蛋白重組類生物制品制劑中吐溫80的檢測(cè)方法研究

郭笑逸 叢天生 趙春雨 杜航 白雪

（長(zhǎng)春圣金諾生物制藥有限公司 吉林長(zhǎng)春 130000）

1 前言

吐溫80是藥物制劑常用輔料，其化學(xué)名為聚氧乙烯20山梨醇酐單油酸酯，為淡黃色至橙黃色粘稠液體。相比其他輔料，其分子結(jié)構(gòu)中碳鏈結(jié)構(gòu)較長(zhǎng)，在水、乙醇、甲醇中易溶，在親脂性藥物中可發(fā)揮良好的增溶作用，故在制備難溶性藥物制劑時(shí)，常將吐溫80作為增溶劑、乳化劑及穩(wěn)定劑[1]。雖然吐溫80在制備生物制品制劑時(shí)可發(fā)揮重要作用，但如果使用過(guò)量，則可導(dǎo)致生物制品制劑使用者發(fā)生呼吸困難、惡心嘔吐、皮疹等不良反應(yīng)，對(duì)使用者的健康造成嚴(yán)重威脅?！吨袊?guó)生物制品規(guī)程（2000年版）》中明確規(guī)定[2]，無(wú)論何種生物制品制劑，其產(chǎn)品中吐溫80含量不應(yīng)高于100μg/mL，因以此作為標(biāo)準(zhǔn)，針對(duì)生物制品制劑行吐溫80含量檢測(cè)，加強(qiáng)生物制品制劑質(zhì)量控制，確保使用者身體健康。本文采用SEC-ELSD對(duì)蛋白重組類生物制品制劑中吐溫80含量進(jìn)行檢測(cè)。

2 材料與方法

2.1 試劑與儀器

試劑：本次研究選用試劑包括吐溫80對(duì)照品、乙腈、乙酸、超純水。

儀器：本次研究選用儀器包括高效液相色譜儀（型號(hào)Primaide，日本日立公司）；自動(dòng)微量分析天平（型號(hào)BM-20，日本A&D公司）；四元梯度泵（型號(hào)1260 Infinity，美國(guó)安捷倫公司）；自動(dòng)進(jìn)樣器（型號(hào)AS-2920，鄭州克萊科特儀器有限公司）；柱溫箱（FCD-230，北京金時(shí)速儀器設(shè)備有限公司）；蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（型號(hào)UM5000，深圳市億鑫儀器設(shè)備有限公司）。

2.2 檢測(cè)方法的建立

2.2.1 確定色譜條件

色譜柱選用TSKgel G2000SWXL（7.8 mm×30 cm，5μm）；

（1）為明確乙腈與乙酸（0.02 mol/L）比例構(gòu)成流動(dòng)相對(duì)分離效果的影響，對(duì)比分析乙腈與乙酸比例分別為3∶7、2∶8及1∶9情況下的分離效果，結(jié)果顯示當(dāng)乙腈與乙酸比例為1∶9時(shí)，分離效果最好，最終將流動(dòng)相中乙腈與乙酸比例定為1∶9。

（2）為明確流速對(duì)色譜基線平穩(wěn)性的影響，基于乙腈乙酸1∶9制成流動(dòng)相，對(duì)比觀察流速為0.2 mL/min、0.4 mL/min及0.6 mL/min時(shí)色譜基線的平穩(wěn)性，結(jié)果顯示流速為0.6 mL/min時(shí)色譜基線最平穩(wěn)，最終將流速定為0.6 mL/min。

（3）為明確柱溫對(duì)出峰時(shí)間的影響，對(duì)比觀察柱溫分別為30℃、35℃及40℃情況下的出峰時(shí)間，結(jié)果顯示柱溫為35℃時(shí)出峰時(shí)間最快，最終將柱溫定為35℃。

（4）為明確檢測(cè)波長(zhǎng)對(duì)色譜基線噪聲的影響，對(duì)比觀察205 nm、225 nm、254 nm及272 nm情況下的色譜基線噪聲，結(jié)果顯示檢測(cè)波長(zhǎng)為225 nm時(shí)色譜基線噪聲最小，最終將檢測(cè)波長(zhǎng)定為225 nm[3]。

