同源盒基因2在大鼠慢性腎衰竭致血管鈣化進(jìn)程中的作用機(jī)制

徐瑩 操軒

心血管疾病(CVD)是慢性腎衰竭(CRF)患者的主要并發(fā)癥和首位死亡原因[1]。而慢性腎臟病患者并發(fā)心血管疾病大多與血管鈣化有關(guān)，故對(duì)CRF伴血管鈣化機(jī)制的研究在臨床上極為重要。其中建立類(lèi)似人類(lèi)CRF血管鈣化病理變化的理想動(dòng)物模型是研究的前提。CRF患者的血管鈣化是一種類(lèi)似于骨和軟骨形成的轉(zhuǎn)化過(guò)程[2]，而血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表達(dá)成骨細(xì)胞表型是該過(guò)程的中心環(huán)節(jié)[3-4]。骨形成蛋白(BMP)-2是骨細(xì)胞表型中重要成員之一，其下游骨轉(zhuǎn)錄因子同源盒基因2(Msx2)也起到重要作用。既往國(guó)外僅有體外實(shí)驗(yàn)研究顯示Msx2參與動(dòng)脈鈣化病變過(guò)程，故本實(shí)驗(yàn)采用高磷飲食聯(lián)合腺嘌呤灌胃的方法制備新的CRF血管鈣化大鼠模型，探討Msx2在CRF血管鈣化大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中的作用機(jī)制。

材料與方法

1.材料：12周齡成年雄性SD大鼠30只及大鼠飼料均購(gòu)于第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大鼠平均體質(zhì)量(200±20)g。腺嘌呤購(gòu)于美國(guó)Amersco公司，Von Kossa特殊染色試劑盒購(gòu)于美國(guó)Genmed Scientifics公司，核固紅復(fù)染試劑購(gòu)于博士德生物工程公司，二氨基聯(lián)苯二胺(DAB)顯色劑及增強(qiáng)型(Polink-1)免疫組化試劑盒(貨號(hào)PV-6001)購(gòu)于北京中山金橋公司，兔抗鼠同源盒基因Msx2(Hox8)多克隆抗體(貨號(hào)bs-6232R)購(gòu)于北京博奧森公司。

2.方法

(1)分組與造模方法：選擇12周齡健康成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為3組，即正常對(duì)照組、腺嘌呤灌胃組、高磷飲食+腺嘌呤灌胃組,每組10只。將腺嘌呤加蒸餾水配成濃度為2.5%混懸液，置于4 ℃冰箱備用。所有大鼠以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)1周后，腺嘌呤灌胃組及高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠每日以腺嘌呤250 mg/kg灌胃，正常對(duì)照組采用等量蒸餾水灌胃，均持續(xù)6周。腺嘌呤灌胃組和正常對(duì)照組大鼠期間以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠予以高磷飲食喂養(yǎng)。高磷飲食配方參考文獻(xiàn)[6]，其中高磷飲食含磷約1.2%，普通飲食含磷約0.6%。

(2)標(biāo)本采集：每日觀察大鼠狀態(tài)，并記錄大鼠體質(zhì)量、飲水量及尿量。于灌胃6周后將3組大鼠以3%戊巴比妥麻醉，心臟采血后予多聚甲醛心臟灌注致死，取出雙側(cè)腎臟及胸主動(dòng)脈，肉眼觀察后再將標(biāo)本固定在多聚甲醛中24小時(shí)備用。

(3)生化指標(biāo)檢測(cè)：處死前于大鼠心臟采血3 ml，離心后取血清，檢測(cè)大鼠血鈣、血磷、血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平。

(4)腎臟組織病理學(xué)檢查：將多聚甲醛中的大鼠腎臟組織進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察并計(jì)算3組大鼠腎小管間質(zhì)損傷指數(shù)(TIL)評(píng)分：每張標(biāo)本低倍鏡視野下隨機(jī)選取10個(gè)腎小球間質(zhì)視野，按照表1中各項(xiàng)觀察項(xiàng)目評(píng)分，各項(xiàng)評(píng)分總和為一個(gè)視野的評(píng)分，該標(biāo)本的腎小管間質(zhì)TIL評(píng)分=10個(gè)視野評(píng)分的平均值[6]。

表1 腎小管間質(zhì)TIL評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

(5)胸主動(dòng)脈病理學(xué)檢查：將多聚甲醛中的大鼠胸主動(dòng)脈組織常規(guī)脫水后進(jìn)行石蠟包埋，再制成3 μm切片，進(jìn)行HE染色和Von Kossa染色。Von Kossa染色后觀察并進(jìn)行鈣鹽沉積分級(jí)：0級(jí)，無(wú)鈣鹽沉積；1級(jí)，點(diǎn)狀沉積；2級(jí)，單個(gè)片狀沉積；3級(jí)，多個(gè)片狀沉積；4級(jí)，彌漫性沉積[7]。

