• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    精胺對(duì)輻射所致氧化損傷H9c2心肌細(xì)胞的影響研究

    2021-09-16 08:17:18杜霄許超涂彧周菊英
    中國(guó)全科醫(yī)學(xué) 2021年29期
    關(guān)鍵詞:精胺存活率空白對(duì)照

    杜霄,許超,涂彧,周菊英*

    機(jī)體的電離輻射損傷一直是放療科醫(yī)生非常關(guān)注的問(wèn)題。輻射可直接作用于細(xì)胞關(guān)鍵靶點(diǎn),導(dǎo)致DNA單鏈或者雙鏈發(fā)生斷裂;亦可作用于水分子,產(chǎn)生大量自由基,直接攻擊細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)的DNA,造成DNA的間接損傷,引發(fā)不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)而使細(xì)胞膜損傷、各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、酶活性降低和消失,如何避免或者減少這種損傷是目前研究的重點(diǎn)。精胺是一類廣泛分布的多胺,具有抗氧化、抗衰老、抗癌、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以及維持細(xì)胞膜、核酸和離子通道等細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的功能[1-3]。有研究表明,外源性精胺可使大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)收縮,并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性[4];細(xì)胞內(nèi)精胺濃度變化可影響細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。目前,精胺和放射導(dǎo)致的心肌氧化損傷之間的關(guān)系并不明確,相關(guān)研究甚少。因此本研究旨在探討精胺類藥物對(duì)輻射所致氧化損傷的心肌細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。

    1 材料與方法

    1.1 研究時(shí)間 2018年12月至2020年12月。

    1.2 實(shí)驗(yàn)材料 spermine(美國(guó)sigma公司),H9c2細(xì)胞系(中科院上海細(xì)胞庫(kù)),DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)corning公司),新生胎牛血清(美國(guó)gibco公司),胰蛋白酶(美國(guó)gibco公司),青霉素-鏈霉素溶液(上海碧云天科技有限公司),PBS(上海源培生物科技有限公司),CCK8試劑盒(日本同仁公司),超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(南京建成生物工程研究所,貨號(hào):A001-1-1,生產(chǎn)批號(hào):20190628),丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物研究所,貨號(hào):A003-1-1,生產(chǎn)批號(hào):20190629),Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(大連美倫生物技術(shù)有限公司:100T,貨號(hào):MAO220-2,批號(hào):Feb-28E)。

    1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 MCO-18AC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社),倒置熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司),酶標(biāo)儀(MK3型,美國(guó)Thermo公司),DK-500電熱恒溫水浴箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),DK-S22電熱恒溫水鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司),BY-G20型醫(yī)用離心機(jī)(北京白洋醫(yī)療器械有限公司),西門子primus醫(yī)用直線加速器,流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

    1.4 H9c2心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 將H9c2心肌細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液,37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.5 細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔板,104個(gè)細(xì)胞/孔,24 h后加入精胺并分為100 μmol/L組、200 μmol/L組、400 μmol/L組,空白對(duì)照組為加等量不含藥物的培養(yǎng)液,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。放置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h后,在每孔內(nèi)加入100 μl含10 μl新型細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)溶液——CCK8溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基,37 ℃下繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h,于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的光密度(OD)值,計(jì)算細(xì)胞存活率,細(xì)胞存活率=(加藥細(xì)胞OD值/對(duì)照細(xì)胞OD值)×100%,上述所有實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次,取平均值。

    1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為105/孔,接種于6孔板,24 h后分別加入精胺,根據(jù)細(xì)胞存活率的檢驗(yàn)結(jié)果將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、單純輻射組和輻射+100 μmol/L精胺組、輻射+200 μmol/L精胺組,培養(yǎng)24 h,對(duì)單純輻射組和輻射+100 μmol/L精胺組、輻射+200 μmol/L精胺組進(jìn)行X線照射,輻射源為醫(yī)用直線加速器(西門子primus)6 MV X線照射,照射劑量6 Gy,劑量率200 MU/min,輻射視野10 cm×10 cm,用1.5 cm組織等效材料,消除建成區(qū),機(jī)頭轉(zhuǎn)180°,空白對(duì)照組含等量的DMEM高糖培養(yǎng)基且不予X線照射,于照射后0、12、24、48 h進(jìn)行如下操作:胰蛋白酶消化后,收集細(xì)胞,離心棄上清,用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次,細(xì)胞沉淀中加入1×Bing buffer工作液,重懸后吸取細(xì)胞懸液至新管,加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶(PI)染色液,輕輕混勻。室溫避光孵育15 min,染色孵育后,每管加入400 μl 1×Binding Buffer工作液,混勻后使用流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)檢測(cè),Annexin V-FITC為綠色熒光,PI為紅色熒光。細(xì)胞凋亡率=(早期凋亡率+晚期凋亡率)。Annexin V FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)將實(shí)驗(yàn)樣本中正常、壞死、凋亡細(xì)胞區(qū)分開。以FITC和PI熒光做雙參數(shù)點(diǎn)圖,細(xì)胞分為4個(gè)區(qū),1區(qū):機(jī)械損傷細(xì)胞(Annexin V FITC-/PI+);2區(qū):凋亡晚期或壞死細(xì)胞(Annexin V FITC+/PI+);3區(qū):活細(xì)胞(Annexin V FITC-/PI-);4區(qū):早期凋亡細(xì)胞(Annexin V FITC+/PI-)。記錄4個(gè)區(qū)細(xì)胞比例并對(duì)各組不同時(shí)間的凋亡率進(jìn)行比較。

