化學(xué)分子伴侶及誘導(dǎo)條件協(xié)同強(qiáng)化Thermotoga maritima α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表達(dá)

段緒果 張玉華 黃婷婷 丁乾 欒舒越 朱秋雨

（南京林業(yè)大學(xué)輕工與食品學(xué)院，南京 210037）

α-葡聚糖磷酸化酶（EC 2.4.1.1）廣泛存在動(dòng)物、植物和微生物中，能夠催化α-1，4-葡聚糖的可逆性磷酸解反應(yīng)，該酶屬于糖基轉(zhuǎn)移酶35家族［1-2］。不同來(lái)源的α-葡聚糖磷酸化酶催化機(jī)制非常相似，幾乎都需要5-磷酸吡多醛作為輔因子，以及一段短寡糖鏈作引物。α-葡聚糖磷酸化酶構(gòu)成了一個(gè)具有高度同源性的大家族，包括：糖原磷酸化酶、淀粉磷酸化酶和麥芽糊精磷酸化酶。這些酶的調(diào)節(jié)機(jī)制及底物特異性均有所不同。如來(lái)源于兔肌肉及土豆中的α-葡聚糖磷酸化酶分別為典型的調(diào)節(jié)與非調(diào)節(jié)的酶，前者受到別構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié)，而后者不受別構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié)［3］。

α-葡聚糖磷酸化酶可用于制備葡萄糖-1-磷酸［4］、直鏈淀粉［5-6］及pH敏感水凝膠［7］等高附加值產(chǎn)物［8］。其中，葡萄糖-1-磷酸（glucose-1-phosphate，G-1-P）是糖代謝中重要的中間產(chǎn)物，具有重要的藥用價(jià)值，可作為制備細(xì)胞增殖抑制劑和抗生素等產(chǎn)品的原料。α-葡聚糖磷酸化酶能夠以廉價(jià)的淀粉質(zhì)、糊精等原料為底物，通過(guò)催化可逆性磷酸解反應(yīng)，催化形成葡萄糖-1-磷酸。國(guó)外對(duì)利用葡聚糖磷酸化酶催化淀粉底物制備葡萄糖-1-磷酸的研究較早，1994年Andreas等將重組麥芽糊精磷酸化酶固定在超濾反應(yīng)器上，以麥芽糊精為底物連續(xù)生產(chǎn)葡萄糖-1-磷酸，在30℃，pH 7.5條件下，產(chǎn)率達(dá)2.6 g/L/h。但是麥芽糊精磷酸化酶為常溫酶，熱穩(wěn)定性差，不能滿足工業(yè)需求，所以高溫磷酸化酶逐漸受到重視［9］。近年來(lái)隨著嗜熱微生物來(lái)源高溫α-葡聚糖磷酸化酶的開(kāi)發(fā)，國(guó)內(nèi)外對(duì)該酶的研究逐漸增多［10］。2005年，Bae等［4］對(duì)Thermus caldophilus α-葡聚糖磷酸化酶進(jìn)行分離純化，在70℃條件下以可溶性淀粉為原料制備葡萄糖-1-磷酸，產(chǎn)率達(dá)69.78%。2016年Zhou等［11］采用Thermotoga maritima α-葡聚糖磷酸化酶與異淀粉酶等復(fù)配轉(zhuǎn)化淀粉，葡萄糖-1-磷酸最高產(chǎn)量可以達(dá)到52 g/L。2016年，張堯等［12］利用重組Pyrococcus furiosus α-葡聚糖磷酸化酶轉(zhuǎn)化普通玉米淀粉來(lái)制備葡萄糖-1-磷酸，轉(zhuǎn)化率達(dá)到65.1%。雖然酶法合成葡萄糖-1-磷酸取得一定的進(jìn)展，但仍存在一些不足，如α-葡聚糖磷酸化酶產(chǎn)量較低，使用成本較高等問(wèn)題。