(6)鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(SP)檢測(cè)Msx2在主動(dòng)脈中的表達(dá)水平：每張大鼠胸主動(dòng)脈組織切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(400倍)，鏡下見(jiàn)棕黃色為陽(yáng)性部位，使用Image-pro Plus圖像分析軟件測(cè)定每個(gè)視野的陽(yáng)性面積，取平均值。

結(jié) 果

1.3組大鼠一般情況：正常對(duì)照組大鼠造模6周后反應(yīng)靈敏，皮毛整齊，飲食及大便均正常，體質(zhì)量逐漸增長(zhǎng)至(300±20)g。腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠自造模2～3周后開(kāi)始出現(xiàn)精神萎靡，攝食量減少，體毛脫落，飲水量及尿量均明顯增加；4～5周后開(kāi)始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、皮膚斑禿，攝食量、大便量及次數(shù)、尿量均減少；該兩組大鼠自灌胃開(kāi)始體質(zhì)量均持續(xù)下降。造模過(guò)程中正常對(duì)照組10只全部存活，腺嘌呤灌胃組大鼠死亡3只，高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠死亡4只。

2.3組大鼠腎臟組織病理染色結(jié)果：肉眼觀察下，正常對(duì)照組大鼠腎臟組織呈深紅色、質(zhì)軟光滑。腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠腎臟呈米黃色，體積顯著增大，類(lèi)似“大白腎”，高度水腫、質(zhì)脆，皮髓質(zhì)分界不清。HE染色后鏡下觀察：正常對(duì)照組大鼠腎臟組織中腎小球、腎小管及腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)形態(tài)正常；腺嘌呤灌胃組與高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠腎臟組織中局部腎小管明顯萎縮或擴(kuò)張、管腔內(nèi)可見(jiàn)少量管型，上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性或壞死脫落，腎間質(zhì)纖維化，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；腎小球結(jié)構(gòu)破壞，少量纖維化，腎間質(zhì)及小管內(nèi)可見(jiàn)棕黑色結(jié)晶沉淀。見(jiàn)圖1。

圖1 3組大鼠腎臟組織HE染色結(jié)果(A：正常對(duì)照組；B：腺嘌呤灌胃組；C：高磷飲食+腺嘌呤灌胃組；×100)

3.3組大鼠生化指標(biāo)及TIL評(píng)分比較：腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠血磷、SCr、BUN水平及TIL評(píng)分明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)；高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠血磷水平高于腺嘌呤灌胃組(P<0.01)。3組大鼠血鈣比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 3組大鼠生化指標(biāo)及TIL評(píng)分比較

4.3組大鼠胸主動(dòng)脈組織病理染色結(jié)果：正常對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈HE染色結(jié)果顯示胸主動(dòng)脈彈力層完整、細(xì)胞排列整齊；腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠動(dòng)脈血管正常結(jié)構(gòu)破壞，平滑肌細(xì)胞增生，彈力層中層結(jié)構(gòu)改變；其中高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生更為明顯，結(jié)構(gòu)完全破壞。胸主動(dòng)脈Von Kossa染色結(jié)果顯示，正常對(duì)照組大鼠胸主動(dòng)脈組織染色呈粉紅色，未見(jiàn)黑色鈣鹽沉積，鈣鹽沉積分級(jí)為0級(jí)；腺嘌呤灌胃組和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠胸主動(dòng)脈組織中膜彈性纖維間可見(jiàn)黑色顆粒沉積于基質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)，即鈣沉積；其中高磷飲食+腺嘌呤灌胃組更為嚴(yán)重，可見(jiàn)黑色顆粒呈明顯線條狀彌漫性分布，故腺嘌呤灌胃組鈣鹽沉積為2～3級(jí)，高磷飲食+腺嘌呤灌胃組為3～4級(jí)。見(jiàn)圖2。

圖2 3組大鼠胸主動(dòng)脈組織病理染色結(jié)果(A、D：正常對(duì)照組；B、E：腺嘌呤灌胃組；C、F：高磷飲食+腺嘌呤灌胃組；A、B、C：HE染色；D、E、F：Von Kossa染色；×400)注：與正常對(duì)照組比較，aP<0.01；與腺嘌呤灌胃組比較，bP<0.01

5.3組大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中Msx2的表達(dá)水平比較：正常對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈中層血管平滑肌細(xì)胞中Msx2僅在胞漿中少量表達(dá)(86.60±12.79)，而腺嘌呤灌胃組(206.49±26.04)和高磷飲食+腺嘌呤灌胃組(336.74±38.92)大鼠平滑肌細(xì)胞胞漿及細(xì)胞外可見(jiàn)較多黃褐色物質(zhì)沉積，深染率高，提示Msx2表達(dá)增多，明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)。其中高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠血管平滑肌細(xì)胞可見(jiàn)黃色深染物質(zhì)沉積并聚集成片，其深染率明顯高于腺嘌呤灌胃組，提示Msx2表達(dá)水平高于腺嘌呤灌胃組(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

圖3 3組大鼠胸主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中Msx2的表達(dá)(A：正常對(duì)照組；B：腺嘌呤灌胃組；C：高磷飲食+腺嘌呤灌胃組；免疫組化染色，×400)