    1.7 MDA、SOD測(cè)定 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞,并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為104/孔,接種于96孔板,24 h后分別加入精胺,處理?xiàng)l件同1.6,參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、SOD。

    1.8 熒光顯微鏡下觀察H9c2心肌細(xì)胞的形態(tài)變化 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為105/孔,接種于6孔板中,24 h后分別加入精胺,處理?xiàng)l件同1.6,然后進(jìn)行如下操作:預(yù)冷PBS溶液洗滌2次,在細(xì)胞中加1×Binding buffer工作液,再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI,輕輕混勻,室溫避光孵育15 min后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。使用顯微鏡上的藍(lán)光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結(jié)合的細(xì)胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞,細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色,膜上有綠色光環(huán)。

    1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以(±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 心肌細(xì)胞存活率 空白對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。100 μmol/L組、200 μmol/L組、400 μmol/L組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中24 h細(xì)胞存活率高于12、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12 h及48 h細(xì)胞存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。處理時(shí)間12 h:四組細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組細(xì)胞存活率高于100 μmol/L組、200 μmol/L組及400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);100 μmol/L組細(xì)胞存活率與200 μmol/L組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);100 μmol/L組、200 μmol/L組細(xì)胞存活率高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間24 h:四組細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組與200 μmol/L組細(xì)胞存活率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);空白對(duì)照組細(xì)胞存活率高于100 μmol/L組、400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);100 μmol/L組細(xì)胞存活率低于200 μmol/L組,高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);200 μmol/L組細(xì)胞存活率高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間48 h:四組細(xì)胞存活率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組細(xì)胞存活率高于100 μmol/L組、200 μmol/L組及400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);100 μmol/L組細(xì)胞存活率低于200 μmol/L組,高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);200 μmol/L組細(xì)胞存活率高于400 μmol/L組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

    表1 四組不同時(shí)間的細(xì)胞存活率比較(±s,n=3)Table 1 Comparison of cell survival rates in four groups at three different treatment times

    表1 四組不同時(shí)間的細(xì)胞存活率比較(±s,n=3)Table 1 Comparison of cell survival rates in four groups at three different treatment times

    注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與200 μmol/L組比較,bP<0.05;與處理時(shí)間24 h比較,cP<0.05

    組別 12 h 24 h 48 h F值 P值空白對(duì)照組 93.53±1.22 93.44±1.83 91.72±1.28 1.45 0.31 100 μmol/L 組 63.36±2.24abc 80.6±0.79ab 60.34±6.51abc 22.40 <0.01 200 μmol/L 組 69.30±6.25ac 90.16±0.40 75.86±3.95ac 18.51 <0.01 400 μmol/L 組 28.70±2.62abc 42.76±1.30ab 24.30±2.02abc 86.00 <0.01 F值 162.00 115.69 156.70 P值 <0.01 <0.01 <0.01

    2.2 心肌細(xì)胞凋亡率 處理時(shí)間0 h:四組細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組細(xì)胞凋亡率高于單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+200 μmol/L精胺組細(xì)胞凋亡率低于輻射+100 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);處理時(shí)間為12 h組、24 h組、48 h組細(xì)胞凋亡情況同處理時(shí)間為0 h組??瞻讓?duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中0 h細(xì)胞凋亡率低于12 h、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0 h細(xì)胞凋亡率與24 h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);12 h細(xì)胞凋亡率低于24 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12 h細(xì)胞凋亡率與48 h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);24 h細(xì)胞凋亡率低于48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。輻射+200 μmol/L精胺組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中24 h細(xì)胞凋亡率低于0 h、12 h和48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12 h細(xì)胞凋亡率低于0、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24 h細(xì)胞凋亡率低于48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。輻射+100 μmol/L精胺組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中24 h細(xì)胞凋亡率低于0、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24 h細(xì)胞凋亡率與12 h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);12 h細(xì)胞凋亡率低于0、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);0 h細(xì)胞凋亡率與48 h比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。單純輻射組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其中0 h細(xì)胞凋亡率低于12、24、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);12 h細(xì)胞凋亡率低于24、48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);24 h細(xì)胞凋亡率低于48 h,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

