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    精胺對(duì)輻射所致氧化損傷H9c2心肌細(xì)胞的影響研究

    2021-09-16 08:17:18杜霄許超涂彧周菊英
    中國(guó)全科醫(yī)學(xué) 2021年29期
    關(guān)鍵詞:精胺存活率空白對(duì)照

    杜霄,許超,涂彧,周菊英*

    機(jī)體的電離輻射損傷一直是放療科醫(yī)生非常關(guān)注的問(wèn)題。輻射可直接作用于細(xì)胞關(guān)鍵靶點(diǎn),導(dǎo)致DNA單鏈或者雙鏈發(fā)生斷裂;亦可作用于水分子,產(chǎn)生大量自由基,直接攻擊細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)的DNA,造成DNA的間接損傷,引發(fā)不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)而使細(xì)胞膜損傷、各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、酶活性降低和消失,如何避免或者減少這種損傷是目前研究的重點(diǎn)。精胺是一類廣泛分布的多胺,具有抗氧化、抗衰老、抗癌、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以及維持細(xì)胞膜、核酸和離子通道等細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的功能[1-3]。有研究表明,外源性精胺可使大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)收縮,并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性[4];細(xì)胞內(nèi)精胺濃度變化可影響細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。目前,精胺和放射導(dǎo)致的心肌氧化損傷之間的關(guān)系并不明確,相關(guān)研究甚少。因此本研究旨在探討精胺類藥物對(duì)輻射所致氧化損傷的心肌細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。

    1 材料與方法

    1.1 研究時(shí)間 2018年12月至2020年12月。

    1.2 實(shí)驗(yàn)材料 spermine(美國(guó)sigma公司),H9c2細(xì)胞系(中科院上海細(xì)胞庫(kù)),DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)corning公司),新生胎牛血清(美國(guó)gibco公司),胰蛋白酶(美國(guó)gibco公司),青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天科技有限公司),PBS(上海源培生物科技有限公司),CCK8試劑盒(日本同仁公司),超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A001-1-1,生產(chǎn)批號(hào):20190628),丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物研究所,貨號(hào):A003-1-1,生產(chǎn)批號(hào):20190629),Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(大連美倫生物技術(shù)有限公司:100T,貨號(hào):MAO220-2,批號(hào):Feb-28E)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 MCO-18AC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社),倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司),酶標(biāo)儀(MK3型,美國(guó)Thermo公司),DK-500電熱恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),DK-S22電熱恒溫水鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),BY-G20型醫(yī)用離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司),西門子primus醫(yī)用直線加速器,流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

    1.4 H9c2心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 將H9c2心肌細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.5 細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔板,104個(gè)細(xì)胞/孔,24 h后加入精胺并分為100 μmol/L組、200 μmol/L組、400 μmol/L組,空白對(duì)照組為加等量不含藥物的培養(yǎng)液,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。放置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h后,在每孔內(nèi)加入100 μl含10 μl新型細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)溶液——CCK8溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基,37 ℃下繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的光密度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率=(加藥細(xì)胞OD值/對(duì)照細(xì)胞OD值)×100%,上述所有實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次,取平均值。

