環(huán)狀RNA circ_0014359在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平及其臨床意義

魏攀，周曉豐，李巖，王婷婷，吳悠悠

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，其發(fā)生于神經(jīng)外胚層組織，發(fā)病率約為8/10萬[1]。目前臨床對膠質(zhì)瘤的治療方法，主要包括手術(shù)治療、放療、化療、免疫治療及光動力學(xué)治療等；但由于膠質(zhì)瘤的惡性程度高、手術(shù)切除困難且術(shù)后易復(fù)發(fā)等原因，膠質(zhì)瘤仍有極高的致殘率和病死率[2-3]。因此，進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機制和新的治療策略，開發(fā)新的腫瘤分子標(biāo)志物和治療靶點具有重要的臨床意義。

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA) 是一類特殊的非編碼RNA分子，最早發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)70年代，廣泛存在于哺乳動物細(xì)胞中，是現(xiàn)今RNA領(lǐng)域的研究熱點[4]。研究表明[5]，與傳統(tǒng)的線性RNA不同，環(huán)狀RNA分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu)；因此，其不受RNA外切酶的影響，不易被降解。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA分子富含多個miRNA結(jié)合位點，其可通過與疾病相關(guān)聯(lián)的miRNA相互作用，可解除miRNA對其靶基因的抑制作用，而發(fā)揮重要的調(diào)控作用。已有很多文獻(xiàn)報道，環(huán)狀RNA分子在多種腫瘤中表達(dá)水平異常且其表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如Wei等研究發(fā)現(xiàn)，由Circ_CDYL驅(qū)動的非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在早期肝癌中具有特異性作用[6]；Geng等報道，hsa_circ_0009361作為miR-582的競爭性RNA，可通過調(diào)控APC2的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展[7]。此外，環(huán)狀RNA分子circ_0007766通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1/CyclinE1/CDK4的表達(dá)，促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞的增殖[8]。circ_0014359是環(huán)狀RNA分子之一，先前的研究表明circ_0014359在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)，通過調(diào)控miR-153/PI3K信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤的惡變[9]。本研究對聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院腫瘤科2012年3月—2015年8月收治的51例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤組織及45例行顱內(nèi)減壓術(shù)患者的正常腦組織的circ_0014359表達(dá)水平進(jìn)行檢測，分析其與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。旨在探討circ_0014359在膠質(zhì)瘤的表達(dá)水平及其臨床意義，以及circ_0014359作為膠質(zhì)瘤診療和預(yù)測預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物和潛在治療靶點的可能性，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)防、診斷以及治療提供新的研究方向。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本組51例腦膠質(zhì)瘤患者中男27例，女24例；年齡35～72歲，平均年齡54.7歲；腫瘤WHO分級Ⅰ級者10例、Ⅱ級13例、Ⅲ級17例、Ⅳ級11例?；颊呔鶠槭状问中g(shù)治療，經(jīng)術(shù)后病理檢查證實，術(shù)前未接受放療、化療，臨床資料完整。另取45例顱內(nèi)減壓術(shù)患者的正常腦組織為對照組，其中男25例，女20例；年齡27～78歲，平均年齡52.5歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，患者術(shù)前均簽署知情同意書，昏迷患者則由其直系親屬代簽。

1.2 方法

1.2.1 circ_0014359表達(dá)水平檢測 手術(shù)切除的組織標(biāo)本在15 min內(nèi)立即放入-80 ℃液氮中低溫保存，待成批檢測。采用Trizol法(Invitrogen, CA, USA)提取組織標(biāo)本中的總RNA。然后用NanoDrop 1000分光光度計(NanoDrop,Wilmington,DE,USA)測定其在波長260 nm及280 nm處的吸光度(OD)比值(OD 260/280)，計算RNA濃度并評估純度；選擇OD比值在1.9～2.0范圍內(nèi)的總RNA作為樣本。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再用實時熒光定量PCR儀檢測膠質(zhì)瘤和正常腦組織中的circ_0014359表達(dá)水平；內(nèi)參照為GAPDH。然后采用2-ΔΔCt法對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行定量分析。所有實驗均重復(fù)3次，操作均嚴(yán)格按說明書的步驟進(jìn)行。