    表2 四組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=3)Table 2 Comparison of apoptosis rate in four groups at four different treatment times

    表2 四組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率比較(±s,n=3)Table 2 Comparison of apoptosis rate in four groups at four different treatment times

    注:與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與單純輻射組比較,bP<0.05;與輻射+100 μmol/L組比較,cP<0.05

    組別 0 h 12 h 24 h 48 h F值 P值空白對(duì)照組 0.075±0.014 0.116±0.006 0.094±0.009 0.136±0.013 17.44 <0.01輻射 +200 μmol/L 精胺組 0.224±0.003abc 0.160±0.013abc 0.131±0.004abc 0.200±0.025abc 17.44 <0.01輻射 +100 μmol/L 精胺組 0.262±0.022ab 0.187±0.016ab 0.158±0.010ab 0.236±0.027ab 16.37 <0.01單純輻射組 0.187±0.003a 0.312±0.014a 0.362±0.009a 0.425±0.034a 86.42 <0.01 F值 111.03 129.34 603.87 69.26 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

    2.3 MDA水平及SOD活性 處理時(shí)間為12 h時(shí):四組MDA水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組MDA水平低于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組MDA水平低于輻射+100 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組與輻射+200 μmol/L精胺組MDA水平比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);輻射+100 μmol/L精胺組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間為24 h時(shí):四組MDA水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組MDA水平低于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組MDA水平與輻射+100 μmol/L精胺組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);單純輻射組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間為48 h時(shí):四組MDA水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組MDA水平低于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組MDA水平與輻射+100 μmol/L精胺組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);單純輻射組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

    處理時(shí)間為12 h時(shí):4組SOD活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組SOD活性高于輻射+100 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間為24 h時(shí):四組SOD活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組SOD活性低于輻射+100 μmol/L精胺組、輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。處理時(shí)間為48 h時(shí):4組SOD活性比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);空白對(duì)照組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);單純輻射組SOD活性與輻射+100 μmol/L精胺組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);單純輻射組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);輻射+100 μmol/L精胺組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

    表3 四組不同時(shí)間SOD、MDA比較(±s,n=3)Table 3 Comparison of SOD and MDA levels in four groups at three different treatment times

    表3 四組不同時(shí)間SOD、MDA比較(±s,n=3)Table 3 Comparison of SOD and MDA levels in four groups at three different treatment times

    注:SOD=超氧化物歧化酶,MDA=丙二醛;與空白對(duì)照組比較,aP<0.05;與單純輻射組比較,bP<0.05;與輻射+100 μmol/L組比較,cP<0.05

    組別 12 h 24 h 48 h SOD(U/g) MDA(nmol/mg) SOD(U/g) MDA(nmol/mg) SOD(U/g) MDA(nmol/mg)空白對(duì)照組 29.653±0.839 19.328±0.718 29.292±0.623 20.286±0.378 29.657±1.084 20.656±0.804單純輻射組 20.770±0.503a 23.800±0.425a 19.544±0.578a 25.770±0.721a 17.609±1.330a 32.552±1.260a輻射 +100 μmol/L 19.025±0.652ab 28.894±1.073ab 22.717±0.772ab 25.728±0.735a 17.316±0.572a 31.148±0.485a輻射 +200 μmol/L 24.427±1.142abc 23.319±1.795ac 27.048±0.796abc 20.868±0.267abc 20.552±1.221abc 27.871±1.874abc F值 23.47 23.84 24.65 23.16 21.28 28.06 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 0.05

    2.4 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化 給予X線照射24 h后,空白對(duì)照組H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞核形態(tài)完整,染色均勻;B為輻射+200 μmol/L精胺組、C為輻射+100 μmol/L精胺組、D為單純輻射組的H9c2心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變化,如細(xì)胞形態(tài)變圓,細(xì)胞核碎裂,染色不均勻等,其中200 μmol/L精胺組的細(xì)胞形態(tài)最接近空白對(duì)照組細(xì)胞,變化程度較輕,見圖1。

    圖1 各組細(xì)胞雙染熒光圖(×200)Figure 1 Morphology of cells stained with double immunofluorescence in four groups