由于直接利用嗜熱微生物發(fā)酵制備α-葡聚糖磷酸化酶存在產(chǎn)量低、發(fā)酵條件苛刻、成本高等問(wèn)題。異源重組表達(dá)是獲得高溫α-葡聚糖磷酸化酶的主要方式，其中大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用最為普遍。盡管大量外源蛋白已經(jīng)成功實(shí)現(xiàn)了在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中過(guò)量表達(dá)，但是多數(shù)蛋白異源表達(dá)過(guò)程中非常容易形成無(wú)活性的包涵體，導(dǎo)致可溶性表達(dá)水平偏低，這是限制大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)廣泛應(yīng)用的主要瓶頸之一。目前，有多種途徑被用來(lái)提高異源蛋白的表達(dá)水平，如培養(yǎng)條件優(yōu)化、融合表達(dá)、共表達(dá)分子伴侶、添加滲透壓調(diào)節(jié)劑（化學(xué)分子伴侶） 等［13-14］。其中，共表達(dá)分子伴侶或添加化學(xué)分子伴侶均可以在細(xì)胞內(nèi)部穩(wěn)定蛋白折疊構(gòu)象、促進(jìn)蛋白正確折疊，從而減少蛋白聚集及包涵體形成，提高可溶性蛋白所占的比例［15］。由于不同蛋白組成及結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致蛋白折疊中間體以及折疊和聚集動(dòng)力學(xué)存在顯著差異，而且影響蛋白質(zhì)折疊和聚集的機(jī)制極其復(fù)雜，因此很難預(yù)測(cè)哪種分子伴侶、化學(xué)分子伴侶對(duì)特定蛋白的折疊具有促進(jìn)作用。研究發(fā)現(xiàn)，采用實(shí)驗(yàn)優(yōu)化的方法來(lái)篩選對(duì)特定蛋白具有促進(jìn)作用的因素，是一種行之有效的方法。

本研究構(gòu)建了產(chǎn)T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶重組菌株，為進(jìn)一步提高重組酶可溶性表達(dá)水平，分別從誘導(dǎo)條件（誘導(dǎo)劑種類、誘導(dǎo)劑濃度、溫度、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間）和分子伴侶（共表達(dá)分子伴侶、化學(xué)分子伴侶種類及濃度）兩個(gè)方面對(duì)重組酶可溶性表達(dá)的影響進(jìn)行了考察，以期為α-葡聚糖磷酸化酶的高效制備和應(yīng)用提供的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 pET24a（+）、E. coli JM109、E. coli BL21（DE3）、分別含有1種分子伴侶質(zhì)粒的pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16的 宿 主細(xì)胞E. coli BL21（DE3）為本實(shí)驗(yàn)室保藏。海棲熱袍菌T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶編碼基因α-GPtm為上海生工生物工程有限公司合成，該基因根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行了優(yōu)化，基因片段兩端酶切位點(diǎn)分別為NdeⅠ和Hind Ⅲ，該基因被連接在克隆載體pUC57中，命名為pUC57-α-GPtm。

1.1.2 試劑 限制性內(nèi)切酶Nde I、Hind III、T4 DNA連接酶和CIAP等購(gòu)自大連寶生物工程公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素購(gòu)自上海生工生物工程公司。UTP（尿苷三磷酸），PPase（無(wú)機(jī)焦磷酸化酶）和UGPase（尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶）購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。蛋白胨和酵母粉購(gòu)自O(shè)xoid公司。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，121℃滅菌30 min，使用前加入終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素或者30 μg/mL的卡那霉素。固體LB培養(yǎng)基在此基礎(chǔ)上添加1.5%（W/V）瓊脂粉。

TB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，K2HPO4·3H2O 16.43，KH2PO42.31，甘油5，用1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0-7.2，121℃滅 菌30 min，使用前加入終濃度為30 μg/mL的卡那霉素。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化子篩選 將帶有目的基因的克隆載體pUC57-α-GPtm經(jīng)過(guò)Nde I和Hind Ⅲ酶切，并與經(jīng)過(guò)相同酶切并去磷酸化的表達(dá)載體pET24a（+）連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli JM109，涂布含有30 μg/mL卡那霉素抗性平板上，培養(yǎng)過(guò)夜篩選轉(zhuǎn)化子。挑取轉(zhuǎn)化子至含有30 μg/mL卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒。經(jīng)酶切驗(yàn)證且測(cè)序正確的質(zhì)粒pET24a-α-GPtm直接轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coli BL21（DE3），涂布含有30 μg/mL卡那霉素抗性平板上進(jìn)行篩選。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，并保存甘油管備用。