6.影響Msx2表達(dá)的相關(guān)分析：Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，腺嘌呤灌胃組及高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠血磷(r=0.882，P<0.01)、鈣鹽沉積分級(jí)(r=0.858，P<0.01)與Msx-2的表達(dá)水平均呈正相關(guān)。

討 論

目前國(guó)內(nèi)成熟的CRF血管鈣化造模方法主要包括腎次全切除加高磷飲食誘導(dǎo)[8]、腎大部切除聯(lián)合維生素D3[9]及腺嘌呤灌胃[10]，其中腎次全切除方法操作復(fù)雜、易感染且死亡率高；而維生素D3方法會(huì)使鈣鹽沉積在彈力膜[9]，與尿毒癥血管鈣化表現(xiàn)不符，故均不作為首選方法。而腺嘌呤灌胃進(jìn)入體內(nèi)，在黃嘌呤氧化酶作用下轉(zhuǎn)化為2,8-二羥基腺嘌呤，并沉積在腎小管，誘發(fā)腎功能衰竭，繼而出現(xiàn)電解質(zhì)紊亂，鈣磷代謝異常，形成動(dòng)脈鈣化[11]。本實(shí)驗(yàn)在腺嘌呤基礎(chǔ)上加入高磷飲食，結(jié)果證實(shí)高磷飲食聯(lián)合腺嘌呤灌胃方法制作血管鈣化模型效果更為顯著，為臨床CRF動(dòng)脈鈣化相關(guān)研究提供了一個(gè)新的快速可靠的造模方法。

本實(shí)驗(yàn)中大鼠胸主動(dòng)脈鈣化病理結(jié)果基本與臨床典型的尿毒癥血管鈣化表現(xiàn)相似，即類(lèi)似骨發(fā)育的、主動(dòng)的、可調(diào)控的動(dòng)脈鈣化過(guò)程，其表現(xiàn)為動(dòng)脈中層鈣化，且鈣化部位周?chē)梢?jiàn)骨基質(zhì)樣蛋白，內(nèi)膜完整、結(jié)構(gòu)正常。終末期腎衰竭患者的血管鈣化也與尿毒癥導(dǎo)致的高磷血癥密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中高磷飲食+腺嘌呤灌胃組大鼠胸主動(dòng)脈血管正常結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，平滑肌細(xì)胞增生紊亂，Von Kossa染色結(jié)果顯示主動(dòng)脈血管中膜組織間沉積了大量黑色顆粒，鈣鹽沉積為3～4級(jí)，均較腺嘌呤灌胃組嚴(yán)重，也提示高磷血癥誘導(dǎo)并加重了CRF血管鈣化程度。但其機(jī)制目前還尚未完全清楚，可能有以下3個(gè)方面：高磷可刺激血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)中堿性磷酸酶(ALP)的表達(dá)，從而誘導(dǎo)并上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CBFα1[12]，促進(jìn)成骨細(xì)胞表型及成骨相關(guān)性蛋白的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞鈣化；細(xì)胞內(nèi)高磷導(dǎo)致部分細(xì)胞凋亡，而后轉(zhuǎn)換為鈣化結(jié)晶，既往文獻(xiàn)研究表明凋亡小體可誘導(dǎo)VSMC鈣化[13]；細(xì)胞內(nèi)高磷還可刺激堿性磷酸酶(ALP)和鈣結(jié)合蛋白分泌[14]。

Wnt蛋白屬于分泌型的糖基化蛋白，可在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)，而骨轉(zhuǎn)錄因子Msx2可通過(guò)上調(diào)多種Wnt蛋白配基的表達(dá)從而增強(qiáng)Wnt/β蛋白信號(hào)通路[15]。此通路可分別促進(jìn)和調(diào)節(jié)間質(zhì)細(xì)胞、成肌纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞、成骨樣細(xì)胞分化增殖[16]。Msx2在CRF大鼠的鈣化血管內(nèi)大量表達(dá)，且與動(dòng)脈鈣鹽沉積分級(jí)呈正相關(guān)，表明其在CRF動(dòng)脈鈣化的整個(gè)進(jìn)程中起重要作用。高磷飲食干預(yù)后血管內(nèi)Msx2表達(dá)則明顯增加，考慮其相關(guān)機(jī)制可能是由于高磷誘導(dǎo)并上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子CBFα1，促進(jìn)骨形成蛋白(BMP)的表達(dá)，繼而上調(diào)其下游因子Msx2的表達(dá)，但具體的影響機(jī)制目前還尚未清楚，有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究探討。

綜上所述，腺嘌呤灌胃聯(lián)合高磷飲食是較為合適的研究CRF血管鈣化的造模方法。CRF血管鈣化是一個(gè)類(lèi)似成骨形成的過(guò)程，Msx2也參與了CRF血管鈣化病變的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，而高磷血癥會(huì)加重CRF血管鈣化程度，其機(jī)制可能與骨轉(zhuǎn)錄因子Msx2的表達(dá)水平升高有關(guān)。