    3 討論

    放射治療被越來(lái)越多地應(yīng)用到惡性腫瘤的治療中,并且成了治療惡性腫瘤的重要方式。但在治療過(guò)程中,由于射線沒有精確的選擇性,在通過(guò)一系列物理、化學(xué)甚至生物過(guò)程作用于腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致其死亡的同時(shí)也會(huì)對(duì)腫瘤周圍正常組織細(xì)胞造成損傷甚至凋亡,引起病變周圍、病變以外的器官和組織的放射損傷,產(chǎn)生各種放療并發(fā)癥和毒副作用,即靶外放射損傷。惡性腫瘤的治愈率不斷提高,隨著腫瘤患者的遠(yuǎn)期生存時(shí)間不斷延長(zhǎng),對(duì)腫瘤患者的關(guān)注由延長(zhǎng)患者的生存期向患者的遠(yuǎn)期生活質(zhì)量上傾斜,由放射治療導(dǎo)致的靶外器官的放射損傷開始成為醫(yī)學(xué)上亟待解決的問(wèn)題。

    精胺(天然多胺的一種)是一類帶高密度正電荷的脂肪族的小分子化合物,主要參與多胺的代謝,具有調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡的功能,在調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)、維持核酸、基因表達(dá)和離子通道的穩(wěn)定性等方面也具有重要作用[5]。精胺普遍存在于人體細(xì)胞中,其代謝異常會(huì)導(dǎo)致一些細(xì)胞的病理變化[6-7],影響多種疾病的演變[8-11]。在活細(xì)胞內(nèi),外源性精胺可以通過(guò)拮抗氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)自噬等途徑保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[12-15]。放射線作用于心肌細(xì)胞可產(chǎn)生大量的自由基[16],從而觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)[17],導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。有研究表明,外源性精胺可通過(guò)降低輻射誘導(dǎo)的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物,來(lái)增強(qiáng)對(duì)DNA的保護(hù),從而減少輻射給細(xì)胞帶來(lái)的氧化損傷[18]。也有研究表明,精胺可以減弱P38/JNK等激酶的磷酸化形式表達(dá),從而減少ROS積累和降低氧化應(yīng)激反應(yīng)[19],進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡。精胺是否可以保護(hù)正常心肌細(xì)胞免受或降低輻射所致氧化損傷,目前相關(guān)報(bào)道甚少。

    本研究結(jié)果顯示,精胺對(duì)心肌細(xì)胞具有放射防護(hù)作用。對(duì)于正常細(xì)胞,精胺濃度可影響細(xì)胞的代謝過(guò)程,對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同作用。不同濃度的外源性精胺亦會(huì)產(chǎn)生不同的效應(yīng),如血管環(huán)收縮、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、心肌細(xì)胞保護(hù)或損傷等生理或病理變化[20]。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,精胺濃度為200 μmol/L且處理時(shí)間為24 h時(shí),心肌細(xì)胞的存活率達(dá)到90%以上,與空白對(duì)照組相比心肌細(xì)胞的存活率無(wú)明顯差異,可知200 μmol/L是心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的安全藥物濃度?;诰窛舛?00 μmol/L是細(xì)胞的安全藥物濃度,100 μmol/L組細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組及200 μmol/L組低,但24 h時(shí)也達(dá)到了80.6%,而精胺濃度為400 μmol/L時(shí)心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重,12 h及48 h時(shí)存活率不到30%,即使在24 h時(shí)存活率也僅有42.8%。以上結(jié)果說(shuō)明,不同濃度的外源性精胺對(duì)心肌細(xì)胞的效應(yīng)是不同的,而且作用的時(shí)間不同效應(yīng)也不同。因此為探究不同濃度外源性精胺對(duì)輻射損傷心肌細(xì)胞的作用,在后續(xù)試驗(yàn)中選用精胺藥物濃度為100 μmol/L 和 200 μmol/L。

    細(xì)胞凋亡是受到嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞死亡方式,相關(guān)研究證實(shí)細(xì)胞凋亡的異常對(duì)心血管疾病的發(fā)生具有重要影響[21]。本研究結(jié)果顯示,X線照射對(duì)于H9c2心肌細(xì)胞具有明確的損傷作用,精胺處理細(xì)胞后其凋亡率顯著降低,輻射防護(hù)作用與濃度及時(shí)間有關(guān)。濃度為200 μmol/L精胺處理組的細(xì)胞凋亡率較100 μmol/L精胺處理組低。不同精胺濃度處理的細(xì)胞凋亡率均在24 h達(dá)到最低,24 h后細(xì)胞凋亡率增高,可能與時(shí)間有關(guān)。精胺對(duì)于輻射損傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的影響有關(guān)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道提示,精胺可通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)基因的表達(dá),下調(diào) Bax、 Caspase-3、Caspase-9等細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶的表達(dá),來(lái)降低各種病理因素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的凋亡[22-23],但精胺對(duì)輻射所致氧化損傷心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