1.2.2 分子伴侶共表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建 分別將含有1種分子伴侶質(zhì)粒的pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pGTf2和pTf16的E. coli BL21（DE3）宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，采用標(biāo)準(zhǔn)流程制備感受態(tài)細(xì)胞。將表達(dá)載體pET24a-α-GPtm分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，得到帶有不同類型分子伴侶質(zhì)粒的共表達(dá)菌株。

1.2.3 重組菌的搖瓶發(fā)酵 種子培養(yǎng)：從-80℃ 保藏的甘油管中取20 μL菌液，接種于含有Kan抗性的10 mL LB培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min，培養(yǎng)8 h。

搖瓶發(fā)酵：以5%（V/V）接種量將活化的菌體轉(zhuǎn)接至裝液量為50 mL TB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中。37℃、200 r/min，培養(yǎng)4 h，加入0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)至20 h。

發(fā)酵條件優(yōu)化：分別對(duì)誘導(dǎo)劑種類、誘導(dǎo)劑濃度、溫度、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間、化學(xué)分子伴侶種類及濃度和共表達(dá)分子伴侶等因素進(jìn)行優(yōu)化。共表達(dá)分子伴侶的重組菌株發(fā)酵方法參考TaKaRa公司分子伴侶質(zhì)粒系統(tǒng)使用說(shuō)明。

樣品制備：將搖瓶發(fā)酵所得菌液，于4℃ 離心收集菌體、8 000 r/min離心10 min棄上清，收集菌體；用0.02 mol/L磷酸緩沖溶液進(jìn)行充分懸浮，在4℃ 下進(jìn)行超聲細(xì)胞破碎儀處理細(xì)胞，處理方式是：200 W，工作3 s，間歇5 s，共處理10 min。在此過(guò)程中，菌液始終置于冰水混合浴中。將細(xì)胞破碎液于4℃、8 000 r/min離心10 min除去細(xì)胞碎片沉淀，上清為含有α-葡聚糖磷酸化酶的粗酶液。

1.2.4 菌體生物量的測(cè)定 發(fā)酵液濁度（OD600）測(cè)定：以去離子水為空白對(duì)照，將發(fā)酵好的菌液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，用UVmini-1240紫外分光光度計(jì)測(cè)定其于600 nm處的吸光值A(chǔ)600。稀釋倍數(shù)以在0.2-0.8之間為宜，則OD600=A600×稀釋倍數(shù)。

細(xì)胞干重測(cè)定：取一定量發(fā)酵液于12 000 r/min下離心5 min，用生理鹽水洗滌兩次，離心后菌泥于105℃烘至恒重后稱重。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析 根據(jù)α-葡聚糖磷酸化酶的分子量，分離膠選用12% SDS-PAGE（＞10 kD）的電泳方案。電泳凝膠配方，電泳參數(shù)及凝膠的染色、脫色方法均參照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

1.2.6 α-葡聚糖磷酸化酶活力的測(cè)定 酶活力測(cè)定方法參考張堯等［12］并根據(jù)所用酶的特點(diǎn)進(jìn)行調(diào)整。反應(yīng)總體積為1.0 mL，該體系含有50 mmol/L PBS緩沖液（pH 7.2），2 mmol/L MgCl2，1%可溶性淀粉，2 mmol/L UTP，5 U/mL PPase及3 U/mL UGPase，以包含除酶外所有底物的體系作為對(duì)照，70℃反應(yīng)10 min，加入次氯酸終止反應(yīng)，再用氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至7.0。12 000×g，4℃離心10 min 除去變性酶蛋白，上清液進(jìn)行HPLC 分析。HPLC 條件為，Agilent 5 TC-C18（2）色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，流動(dòng)相為50 mmol/L 甲酸銨（pH3.5），流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進(jìn)樣量10 μL。