    1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為105/孔,接種于6孔板,24 h后分別加入精胺,根據(jù)細(xì)胞存活率的檢驗(yàn)結(jié)果將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、單純輻射組和輻射+100 μmol/L精胺組、輻射+200 μmol/L精胺組,培養(yǎng)24 h,對(duì)單純輻射組和輻射+100 μmol/L精胺組、輻射+200 μmol/L精胺組進(jìn)行X線照射,輻射源為醫(yī)用直線加速器(西門子primus)6 MV X線照射,照射劑量6 Gy,劑量率200 MU/min,輻射視野10 cm×10 cm,用1.5 cm組織等效材料,消除建成區(qū),機(jī)頭轉(zhuǎn)180°,空白對(duì)照組含等量的DMEM高糖培養(yǎng)基且不予X線照射,于照射后0、12、24、48 h進(jìn)行如下操作:胰蛋白酶消化后,收集細(xì)胞,離心棄上清,用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次,細(xì)胞沉淀中加入1×Bing buffer工作液,重懸后吸取細(xì)胞懸液至新管,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)染色液,輕輕混勻。室溫避光孵育15 min,染色孵育后,每管加入400 μl 1×Binding Buffer工作液,混勻后使用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè),Annexin V-FITC為綠色熒光,PI為紅色熒光。細(xì)胞凋亡率=(早期凋亡率+晚期凋亡率)。Annexin V FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)將實(shí)驗(yàn)樣本中正常、壞死、凋亡細(xì)胞區(qū)分開。以FITC和PI熒光做雙參數(shù)點(diǎn)圖,細(xì)胞分為4個(gè)區(qū),1區(qū):機(jī)械損傷細(xì)胞(Annexin V FITC-/PI+);2區(qū):凋亡晚期或壞死細(xì)胞(Annexin V FITC+/PI+);3區(qū):活細(xì)胞(Annexin V FITC-/PI-);4區(qū):早期凋亡細(xì)胞(Annexin V FITC+/PI-)。記錄4個(gè)區(qū)細(xì)胞比例并對(duì)各組不同時(shí)間的凋亡率進(jìn)行比較。

    1.7 MDA、SOD測(cè)定 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞,并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為104/孔,接種于96孔板,24 h后分別加入精胺,處理?xiàng)l件同1.6,參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、SOD。

    1.8 熒光顯微鏡下觀察H9c2心肌細(xì)胞的形態(tài)變化 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為105/孔,接種于6孔板中,24 h后分別加入精胺,處理?xiàng)l件同1.6,然后進(jìn)行如下操作:預(yù)冷PBS溶液洗滌2次,在細(xì)胞中加1×Binding buffer工作液,再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,輕輕混勻,室溫避光孵育15 min后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。使用顯微鏡上的藍(lán)光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結(jié)合的細(xì)胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞,細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色,膜上有綠色光環(huán)。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 心肌細(xì)胞存活率 空白對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。100 μmol/L組、200 μmol/L組、400 μmol/L組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中24 h細(xì)胞存活率高于12、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12 h及48 h細(xì)胞存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處理時(shí)間12 h:四組細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組細(xì)胞存活率高于100 μmol/L組、200 μmol/L組及400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);100 μmol/L組細(xì)胞存活率與200 μmol/L組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);100 μmol/L組、200 μmol/L組細(xì)胞存活率高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間24 h:四組細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組與200 μmol/L組細(xì)胞存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);空白對(duì)照組細(xì)胞存活率高于100 μmol/L組、400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);100 μmol/L組細(xì)胞存活率低于200 μmol/L組,高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);200 μmol/L組細(xì)胞存活率高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間48 h:四組細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組細(xì)胞存活率高于100 μmol/L組、200 μmol/L組及400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);100 μmol/L組細(xì)胞存活率低于200 μmol/L組,高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);200 μmol/L組細(xì)胞存活率高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

    表1 四組不同時(shí)間的細(xì)胞存活率比較(±s,n=3)Table 1 Comparison of cell survival rates in four groups at three different treatment times

    表1 四組不同時(shí)間的細(xì)胞存活率比較(±s,n=3)Table 1 Comparison of cell survival rates in four groups at three different treatment times

    注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與200 μmol/L組比較,bP<0.05;與處理時(shí)間24 h比較,cP<0.05

    組別 12 h 24 h 48 h F值 P值空白對(duì)照組 93.53±1.22 93.44±1.83 91.72±1.28 1.45 0.31 100 μmol/L 組 63.36±2.24abc 80.6±0.79ab 60.34±6.51abc 22.40 <0.01 200 μmol/L 組 69.30±6.25ac 90.16±0.40 75.86±3.95ac 18.51 <0.01 400 μmol/L 組 28.70±2.62abc 42.76±1.30ab 24.30±2.02abc 86.00 <0.01 F值 162.00 115.69 156.70 P值 <0.01 <0.01 <0.01