    自由基和活性氧是電離輻射重要產(chǎn)物,而氧化應(yīng)激在輻射損傷的發(fā)生中起重要作用[24]。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物,MDA水平的高低可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化速率和程度,也能間接反映出細(xì)胞過(guò)氧化損傷的程度。SOD是機(jī)體的抗氧化酶,對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用,能清除超氧陰離子自由基(O2-)、保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD活力高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力,而MDA水平的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。在本研究中,輻射+200 μmol/L組SOD活力明顯下降,而MDA水平顯著升高,其作用效果可能與精胺能夠抑制自由基的產(chǎn)生、脂質(zhì)過(guò)氧化,提高內(nèi)源性抗氧化酶的活力,阻止活性氧對(duì)細(xì)胞膜的損傷,同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)鈉鉀泵活力、降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載等機(jī)制有關(guān)[25-26]。

    熒光顯微鏡以核碎裂、核濃縮為凋亡特征定性觀察細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示,空白對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整,染色均勻;在X線處理24 h時(shí),單純輻射組細(xì)胞可見明顯的細(xì)胞核濃縮及碎裂、染色質(zhì)染色不均。200 μmol/L精胺處理后的心肌細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)較規(guī)整、部分碎裂,染色較均勻,其細(xì)胞形態(tài)比100 μmol/L精胺處理組的細(xì)胞更接近正常細(xì)胞。

    綜上所述,精胺對(duì)心肌細(xì)胞的輻射損傷具有保護(hù)作用,其保護(hù)作用與藥物作用時(shí)間及濃度有關(guān)。其保護(hù)作用可能與精胺影響細(xì)胞凋亡過(guò)程、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化程度、提高內(nèi)源性抗氧化酶的活力、減輕活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷等機(jī)制相關(guān)。

    本實(shí)驗(yàn)僅觀察了一定濃度的精胺對(duì)輻射致?lián)p傷的心肌細(xì)胞存在保護(hù)作用,但未探究其中具體保護(hù)機(jī)制,也未對(duì)其他正常組織細(xì)胞進(jìn)行觀察,但為對(duì)正常細(xì)胞的輻射防護(hù)提供了新思路,后期將進(jìn)行進(jìn)一步探索。

    作者貢獻(xiàn):許超進(jìn)行論文的構(gòu)思與設(shè)計(jì),文章的可行性分析;杜霄負(fù)責(zé)文獻(xiàn)/資料收集、數(shù)據(jù)整理、論文撰寫;涂彧負(fù)責(zé)論文的修訂,英文的修訂;周菊英負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校,對(duì)文章整體負(fù)責(zé),監(jiān)督管理。