1.2.2 臨床病理指標(biāo) 觀察統(tǒng)計患者的腫瘤直徑、腫瘤位置、是否發(fā)生術(shù)后復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，以及Kamofsky功能狀態(tài)(Kamofsky performance status，KPS)評分和腫瘤WHO級別，WHO分級Ⅰ-Ⅱ 級為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ-Ⅳ級為高級別膠質(zhì)瘤?；颊咝g(shù)后隨訪3年，觀察統(tǒng)計患者的生存時間。

2 結(jié) 果

2.1 膠質(zhì)瘤與正常腦組織circ_0014359表達(dá)水平比較 膠質(zhì)瘤組織及正常腦組織circ_0014359表達(dá)水平的檢測數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布(P=0.721)。膠質(zhì)瘤組織的circ_0014359表達(dá)水平(2.83±0.30)顯著高于正常腦組織(0.97±0.24)，高級別膠質(zhì)瘤組織的circ_0014359表達(dá)水平(3.52±0.30)又明顯高于低級別膠質(zhì)瘤組織(2.14±0.32)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001，P<0.05)。見圖1。

2.2 臨床病理指標(biāo)與circ_0014359表達(dá)的關(guān)系 根據(jù)本組51例膠質(zhì)瘤患者的平均circ_0014359表達(dá)水平(2.83±0.30)，將患者分為circ_0014359高表達(dá)組(23例)和低表達(dá)組(28例)。高WHO分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KPS評分<80分及術(shù)后復(fù)發(fā)與circ_001435高表達(dá)有明顯關(guān)系(P<0.05～0.005)；而年齡、性別、腫瘤位置、腫瘤直徑與circ_001435高表達(dá)均無明顯關(guān)系(均P>0.05)。見表1。

膠質(zhì)瘤與正常腦組織比較P<0.001；高級別與低級別膠質(zhì)瘤比較P=0.011圖1 低級別、高級別膠質(zhì)瘤和正常腦組織的circ_0014359表達(dá)水平

表1 臨床病理指標(biāo)與circ_001435表達(dá)的關(guān)系(例)

2.3 circ_0014359表達(dá)與膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的關(guān)系 circ_0014359低表達(dá)組患者的術(shù)后3年生存率顯著高于circ_0014359高表達(dá)組患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.049 3)。見圖2。

2.4 膠質(zhì)瘤預(yù)后的影響因素 采用單因素分析和多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型對臨床病理指標(biāo)及circ_0014359表達(dá)與生存率進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，circ_0014359高表達(dá)、高WHO分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KPS評分低及術(shù)后復(fù)發(fā)是影響腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的獨立危險因素。見表2。

圖2 circ_0014359高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的術(shù)后3年生存率

3 討 論

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種惡性程度極高、極具破壞性的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，根據(jù)2016年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，神經(jīng)膠質(zhì)瘤被分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四個等級；其中以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性程度最高，患者預(yù)后最差，其中位生存時間只有12～15個月[10]。盡管近年來為了改善神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預(yù)后進(jìn)行了大量的研究；但由于膠質(zhì)瘤手術(shù)切除困難且術(shù)后極易復(fù)發(fā)，膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后仍不理想[11]。雖然已經(jīng)有大量的研究檢測和驗證一些與膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲和增殖相關(guān)的分子；但迄今為止，只有少數(shù)分子機制被揭示并轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用。因此，進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤的發(fā)病機理，探索新的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點成為當(dāng)前膠質(zhì)瘤研究的重點。