酶活定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘形成1 μmol 葡萄糖-1-磷酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

2 結(jié)果

2.1 重組菌株的構(gòu)建及驗(yàn)證

首先，將含有目的基因的克隆載體pUC57-α-GPtm進(jìn)行雙酶切、膠回收并純化得到2.4 kb左右的目的基因片段。將該基因片段與同樣酶切純化回收的表達(dá)載體pET24a（+）連接后轉(zhuǎn)化E. coli JM109，挑選陽(yáng)性克隆，轉(zhuǎn)接LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)后再提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)Nde I和Hind Ⅲ雙酶切，核酸電泳檢測(cè)結(jié)果顯示得到兩條大小分別為5.3 kb和2.4 kb的條帶，結(jié)果與預(yù)期相符，證明α-GPtm基因已成功連接到表達(dá)載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主E. coli BL21（DE3），得到重組菌株E. coli BL21（DE3）/ pET24-α-GPtm。

重組菌株在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)并經(jīng)過(guò)0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)，培養(yǎng)24 h取樣測(cè)定酶活力，酶活力為5.2 U/mL。利用12% SDS-PAGE對(duì)重組菌的發(fā)酵上清和全細(xì)胞進(jìn)行蛋白電泳檢測(cè)，在發(fā)酵液和細(xì)胞中都有與目的重組蛋白理論分子量相一致的條帶，條帶大小約為90 kD（圖1），而還有空載體的對(duì)照菌株樣品沒(méi)有相應(yīng)條帶出現(xiàn)。酶活力測(cè)定及蛋白電泳結(jié)果都表明重組α-葡聚糖磷酸化酶成功實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。SDS-PAGE蛋白分析發(fā)現(xiàn)，重組蛋白可溶性表達(dá)水平偏低，存在較多包涵體。

圖1 重組菌株及對(duì)照菌株發(fā)酵產(chǎn)α-葡聚糖磷酸化酶SDS-PAGE電泳圖Fig. 1 SDS-PAGE analysis of α-glucan phosphorylase produced by the recombinant strains and the control strain

2.2 誘導(dǎo)劑濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

誘導(dǎo)劑對(duì)重組蛋白的表達(dá)水平及狀態(tài)具有重要的影響，因此非常有必要對(duì)誘導(dǎo)劑的種類及濃度進(jìn)行考察及優(yōu)化。本研究中所用表達(dá)載體為pET24a（+），該載體的啟動(dòng)子是T7啟動(dòng)子。T7啟動(dòng)子處于LacI阻遏蛋白的調(diào)控下，當(dāng)添加誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)時(shí)，阻遏蛋白與誘導(dǎo)劑結(jié)合并發(fā)生構(gòu)象改變，從操縱基因上脫離并激活T7 RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，最終激活T7啟動(dòng)子控制下的目的基因的表達(dá)。T7啟動(dòng)子常用的誘導(dǎo)劑是乳糖和IPTG。本研究分別對(duì)不同濃度的乳糖和IPTG對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響進(jìn)行了考察。

2.2.1 乳糖濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響 由圖2可知，當(dāng)以乳糖為誘導(dǎo)劑時(shí)，不同濃度的乳糖對(duì)菌體生長(zhǎng)和α-葡聚糖磷酸化酶產(chǎn)量的影響不同。當(dāng)乳糖濃度為0 g/L、5 g/L和10 g/L時(shí)，菌體濃度沒(méi)有明顯變化，發(fā)酵液細(xì)胞干重都在4.0 g/L左右；當(dāng)乳糖濃度超過(guò)10 g/L時(shí)，繼續(xù)提高乳糖濃度，菌濃開(kāi)始下降，當(dāng)乳糖濃度為20 g/L時(shí)，細(xì)胞干重只有3.5 g/L。乳糖對(duì)α-葡聚糖磷酸化酶的產(chǎn)量也有明顯影響，不加乳糖誘導(dǎo)劑時(shí)，酶活力只有1.4 U/mL，當(dāng)乳糖濃度為5 g/L時(shí)，酶活力最高，為12.0 U/mL；繼續(xù)提高乳糖濃度，酶活力開(kāi)始降低。