    本文無(wú)利益沖突。

    猜你喜歡
    精胺存活率空白對(duì)照
    園林綠化施工中如何提高植樹存活率
    例析陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照在高中生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    損耗率高達(dá)30%,保命就是保收益!這條70萬(wàn)噸的魚要如何破存活率困局?
    水產(chǎn)小白養(yǎng)蛙2年,10畝塘預(yù)計(jì)年產(chǎn)3.5萬(wàn)斤,畝純利15000元!存活率90%,他是怎樣做到的?
    過(guò)表達(dá)H3K9me3去甲基化酶對(duì)豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內(nèi)文第 96 ~ 101 頁(yè))圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    腹腔注射亞精胺對(duì)小鼠卵巢組織多胺含量及代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響
    8 種外源激素對(duì)當(dāng)歸抽薹及產(chǎn)量的影響
    外源精胺對(duì)斷奶仔豬血液精胺含量、臟器發(fā)育和生產(chǎn)性能的影響
    Alice臺(tái)風(fēng)對(duì)東海鮐魚魚卵仔魚的輸運(yùn)和存活率的影響
    亚洲精品日韩在线中文字幕| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 99久久精品一区二区三区| 亚洲在久久综合| 日本黄大片高清| 久久99热这里只有精品18| 18禁在线播放成人免费| 99热6这里只有精品| 联通29元200g的流量卡| 边亲边吃奶的免费视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产淫片久久久久久久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 九草在线视频观看| 亚洲熟女精品中文字幕| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产精品一二三区在线看| 少妇的逼水好多| 1000部很黄的大片| 高清日韩中文字幕在线| 99久久精品国产国产毛片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 黄色一级大片看看| 久久久成人免费电影| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美3d第一页| 看免费成人av毛片| 视频区图区小说| 黄色怎么调成土黄色| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 一级爰片在线观看| 成人毛片60女人毛片免费| 日韩大片免费观看网站| 一级毛片我不卡| 老熟女久久久| 三级经典国产精品| 99久久精品热视频| 中文字幕精品免费在线观看视频 | 九色成人免费人妻av| 一本久久精品| 亚洲不卡免费看| 伊人久久精品亚洲午夜| 五月伊人婷婷丁香| 一区二区三区四区激情视频| 欧美极品一区二区三区四区| 高清视频免费观看一区二区| 欧美精品一区二区免费开放| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 51国产日韩欧美| 国产免费又黄又爽又色| 永久网站在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久亚洲国产成人精品v| 久久99精品国语久久久| 亚洲精品久久午夜乱码| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 色综合色国产| 亚州av有码| 久久国内精品自在自线图片| 精品久久久噜噜| 国产精品一区二区性色av| 国产成人精品婷婷| 麻豆乱淫一区二区| 亚洲国产日韩一区二区| 精品一区二区免费观看| 成年人午夜在线观看视频| 美女中出高潮动态图| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 深爱激情五月婷婷| 国产爽快片一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 久久久成人免费电影| 午夜老司机福利剧场| av在线app专区| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 99热这里只有精品一区| 精品熟女少妇av免费看| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 日韩国内少妇激情av| 少妇丰满av| 美女福利国产在线 | 久热久热在线精品观看| 国产探花极品一区二区| 少妇人妻久久综合中文| av女优亚洲男人天堂| 亚洲三级黄色毛片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 久久久久人妻精品一区果冻| 妹子高潮喷水视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 97超视频在线观看视频| 99热6这里只有精品| 91狼人影院| freevideosex欧美| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久久久久九九精品二区国产| 成人特级av手机在线观看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 中文欧美无线码| 午夜免费鲁丝| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美xxⅹ黑人| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 婷婷色av中文字幕| 全区人妻精品视频| 国产亚洲91精品色在线| 热re99久久精品国产66热6| 国产在线免费精品| 在线观看三级黄色| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产精品.久久久| 色吧在线观看| 日韩一区二区三区影片| 成人亚洲欧美一区二区av| 日日撸夜夜添| 国产乱来视频区| 亚洲,欧美,日韩| av国产免费在线观看| 大片免费播放器 马上看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久亚洲精品成人影院| 中国国产av一级| 纯流量卡能插随身wifi吗| 老司机影院毛片| 亚州av有码| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲久久久国产精品| 视频区图区小说| 我要看黄色一级片免费的| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久亚洲精品成人影院| 欧美一区二区亚洲| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美成人一区二区免费高清观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 国产一区二区三区av在线| av卡一久久| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产爱豆传媒在线观看| 国产成人免费无遮挡视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 91久久精品电影网| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 久久久a久久爽久久v久久| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 观看美女的网站| 亚洲精品一区蜜桃| 1000部很黄的大片| 国产精品久久久久久av不卡| 午夜视频国产福利| 国内揄拍国产精品人妻在线| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲欧洲国产日韩| 韩国av在线不卡| 国产在线免费精品| 欧美国产精品一级二级三级 | 女人久久www免费人成看片| 亚洲精品色激情综合| 少妇熟女欧美另类| 色网站视频免费| 免费av中文字幕在线| 久热久热在线精品观看| 亚洲av欧美aⅴ国产| 