    2.2 心肌細(xì)胞凋亡率 處理時(shí)間0 h:四組細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組細(xì)胞凋亡率高于單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+200 μmol/L精胺組細(xì)胞凋亡率低于輻射+100 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);處理時(shí)間為12 h組、24 h組、48 h組細(xì)胞凋亡情況同處理時(shí)間為0 h組??瞻讓?duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中0 h細(xì)胞凋亡率低于12 h、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0 h細(xì)胞凋亡率與24 h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);12 h細(xì)胞凋亡率低于24 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12 h細(xì)胞凋亡率與48 h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);24 h細(xì)胞凋亡率低于48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。輻射+200 μmol/L精胺組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中24 h細(xì)胞凋亡率低于0 h、12 h和48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12 h細(xì)胞凋亡率低于0、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24 h細(xì)胞凋亡率低于48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。輻射+100 μmol/L精胺組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中24 h細(xì)胞凋亡率低于0、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24 h細(xì)胞凋亡率與12 h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);12 h細(xì)胞凋亡率低于0、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0 h細(xì)胞凋亡率與48 h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。單純輻射組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中0 h細(xì)胞凋亡率低于12、24、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12 h細(xì)胞凋亡率低于24、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24 h細(xì)胞凋亡率低于48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    表2 四組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=3)Table 2 Comparison of apoptosis rate in four groups at four different treatment times

    表2 四組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=3)Table 2 Comparison of apoptosis rate in four groups at four different treatment times

    注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與單純輻射組比較,bP<0.05;與輻射+100 μmol/L組比較,cP<0.05

    組別 0 h 12 h 24 h 48 h F值 P值空白對(duì)照組 0.075±0.014 0.116±0.006 0.094±0.009 0.136±0.013 17.44 <0.01輻射 +200 μmol/L 精胺組 0.224±0.003abc 0.160±0.013abc 0.131±0.004abc 0.200±0.025abc 17.44 <0.01輻射 +100 μmol/L 精胺組 0.262±0.022ab 0.187±0.016ab 0.158±0.010ab 0.236±0.027ab 16.37 <0.01單純輻射組 0.187±0.003a 0.312±0.014a 0.362±0.009a 0.425±0.034a 86.42 <0.01 F值 111.03 129.34 603.87 69.26 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

    2.3 MDA水平及SOD活性 處理時(shí)間為12 h時(shí):四組MDA水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組MDA水平低于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組MDA水平低于輻射+100 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組與輻射+200 μmol/L精胺組MDA水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);輻射+100 μmol/L精胺組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間為24 h時(shí):四組MDA水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組MDA水平低于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組MDA水平與輻射+100 μmol/L精胺組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);單純輻射組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間為48 h時(shí):四組MDA水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組MDA水平低于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組MDA水平與輻射+100 μmol/L精胺組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);單純輻射組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    處理時(shí)間為12 h時(shí):4組SOD活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組SOD活性高于輻射+100 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間為24 h時(shí):四組SOD活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組SOD活性低于輻射+100 μmol/L精胺組、輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間為48 h時(shí):4組SOD活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組SOD活性與輻射+100 μmol/L精胺組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);單純輻射組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

    表3 四組不同時(shí)間SOD、MDA比較(±s,n=3)Table 3 Comparison of SOD and MDA levels in four groups at three different treatment times

    表3 四組不同時(shí)間SOD、MDA比較(±s,n=3)Table 3 Comparison of SOD and MDA levels in four groups at three different treatment times

    注:SOD=超氧化物歧化酶,MDA=丙二醛;與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與單純輻射組比較,bP<0.05;與輻射+100 μmol/L組比較,cP<0.05

    組別 12 h 24 h 48 h SOD(U/g) MDA(nmol/mg) SOD(U/g) MDA(nmol/mg) SOD(U/g) MDA(nmol/mg)空白對(duì)照組 29.653±0.839 19.328±0.718 29.292±0.623 20.286±0.378 29.657±1.084 20.656±0.804單純輻射組 20.770±0.503a 23.800±0.425a 19.544±0.578a 25.770±0.721a 17.609±1.330a 32.552±1.260a輻射 +100 μmol/L 19.025±0.652ab 28.894±1.073ab 22.717±0.772ab 25.728±0.735a 17.316±0.572a 31.148±0.485a輻射 +200 μmol/L 24.427±1.142abc 23.319±1.795ac 27.048±0.796abc 20.868±0.267abc 20.552±1.221abc 27.871±1.874abc F值 23.47 23.84 24.65 23.16 21.28 28.06 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 0.05