圖2 乳糖濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酶的影響（A）和細(xì)胞破碎上清SDS-PAGE電泳圖（B）Fig. 2 Effect of lactose concentration on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

2.2.2 IPTG濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響 由圖3可知，當(dāng)以IPTG為誘導(dǎo)劑時(shí)，當(dāng)IPTG濃度低于0.05 mmol/L時(shí)，對(duì)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有影響；當(dāng)IPTG濃度高于0.05 mmol/L時(shí)，隨著IPTG濃度的升高，菌體濃度逐漸降低；當(dāng)IPTG濃度為0.4 mmol/L時(shí)，發(fā)酵液細(xì)胞干重為3.5 g/L，只有IPTG為0.05 mmol/L時(shí)菌體濃度的85%。上述結(jié)果顯示高濃度的IPTG會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，原因是IPTG對(duì)重組細(xì)胞具有一定的毒性。當(dāng)IPTG濃度在0 mmol/L和0.2 mmol/L之間時(shí)，隨著誘導(dǎo)劑濃度的提高，重組α-葡聚糖磷酸化酶逐漸提高，最高酶活力15.1 U/mL是不加誘導(dǎo)劑時(shí)酶活力的12.6倍。當(dāng)IPTG濃度高于0.2 mmol/L時(shí)，重組α-葡聚糖磷酸化酶明顯下降；當(dāng)濃度達(dá)到0.4 mmol/L時(shí)，酶活力只有11.2 U/mL。這種現(xiàn)象與Jhamb等在報(bào)道的結(jié)果類似，Jhamb等發(fā)現(xiàn)木聚糖酶在大腸桿菌中重組表達(dá)時(shí)，IPTG濃度對(duì)重組蛋白的可溶性具有重要的影響，當(dāng)IPTG濃度過(guò)高時(shí)重組木聚糖酶主要以包涵體形式存在，可溶性酶比例 降低［14］。

圖3 IPTG濃度對(duì)重組菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酶的影響（A）和細(xì)胞破碎上清SDS-PAGE電泳圖（B）Fig. 3 Effect of IPTG concentration on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

根據(jù)誘導(dǎo)劑（乳糖和IPTG）優(yōu)化結(jié)果可以看出，以IPTG為誘導(dǎo)劑時(shí)，重組α-葡聚糖磷酸化酶最高活力是以乳糖為誘導(dǎo)劑時(shí)最高酶活力的1.3倍，因此本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用IPTG為誘導(dǎo)劑。

2.3 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

誘導(dǎo)溫度是影響重組蛋白表達(dá)的另一個(gè)重要因素，在發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格地控制該參數(shù)，以獲得最佳生產(chǎn)效率。一般來(lái)說(shuō)，誘導(dǎo)溫度高，表達(dá)強(qiáng)度大，重組蛋白較易形成包涵體；而低誘導(dǎo)溫度可以降低表達(dá)速度，減少包涵體的形成并提高可溶性重組蛋白的比例。本研究首先將重組菌在37℃培養(yǎng)4 h，然后分別25、28、30、33和37℃條件下加入誘導(dǎo)劑對(duì)重組菌進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶情況進(jìn)行分析。如圖4所示，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌體濃度和酶活力變化趨勢(shì)一致，都是先升高再降低。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為28℃時(shí)，發(fā)酵液中細(xì)胞干重和酶活力分別為4.3 g/L和22.8 U/mL。繼續(xù)提高誘導(dǎo)溫度，菌濃緩慢降低，而酶活力快速下降。當(dāng)誘導(dǎo)溫度為37℃時(shí)，重組α-葡聚糖磷酸化酶活力只有9.5 U/mL，是28℃時(shí)酶活力的41.7%。在對(duì)2種融合蛋白VP1-GFP和VP1-LAC的重組表達(dá)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)低溫可以明顯的提高重組蛋白的質(zhì)量；而高溫培養(yǎng)時(shí)，重組蛋白折疊效率降低，更容易形成蛋白聚集體。為了提高重組酶的可溶性表達(dá)水平，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用28℃作為重組菌株的誘導(dǎo)培養(yǎng)溫度。