青青草视频在线视频观看| 又爽又黄a免费视频| 欧美精品一区二区大全| 美女福利国产在线 | 高清日韩中文字幕在线| 亚洲精品456在线播放app| 国产精品久久久久久久电影| 深爱激情五月婷婷| 精品一区二区三卡| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品99久久久久久久久| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 国产精品国产三级专区第一集| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 日韩视频在线欧美| 亚洲怡红院男人天堂| 国产美女午夜福利| 全区人妻精品视频| 91久久精品国产一区二区成人| 国产一区有黄有色的免费视频| 午夜福利在线在线| 一本一本综合久久| 久久女婷五月综合色啪小说| 我要看日韩黄色一级片| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 深夜a级毛片| 亚洲av免费高清在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 国产精品欧美亚洲77777| 中文字幕制服av| 91久久精品电影网| 一本久久精品| 国产精品.久久久| 有码 亚洲区| 亚洲国产成人一精品久久久| 蜜臀久久99精品久久宅男| 久久午夜福利片| 亚洲人成网站在线观看播放| 精品午夜福利在线看| 热re99久久精品国产66热6| av.在线天堂| 日韩成人av中文字幕在线观看| 久久久a久久爽久久v久久| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲国产日韩一区二区| 成人漫画全彩无遮挡| 一个人免费看片子| 视频区图区小说| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 久久久久久久久久人人人人人人| 国产高清有码在线观看视频| 国产成人午夜福利电影在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 久久精品国产亚洲av天美| 久久精品人妻少妇| 能在线免费看毛片的网站| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 色吧在线观看| 欧美 日韩 精品 国产| 亚洲欧美一区二区三区国产| 亚洲经典国产精华液单| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 国产高清三级在线| 精品国产三级普通话版| 干丝袜人妻中文字幕| 国产免费福利视频在线观看| 好男人视频免费观看在线| 亚洲国产精品999| av又黄又爽大尺度在线免费看| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久久久成人免费电影| 99热6这里只有精品| 国产精品久久久久久久电影| 男男h啪啪无遮挡| 欧美高清成人免费视频www| 七月丁香在线播放| 久久久久久久国产电影| 少妇人妻一区二区三区视频| 水蜜桃什么品种好| 国产免费福利视频在线观看| 一本久久精品| 国产高清不卡午夜福利| 欧美zozozo另类| 赤兔流量卡办理| 色吧在线观看| 国产乱人偷精品视频| 深夜a级毛片| 亚洲欧美一区二区三区国产| 永久免费av网站大全| 亚洲,一卡二卡三卡| 秋霞伦理黄片| 五月玫瑰六月丁香| av在线老鸭窝| 久久久久久久久大av| 妹子高潮喷水视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 久久国内精品自在自线图片| 精品国产露脸久久av麻豆| 最近中文字幕高清免费大全6| 久热这里只有精品99| 99久久中文字幕三级久久日本| 91精品国产九色| 国产乱人视频| 精品一区二区三区视频在线| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 在线观看人妻少妇| 国产精品av视频在线免费观看| 性色av一级| 成人毛片a级毛片在线播放| 国产精品久久久久久av不卡| 精品酒店卫生间| 中国国产av一级| 一级毛片aaaaaa免费看小| 久久久久久伊人网av| 男人狂女人下面高潮的视频| 欧美日韩在线观看h| 久久精品夜色国产| 日韩一本色道免费dvd| 春色校园在线视频观看| 美女脱内裤让男人舔精品视频| av国产精品久久久久影院| 国产精品国产av在线观看| 久久久久视频综合| 久久久a久久爽久久v久久| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲人成网站在线播| 久久99精品国语久久久| a级毛色黄片| 国产乱人视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 国产免费一级a男人的天堂| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲经典国产精华液单| 99久久综合免费| 十八禁网站网址无遮挡 | 久久精品国产亚洲网站| 久久久午夜欧美精品| 亚洲精品日本国产第一区| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 国产免费视频播放在线视频| 五月开心婷婷网| 日本爱情动作片www.在线观看| 97超碰精品成人国产| 男女边吃奶边做爰视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 一级毛片电影观看| 少妇的逼水好多| 亚洲内射少妇av| 99热这里只有是精品50| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲怡红院男人天堂| 亚洲国产成人一精品久久久| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲图色成人| 色婷婷av一区二区三区视频| 欧美成人午夜免费资源| 一区二区av电影网| av黄色大香蕉| 亚洲精品乱久久久久久| 亚洲第一av免费看| 国产成人精品婷婷| 国产欧美日韩精品一区二区| 国产精品欧美亚洲77777| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 伊人久久国产一区二区| 高清日韩中文字幕在线| 婷婷色av中文字幕| freevideosex欧美| 性色av一级| 婷婷色麻豆天堂久久| 日韩 亚洲 欧美在线| 成人毛片60女人毛片免费| 国内精品宾馆在线| 边亲边吃奶的免费视频| 最近2019中文字幕mv第一页| 亚洲精品视频女| 水蜜桃什么品种好| 久久久午夜欧美精品| 欧美xxxx性猛交bbbb| 交换朋友夫妻互换小说| 国产淫片久久久久久久久| 欧美xxⅹ黑人| 老司机影院成人| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 成人无遮挡网站| 网址你懂的国产日韩在线| 色视频在线一区二区三区| 久久av网站| 深爱激情五月婷婷| 人妻制服诱惑在线中文字幕| av卡一久久| 久久久久久久久久久免费av| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 看免费成人av毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 国产精品.