表2 臨床病理特征和circ_0014359表達(dá)與生存率的單因素及多因素分析

circRNA是一種內(nèi)源性非編碼RNA。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，circRNA通過作為miRNA的干擾RNA，與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合、參與翻譯等多種方式在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮多種生物學(xué)功能[12]。相關(guān)研究表明，由于circRNA缺乏5′帽子結(jié)構(gòu)及3′ poly A尾，導(dǎo)致其表達(dá)更加穩(wěn)定和保守；因此其可能作為腫瘤新的治療靶點在多種腫瘤的治療中起到重要作用[13]。如有研究顯示，hsa_circ_0009361在結(jié)直腸癌中低表達(dá)，可通過影響miR-582進(jìn)一步調(diào)控APC2的表達(dá)從而抑制結(jié)直腸癌的進(jìn)展；hsa_circ_0009361低表達(dá)預(yù)示患者的預(yù)后不良[7]；此外在胃癌中，hsa_circ_0008035可通過靶向miR-375/YBX1軸參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[14]。Wang等研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)狀RNA VANGL1在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平上調(diào)，且通過抑制miR-195和激活Bcl-2促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[15]。而膠質(zhì)瘤中也存在多種circRNA表達(dá)異常。Qu等研究顯示，環(huán)狀RNA circ_0079593在膠質(zhì)瘤中通過干擾miR-182和miR-433促進(jìn)細(xì)胞生長和侵襲，高表達(dá)的circ_0079593提示預(yù)后不良[16]。有文獻(xiàn)報道，circ_0005198在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平顯著增高，過表達(dá)的circ_0005198可調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲[17]。Li等研究表明，circ_0001946可通過調(diào)控miR-671-5p和CDR1，作為競爭性內(nèi)源性RNA抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的進(jìn)展[18]。circ_0014359作為一種新發(fā)現(xiàn)的circRNA，有研究發(fā)現(xiàn)其在膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)水平明顯增高，并且作為miR-153的競爭性RNA促進(jìn)膠質(zhì)瘤的進(jìn)展[9]。然而，關(guān)于膠質(zhì)瘤中circ_0014359表達(dá)水平的臨床意義尚無文獻(xiàn)報道。為此，本研究通過檢測膠質(zhì)瘤及正常腦組織的circ_0014359表達(dá)水平，探討膠質(zhì)瘤的circ_0014359表達(dá)水平及其臨床意義。

本研究結(jié)果顯示，膠質(zhì)瘤組織的circ_0014359表達(dá)水平明顯高于正常腦組織(P<0.001)，且高級別膠質(zhì)瘤的circ_0014359表達(dá)水平明顯高于低級別膠質(zhì)瘤(P<0.05)，表明circ_0014359表達(dá)水平可能與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)。circ_0014359高表達(dá)與腫瘤高WHO分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、KPS評分低及術(shù)后復(fù)發(fā)有明顯關(guān)系(P<0.05～0.005)，而與年齡、性別、腫瘤位置及直徑無關(guān)(均P>0.05)。這進(jìn)一步證實circ_0014359高表達(dá)與腫瘤的惡性程度及侵襲性有關(guān)，提示可通過抑制circ_0014359在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)而發(fā)揮抑癌作用。此外，生存分析顯示circ_0014359高表達(dá)膠質(zhì)瘤患者的3年生存率顯著低于低表達(dá)患者(P<0.05)；單因素分析及多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型分析顯示，circ_0014359高表達(dá)是膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的獨立危險因素。

綜上所述，circ_0014359在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)，且其表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度密切相關(guān)；circ_0014359高表達(dá)是預(yù)測膠質(zhì)瘤患者預(yù)后不良的重要因素之一，提示circ_0014359可以作為膠質(zhì)瘤診斷和預(yù)測預(yù)后的一種潛在的腫瘤分子標(biāo)志物和治療靶點。盡管目前對circ_0014359在膠質(zhì)瘤的生物學(xué)作用尚不十分明確，但隨著對circ_0014359的作用機制和參與調(diào)控信號通路的研究不斷深入，可以為膠質(zhì)瘤的預(yù)防、診斷和治療提供新的思路與方向。