圖4 誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酶的影響（A）和細(xì)胞破碎上清SDS-PAGE電泳圖（B）Fig. 4 Effect of induction temperature on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

2.4 誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的影響

根據(jù)2.2節(jié)中研究結(jié)果可知，本研究選用IPTG作為最佳誘導(dǎo)劑，除誘導(dǎo)劑濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)具有重要影響外，誘導(dǎo)劑添加時(shí)間是另外一個(gè)重要參數(shù)。本研究選擇接種后0 h、2 h、4 h、6 h和10 h，分別添加0.2 mmol/L IPTG進(jìn)行重組酶的誘導(dǎo)表達(dá)。如圖5所示，誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)重組菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶都具有非常明顯的影響。過(guò)早添加誘導(dǎo)劑（0 h和2 h）時(shí)，菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶都會(huì)受到明顯抑制，0 h添加誘導(dǎo)劑，發(fā)酵液細(xì)胞干重和酶活力分別為1.1 g/L和6.1 U/mL。隨著誘導(dǎo)劑添加時(shí)間的增加，菌濃和酶活力都逐漸增加。當(dāng)誘導(dǎo)劑添加時(shí)間為6 h時(shí)，發(fā)酵液細(xì)胞干重和酶活力分別為4.1 g/L和27.0 U/mL，分別是0 h添加誘導(dǎo)劑時(shí)相關(guān)參數(shù)的3.9倍和4.4倍。繼續(xù)增加誘導(dǎo)劑添加時(shí)間，菌濃略有增加，但是酶活力顯著降低。當(dāng)誘導(dǎo)劑添加時(shí)間為10 h時(shí)，酶活力為16.0 U/mL，是最佳條件下酶活力的59.2%。

圖5 誘導(dǎo)劑添加時(shí)間對(duì)重組菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酶的影響（A）和細(xì)胞破碎上清SDS-PAGE電泳圖（B）Fig. 5 Effect of adding inducer at different times on the recombinant strain growth and enzyme production (A) and the SDS-PAGE analysis of cell disruption supernatant of the recombinant strain (B)

2.5 共表達(dá)分子伴侶對(duì)產(chǎn)酶的影響

對(duì)帶有重組載體pET24a-α-GPtm和不同分子伴侶 質(zhì) 粒pG-KJE8、pGro7、pKJE7、pG-Tf2和pTf16的共表達(dá)重組菌分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵和誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示5種分子伴侶共表達(dá)對(duì)α-葡聚糖磷酸化酶的可溶性表達(dá)水平均沒(méi)有提高，因此后續(xù)研究以沒(méi)有共表達(dá)分子伴侶的菌株為研究對(duì)象。

2.6 添加化學(xué)分子伴侶對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶的 影響

從2.2、2.3和2.4的結(jié)果可以看出，較低的誘導(dǎo)溫度、適合的誘導(dǎo)強(qiáng)度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表達(dá)水平具有明顯的促進(jìn)作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)仍然有一定比例的重組α-葡聚糖磷酸化酶會(huì)以包涵體的形式存在，如果能夠減少包涵體的形成，有望進(jìn)一步提高α-葡聚糖磷酸化酶的可溶性表達(dá)水平。細(xì)胞內(nèi)部天然存在的一些小分子滲透壓調(diào)節(jié)劑不但能夠顯著地提高一些蛋白的熱穩(wěn)定性，而且可以促進(jìn)蛋白的正確折疊。這些小分子滲透壓調(diào)節(jié)劑由于具有提高天然蛋白的熱穩(wěn)定性和促進(jìn)非折疊多肽復(fù)性的獨(dú)特作用，而被稱為“化學(xué)分子伴侶”。本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，選擇了8種試劑（苯乙醇、甘氨酸、海藻糖、苯甲醇、甜菜堿、L-脯氨酸、氧化三甲胺和肌醇），考察它們對(duì)菌體生長(zhǎng)及α-葡聚糖磷酸化酶可溶性表達(dá)的影響。