久久久| 国产高清有码在线观看视频| 波野结衣二区三区在线| 我要看黄色一级片免费的| 高清午夜精品一区二区三区| 女性被躁到高潮视频| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av日韩在线播放| 国内精品宾馆在线| 日韩欧美 国产精品| 麻豆成人午夜福利视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 久久久久性生活片| 国产黄频视频在线观看| 美女视频免费永久观看网站| 99热国产这里只有精品6| 欧美高清性xxxxhd video| 99热国产这里只有精品6| 欧美极品一区二区三区四区| 99热网站在线观看| 在线观看一区二区三区激情| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 亚洲内射少妇av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 精品一区在线观看国产| 国产毛片在线视频| 欧美zozozo另类| 性高湖久久久久久久久免费观看| 日韩免费高清中文字幕av| 九九在线视频观看精品| 色婷婷久久久亚洲欧美| 在线看a的网站| 久久久色成人| 男女啪啪激烈高潮av片| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 久久99蜜桃精品久久| 久久精品久久久久久久性| 观看av在线不卡| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩制服骚丝袜av| 精品亚洲成a人片在线观看 | 久久毛片免费看一区二区三区| 欧美另类一区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 97在线人人人人妻| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产男人的电影天堂91| 美女中出高潮动态图| 亚洲精品国产成人久久av| 久久久欧美国产精品| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 在线观看免费视频网站a站| 国产精品三级大全| 久久这里有精品视频免费| 91久久精品国产一区二区三区| 久久毛片免费看一区二区三区| 久久影院123| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲欧美日韩东京热| 大片免费播放器 马上看| 大陆偷拍与自拍| 亚洲高清免费不卡视频| 免费观看av网站的网址| 国产老妇伦熟女老妇高清| 男人舔奶头视频| 久久精品国产亚洲网站| 日韩精品有码人妻一区| 一个人免费看片子| a级毛片免费高清观看在线播放| 国产精品人妻久久久久久| 免费观看性生交大片5| 波野结衣二区三区在线| 国产精品熟女久久久久浪| 亚洲精品自拍成人| 美女视频免费永久观看网站| 七月丁香在线播放| 亚洲丝袜综合中文字幕| 午夜免费鲁丝| av天堂中文字幕网| 国产成人精品福利久久| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美日韩在线观看h| 亚洲图色成人| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 久久av网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 高清午夜精品一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 天堂8中文在线网| 97超碰精品成人国产| 日本av手机在线免费观看| 成人免费观看视频高清| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av国产av综合av卡| 内地一区二区视频在线| 日韩三级伦理在线观看| 在线播放无遮挡| 在线观看免费高清a一片| 国产av码专区亚洲av| 日韩 亚洲 欧美在线| av播播在线观看一区| 直男gayav资源| xxx大片免费视频| 久久亚洲国产成人精品v| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲电影在线观看av| 日韩 亚洲 欧美在线| 精华霜和精华液先用哪个| 精品人妻一区二区三区麻豆| 男女国产视频网站| 亚洲国产日韩一区二区| 国产精品熟女久久久久浪| 免费人妻精品一区二区三区视频| 亚洲不卡免费看| 国产男女内射视频| 尾随美女入室| 99久久综合免费| 寂寞人妻少妇视频99o| 韩国av在线不卡| 最新中文字幕久久久久| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产熟女欧美一区二区| 麻豆乱淫一区二区| 一区二区av电影网| av专区在线播放| 日本av手机在线免费观看| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 少妇 在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产淫语在线视频| 午夜免费鲁丝| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 亚洲国产精品一区三区| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲国产精品成人久久小说| 国产一区二区在线观看日韩| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲中文av在线| 麻豆成人午夜福利视频| 免费观看a级毛片全部| 国产成人精品一,二区| 国产高清国产精品国产三级 | 麻豆成人午夜福利视频| 国产 一区精品| 最近最新中文字幕大全电影3| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲av二区三区四区| 下体分泌物呈黄色| 免费播放大片免费观看视频在线观看| h视频一区二区三区| 久久99热这里只频精品6学生| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 欧美xxⅹ黑人| 51国产日韩欧美| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 中文字幕久久专区| 久久99热这里只频精品6学生| 亚洲欧美精品自产自拍| 成人二区视频| 久久人人爽人人爽人人片va| 一个人看视频在线观看www免费| 最近手机中文字幕大全| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| av黄色大香蕉| 成人漫画全彩无遮挡| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产精品国产av在线观看| 久久久久久久精品精品| 久久人妻熟女aⅴ| 美女视频免费永久观看网站| 大码成人一级视频| 伊人久久精品亚洲午夜| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产真实伦视频高清在线观看| 国产高清三级在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 免费观看av网站的网址| 干丝袜人妻中文字幕| 五月玫瑰六月丁香| 免费看光身美女| 成年人午夜在线观看视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 男女无遮挡免费网站观看| 天堂8中文在线网| 亚洲av日韩在线播放| 免费看日本二区| 2018国产大陆天天弄谢| 亚洲中文av在线| 一级黄片播放器| 日本vs欧美在线观看视频 | 国产黄频视频在线观看| av在线老鸭窝| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 身体一侧抽搐| 国产精品蜜桃在线观看| 成人特级av手机在线观看| 亚洲av二区三区四区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 七月丁香在线播放| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 免费看日本二区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 亚洲色图av天堂| 国产美女午夜福利| 亚洲av.av天堂| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 男人和女人高潮做爰伦理| 精品久久久久久久久亚洲| 免费人成在线观看视频色| 亚洲色图综合在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 高清在线视频一区二区三区| 在线观看国产h片| 男女免费视频国产| 18禁动态无遮挡网站| 伦理电影免费视频| 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲成人一二三区av| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 日韩一区二区三区影片| 各种免费的搞黄视频| 亚洲中文av在线| 日韩 亚洲 欧美在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产伦理片在线播放av一区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 精品国产乱码久久久久久小说| 亚洲欧美成人精品一区二区| 亚洲va在线va天堂va国产| av国产免费在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品日韩av片在线观看|