)競爭，進而顯著提高刺參的產(chǎn)量。此外，多倍體的生殖細胞會明顯大于同齡的二倍體生殖細胞，培育多倍體的海膽，會提高生殖腺的產(chǎn)量。培育三倍體可以先使用物理方法或化學方法在胚胎發(fā)育時期抑制二倍體胚胎卵裂，進而誘導四倍體產(chǎn)生，隨后與正常二倍體雜交得到三倍體。