    2.4 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化 給予X線照射24 h后,空白對(duì)照組H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞核形態(tài)完整,染色均勻;B為輻射+200 μmol/L精胺組、C為輻射+100 μmol/L精胺組、D為單純輻射組的H9c2心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變化,如細(xì)胞形態(tài)變圓,細(xì)胞核碎裂,染色不均勻等,其中200 μmol/L精胺組的細(xì)胞形態(tài)最接近空白對(duì)照組細(xì)胞,變化程度較輕,見圖1。

    圖1 各組細(xì)胞雙染熒光圖(×200)Figure 1 Morphology of cells stained with double immunofluorescence in four groups

    3 討論

    放射治療被越來(lái)越多地應(yīng)用到惡性腫瘤的治療中,并且成了治療惡性腫瘤的重要方式。但在治療過(guò)程中,由于射線沒有精確的選擇性,在通過(guò)一系列物理、化學(xué)甚至生物過(guò)程作用于腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致其死亡的同時(shí)也會(huì)對(duì)腫瘤周圍正常組織細(xì)胞造成損傷甚至凋亡,引起病變周圍、病變以外的器官和組織的放射損傷,產(chǎn)生各種放療并發(fā)癥和毒副作用,即靶外放射損傷。惡性腫瘤的治愈率不斷提高,隨著腫瘤患者的遠(yuǎn)期生存時(shí)間不斷延長(zhǎng),對(duì)腫瘤患者的關(guān)注由延長(zhǎng)患者的生存期向患者的遠(yuǎn)期生活質(zhì)量上傾斜,由放射治療導(dǎo)致的靶外器官的放射損傷開始成為醫(yī)學(xué)上亟待解決的問(wèn)題。

    精胺(天然多胺的一種)是一類帶高密度正電荷的脂肪族的小分子化合物,主要參與多胺的代謝,具有調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡的功能,在調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)、維持核酸、基因表達(dá)和離子通道的穩(wěn)定性等方面也具有重要作用[5]。精胺普遍存在于人體細(xì)胞中,其代謝異常會(huì)導(dǎo)致一些細(xì)胞的病理變化[6-7],影響多種疾病的演變[8-11]。在活細(xì)胞內(nèi),外源性精胺可以通過(guò)拮抗氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)自噬等途徑保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[12-15]。放射線作用于心肌細(xì)胞可產(chǎn)生大量的自由基[16],從而觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[17],導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。有研究表明,外源性精胺可通過(guò)降低輻射誘導(dǎo)的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物,來(lái)增強(qiáng)對(duì)DNA的保護(hù),從而減少輻射給細(xì)胞帶來(lái)的氧化損傷[18]。也有研究表明,精胺可以減弱P38/JNK等激酶的磷酸化形式表達(dá),從而減少ROS積累和降低氧化應(yīng)激反應(yīng)[19],進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡。精胺是否可以保護(hù)正常心肌細(xì)胞免受或降低輻射所致氧化損傷,目前相關(guān)報(bào)道甚少。

    本研究結(jié)果顯示,精胺對(duì)心肌細(xì)胞具有放射防護(hù)作用。對(duì)于正常細(xì)胞,精胺濃度可影響細(xì)胞的代謝過(guò)程,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同作用。不同濃度的外源性精胺亦會(huì)產(chǎn)生不同的效應(yīng),如血管環(huán)收縮、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、心肌細(xì)胞保護(hù)或損傷等生理或病理變化[20]。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,精胺濃度為200 μmol/L且處理時(shí)間為24 h時(shí),心肌細(xì)胞的存活率達(dá)到90%以上,與空白對(duì)照組相比心肌細(xì)胞的存活率無(wú)明顯差異,可知200 μmol/L是心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的安全藥物濃度?;诰窛舛?00 μmol/L是細(xì)胞的安全藥物濃度,100 μmol/L組細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組及200 μmol/L組低,但24 h時(shí)也達(dá)到了80.6%,而精胺濃度為400 μmol/L時(shí)心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重,12 h及48 h時(shí)存活率不到30%,即使在24 h時(shí)存活率也僅有42.8%。以上結(jié)果說(shuō)明,不同濃度的外源性精胺對(duì)心肌細(xì)胞的效應(yīng)是不同的,而且作用的時(shí)間不同效應(yīng)也不同。因此為探究不同濃度外源性精胺對(duì)輻射損傷心肌細(xì)胞的作用,在后續(xù)試驗(yàn)中選用精胺藥物濃度為100 μmol/L 和 200 μmol/L。