如圖6-A所示，添加10 mmol/L不同化學(xué)分子伴侶對(duì)菌體生長(zhǎng)及α-葡聚糖磷酸化酶表達(dá)具有不同地影響。其中，苯乙醇對(duì)重組菌生長(zhǎng)及產(chǎn)酶都有明顯的抑制作用；甘氨酸、海藻糖、苯甲醇、甜菜堿、L-脯氨酸對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用；氧化三甲胺和肌醇對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不明顯。在酶活力方面，苯乙醇、甘氨酸和海藻糖對(duì)酶活力有不同程度的抑制作用，其中海藻糖和苯乙醇抑制作用最為明顯，酶活力只有對(duì)照組的28.0%和43.6%。苯甲醇、甜菜堿、L-脯氨酸、氧化三甲胺和肌醇對(duì)重組酶產(chǎn)量有不同程度的促進(jìn)作用，其中氧化三甲胺和肌醇促進(jìn)效果最佳，酶活力分別是對(duì)照酶活力的1.6倍和2.0倍。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)添加氧化三甲胺和肌醇，對(duì)重組酶的產(chǎn)量沒(méi)有協(xié)同促進(jìn)作用。

進(jìn)一步考察了不同濃度肌醇（0 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、30 mmol/L和40 mmol/L）對(duì)重組菌發(fā)酵的影響。如圖6-B所示，不同濃度肌醇對(duì)重組菌生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響，但是對(duì)酶活力具有顯著的影響。在0 mmol/L到20 mmol/L范圍內(nèi)，隨著肌醇濃度的提高，酶活力逐漸提高，最高酶活力為58.8 U/mL，是不加肌醇時(shí)酶活力的2.6倍。當(dāng)肌醇濃度大于20 mmol/L時(shí)，酶活力逐漸降低；肌醇濃度為30 mmol/L和40 mmol/L時(shí)，酶活力分別為57.8 U/mL和47.9 U/mL。因此最佳化學(xué)分子伴侶為肌醇，最佳濃度為20 mmol/L。

圖6 化學(xué)分子伴侶種類（A）及肌醇濃度（B）對(duì)重組菌生長(zhǎng)、產(chǎn)酶的影響Fig. 6 Effect of different chemical chaperone (A) and inositol concentration (B) on the recombinant strain growth and enzyme production

2.7 最優(yōu)發(fā)酵條件下重組菌株生長(zhǎng)及產(chǎn)酶曲線

在最佳培養(yǎng)及誘導(dǎo)條件下，將發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)到40 h，中間每隔一定時(shí)間取樣測(cè)定重組菌株的發(fā)酵液細(xì)胞干重和重組酶活力，并繪制相應(yīng)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酶曲線。如圖7 所示，0-2 h為重組菌株生長(zhǎng)延滯期；2-12 h為重組菌株對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；重組菌株發(fā)酵25-30 h為生長(zhǎng)穩(wěn)定期；發(fā)酵30 h 以后進(jìn)入衰亡期。酶活力增長(zhǎng)趨勢(shì)與菌體生長(zhǎng)總體一致并略有滯后，酶活力在30 h 達(dá)到最高，為62.0 U/mL。

圖7 重組菌在最佳條件下生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)酶曲線Fig. 7 Growth curve and enzyme production curve of recombinant strain on the optimal condition

3 討論

α-葡聚糖磷酸化酶在葡萄糖-1-磷酸、合成直鏈淀粉及pH敏感水凝膠等高附加值產(chǎn)品的制備中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)該酶基因克隆表達(dá)、定性及應(yīng)用評(píng)價(jià)等方面的報(bào)道逐年增 多［7，11-12］。但是，關(guān)于如何實(shí)現(xiàn)α-葡聚糖磷酸化酶高效發(fā)酵制備方面研究，國(guó)內(nèi)外卻鮮有報(bào)道。