2.2.2 確定蒸發(fā)光散射條件

蒸發(fā)光散射器漂移管溫度設(shè)置為110℃；氮?dú)饬魉僭O(shè)置為2.3 L/min；進(jìn)樣體積設(shè)置為10μL。

2.2.3 制備吐溫80對(duì)照品溶液

利用自動(dòng)微量分析天平精準(zhǔn)稱取適量吐溫80對(duì)照品至燒杯，并向其中加入流動(dòng)相，制成濃度為5 mg/mL溶液。

2.2.4 制備吐溫80儲(chǔ)備液

分析天平稱取精準(zhǔn)稱取100 mg吐溫80對(duì)照品至100 mL規(guī)格容量瓶中，加入適量超純水搖勻，使其充分溶解后，加入超純水至定容，獲取1 mg/mL濃度吐溫80儲(chǔ)備液。

2.2.5 制備供試品溶液

取重組人干擾素α2b注射液，在規(guī)格0.22μm微孔濾膜下過(guò)濾，獲得續(xù)濾液即為供試品溶液。

3 方法學(xué)考察

3.1 精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

移液槍吸取5組同體積吐溫80對(duì)照品溶液，加超純水稀釋至100μg/mL，連續(xù)行5次進(jìn)樣檢測(cè)，5次檢測(cè)結(jié)果保留時(shí)間和峰面積RSD值分別為0.93%和2.69%，表明本次研究選用儀器精密度優(yōu)異，詳見(jiàn)表1。

表1精密度與重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

3.2 回歸方程計(jì)算

分析天平精準(zhǔn)稱取適量吐溫80對(duì)照品，加入適量超純水，分別制成濃度為0、10.00、25.00、50.00、75.00和100.00μg/mL吐溫80溶液，各濃度各吸取200μL，連續(xù)上樣6次，并以吐溫80溶液濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，詳見(jiàn)圖1。獲得回歸方程為：y=1705.9x+238.81，R2=0.9997，可見(jiàn)吐溫80濃度在0～100.00μg/mL之間存在良好線性關(guān)系。

圖1 吐溫80標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 專屬性實(shí)驗(yàn)

參照注射液制法制成吐溫80試樣，參照供試品溶液制法制成陰性供試品溶液，進(jìn)樣10μL，色譜圖顯示，吐溫80峰對(duì)應(yīng)保留時(shí)間位置未見(jiàn)干擾雜質(zhì)峰，表明該檢測(cè)方法具有較好的專屬性。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精準(zhǔn)吸取供試品溶液100.00μL，分別于0、2、4、8、12、24和48h行進(jìn)樣檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示RSD為1.80%，表明供試品溶液穩(wěn)定性良好，詳見(jiàn)表2。

表2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=7）

3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精準(zhǔn)吸取吐溫80儲(chǔ)備液10.00、25.00、50.00、75.00和100.00μL至10 mL規(guī)格玻璃離心管中，另加入重組人干擾素α2b注射液1.0 mL，進(jìn)行加樣回收率檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示在10.00～100.00μL范圍內(nèi)，加樣回收率為99.60%～101.72%，RSD為0.48%，表明該方法準(zhǔn)確性良好，詳見(jiàn)表3。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

4 樣品檢測(cè)結(jié)果

隨機(jī)抽取5批重組人干擾素α2b注射液，選用SEC-ELSD檢測(cè)其中吐溫80含量，檢測(cè)結(jié)果顯示5批重組人干擾素α2b注射液中吐溫80含量分別為82.56、79.25、77.95、80.15和75.36μg/mL。

5 討論

吐溫80屬于一種不均勻的混合有機(jī)物，以往檢測(cè)生物制品制劑中吐溫80含量多采用高效液相色譜儀（HPLC），但由于吐溫80無(wú)強(qiáng)發(fā)色基團(tuán)，導(dǎo)致其無(wú)法實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性[4]。相比其他檢測(cè)方法，ELSD更具獨(dú)特性，并且其能有效解決HPLC中存在的檢測(cè)難點(diǎn)，同時(shí)ELSD也不會(huì)遭受樣品光學(xué)特性的影響，可實(shí)現(xiàn)對(duì)任何揮發(fā)性不及流動(dòng)相的樣品進(jìn)行檢測(cè)[5]。因此本文在將HPLC與ELSD聯(lián)用，對(duì)重組人干擾素α2b注射液中吐溫80進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，SEC-ELSD檢測(cè)生物制品制劑中吐溫80含量準(zhǔn)確性、精密度較高，對(duì)于加強(qiáng)生物制品制劑安全性管理具有至關(guān)重要的作用。