    細(xì)胞凋亡是受到嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞死亡方式,相關(guān)研究證實(shí)細(xì)胞凋亡的異常對(duì)心血管疾病的發(fā)生具有重要影響[21]。本研究結(jié)果顯示,X線照射對(duì)于H9c2心肌細(xì)胞具有明確的損傷作用,精胺處理細(xì)胞后其凋亡率顯著降低,輻射防護(hù)作用與濃度及時(shí)間有關(guān)。濃度為200 μmol/L精胺處理組的細(xì)胞凋亡率較100 μmol/L精胺處理組低。不同精胺濃度處理的細(xì)胞凋亡率均在24 h達(dá)到最低,24 h后細(xì)胞凋亡率增高,可能與時(shí)間有關(guān)。精胺對(duì)于輻射損傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的影響有關(guān)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道提示,精胺可通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)基因的表達(dá),下調(diào) Bax、 Caspase-3、Caspase-9等細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶的表達(dá),來(lái)降低各種病理因素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的凋亡[22-23],但精胺對(duì)輻射所致氧化損傷心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

    自由基和活性氧是電離輻射重要產(chǎn)物,而氧化應(yīng)激在輻射損傷的發(fā)生中起重要作用[24]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物,MDA水平的高低可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化速率和程度,也能間接反映出細(xì)胞過(guò)氧化損傷的程度。SOD是機(jī)體的抗氧化酶,對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用,能清除超氧陰離子自由基(O2-)、保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD活力高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力,而MDA水平的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。在本研究中,輻射+200 μmol/L組SOD活力明顯下降,而MDA水平顯著升高,其作用效果可能與精胺能夠抑制自由基的產(chǎn)生、脂質(zhì)過(guò)氧化,提高內(nèi)源性抗氧化酶的活力,阻止活性氧對(duì)細(xì)胞膜的損傷,同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)鈉鉀泵活力、降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載等機(jī)制有關(guān)[25-26]。

    熒光顯微鏡以核碎裂、核濃縮為凋亡特征定性觀察細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示,空白對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整,染色均勻;在X線處理24 h時(shí),單純輻射組細(xì)胞可見明顯的細(xì)胞核濃縮及碎裂、染色質(zhì)染色不均。200 μmol/L精胺處理后的心肌細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)較規(guī)整、部分碎裂,染色較均勻,其細(xì)胞形態(tài)比100 μmol/L精胺處理組的細(xì)胞更接近正常細(xì)胞。

    綜上所述,精胺對(duì)心肌細(xì)胞的輻射損傷具有保護(hù)作用,其保護(hù)作用與藥物作用時(shí)間及濃度有關(guān)。其保護(hù)作用可能與精胺影響細(xì)胞凋亡過(guò)程、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化程度、提高內(nèi)源性抗氧化酶的活力、減輕活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷等機(jī)制相關(guān)。

    本實(shí)驗(yàn)僅觀察了一定濃度的精胺對(duì)輻射致?lián)p傷的心肌細(xì)胞存在保護(hù)作用,但未探究其中具體保護(hù)機(jī)制,也未對(duì)其他正常組織細(xì)胞進(jìn)行觀察,但為對(duì)正常細(xì)胞的輻射防護(hù)提供了新思路,后期將進(jìn)行進(jìn)一步探索。

    作者貢獻(xiàn):許超進(jìn)行論文的構(gòu)思與設(shè)計(jì),文章的可行性分析;杜霄負(fù)責(zé)文獻(xiàn)/資料收集、數(shù)據(jù)整理、論文撰寫;涂彧負(fù)責(zé)論文的修訂,英文的修訂;周菊英負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校,對(duì)文章整體負(fù)責(zé),監(jiān)督管理。

    本文無(wú)利益沖突。

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