研究發(fā)現(xiàn)，重組酶表達(dá)過(guò)程中，誘導(dǎo)條件[16-18]、除基因轉(zhuǎn)錄、翻譯等會(huì)影響其表達(dá)量以外，不同類型酶自身特性（氨基酸組成、分子量大小、空間結(jié)構(gòu)等）、宿主菌、培養(yǎng)表達(dá)條件等方面的差異亦會(huì)顯著影響重組酶的折疊狀態(tài)等，最終導(dǎo)致不同酶表現(xiàn)出在產(chǎn)量、可溶性比例等方面的巨大差異［19-21］。因此，重組菌株的構(gòu)建只是獲得重組酶的第一步。然而蛋白難以可溶性表達(dá)的情況時(shí)有發(fā)生，目前除了可以采用融合促溶標(biāo)簽［22-25］、蛋白質(zhì)工程改造［26］、定向進(jìn)化［27-28］等不同的策略來(lái)促進(jìn)蛋白的正確折疊以提高其可溶表達(dá)水平以外，篩選與之匹配的培養(yǎng)表達(dá)條件也是促進(jìn)蛋白可溶性表達(dá)的重要手段之 一［29-30］。本研究在構(gòu)建產(chǎn)海棲熱袍菌T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶重組菌后，首先采用常規(guī)培養(yǎng)條件（培養(yǎng)溫度為37℃，誘導(dǎo)劑濃度為0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，酶活力檢測(cè)結(jié)果顯示酶活力僅為5.2 U/mL，SDS-PAGE蛋白電泳顯示有較多的重組酶為不可溶的包涵體，說(shuō)明該重組酶可溶性表達(dá)水平較低。為提高重組酶的可溶性表達(dá)水平，分別對(duì)誘導(dǎo)劑種類、誘導(dǎo)劑濃度、溫度、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間、共表達(dá)分子伴侶、添加化學(xué)分子伴侶等因素進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)降低誘導(dǎo)強(qiáng)度（0.2 mmol/L IPTG）、誘導(dǎo)階段低溫培養(yǎng)（28℃），以及添加化學(xué)分子伴侶（20 mmol/L的肌醇），重組α-葡聚糖磷酸化酶的表達(dá)水平由5.2 U/mL提高到62.0 U/mL，可溶性酶的活力提高了11.9倍。該策略無(wú)需融合促溶標(biāo)簽，因此后續(xù)不用切割去除融合標(biāo)簽，下游處理工藝更加簡(jiǎn)單方便；此外，本方法亦無(wú)需對(duì)目的蛋白進(jìn)行分子改造，因此可以最大限度的保持重組酶的天然結(jié)構(gòu)，不會(huì)對(duì)酶的功能產(chǎn)生影響。該工藝的建立，顯著提高了重組菌株發(fā)酵制備α-葡聚糖磷酸化酶的活力水平，為α-葡聚糖磷酸化酶進(jìn)一步發(fā)酵放大奠定了基礎(chǔ)，也可為其它蛋白的可溶性重組表達(dá)制備提供參考。

4 結(jié)論

本研究構(gòu)建了產(chǎn)海棲熱袍菌T. maritima α-葡聚糖磷酸化酶重組菌株，搖瓶培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)該酶主要以包涵體形式存在，可溶性表達(dá)水平偏低。為減少包涵體的形成，提高重組酶可溶性表達(dá)水平，分別對(duì)誘導(dǎo)劑種類、誘導(dǎo)劑濃度、溫度、誘導(dǎo)劑添加時(shí)間、分子伴侶、化學(xué)分子伴侶種類及濃度等因素對(duì)重組酶表達(dá)的影響進(jìn)行了考察。優(yōu)化后的最佳培養(yǎng)條件為：接種重組菌株的同時(shí)，向TB發(fā)酵培養(yǎng)基中添加終濃度為20 mmol/L的肌醇；然后在37℃條件下培養(yǎng)6 h，降溫至28℃并加入0.2 mmol/L IPTG，繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)。發(fā)酵30 h 酶活力達(dá)到最高，為62.0 U/mL，是優(yōu)化前酶活力的11.9倍。