靈芝子實體不同提取物對小鼠睡眠改善作用的比較

葉輝宇，李強明，張玉英，楊思林，劉 健，羅建平,*

（1.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽合肥 230601；2.安徽省華信生物藥業(yè)股份有限公司，安徽界首 236500）

睡眠障礙是影響人體身心健康的嚴重問題，據(jù)調(diào)查，我國約有16.8%的人患有失眠癥狀[1]。長期失眠不僅影響生活質(zhì)量，使患者健忘、注意力不能集中等，而且會導致認知功能障礙[2?3]，增加心血管疾病和抑郁癥的患病風險[4?6]。當前臨床治療睡眠障礙的藥物主要為苯二氮卓受體激動劑，但長時間服用會產(chǎn)生藥物成癮、認知功能損傷等危害[7?9]。傳統(tǒng)中藥具有副作用小的特點，利用中藥改善睡眠在我國已有數(shù)千年歷史，如酸棗仁湯、歸脾湯等[10]。但中藥化學成分復雜多樣，改善睡眠的有效成分及藥理作用途徑不明確，因此限制了對中藥改善睡眠效果的改進及相關(guān)產(chǎn)品開發(fā)。隨著藥食同源理念逐漸深入人心，從傳統(tǒng)中藥中開發(fā)改善睡眠相關(guān)的功能性食品的研究愈加受到關(guān)注。靈芝（Ganoderma lucidumKarst）為多孔菌科靈芝屬真菌，藥用歷史悠久，具有安神寧心功效，常用于失眠的改善和治療。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載靈芝可“補肝氣，安精魂”[11]?！吨腥A人民共和國藥典》2020 版記載靈芝具有“補氣安神”功效，主治“心神不寧，失眠心悸”[12]。目前國內(nèi)以靈芝為主要原料的保健食品已達到1270 余種[13]，但以改善睡眠為主要功效的種類較少，且靈芝中改善睡眠的有效成分尚不明確，因此，明確靈芝中改善睡眠的有效成分對于開發(fā)改善睡眠的功能性食品具有重要意義。

靈芝富含三萜、多糖等活性化學成分[14]。現(xiàn)代藥理研究表明，靈芝具有抗氧化、抗腫瘤、抗衰老和降血脂等功能[15?16]。近年來研究發(fā)現(xiàn)靈芝水提物可通過增加小鼠腦內(nèi)GABA、5-HT 的含量來發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用[17]，以靈芝為原料制成的中成藥——靈芝糖漿能改善神經(jīng)衰弱造成的失眠，有良好的養(yǎng)心安神功效[18]。靈芝提取溶劑不同，則提取物中化學成分不同，且已有研究因動物模型、使用的生藥劑量及提取物劑量等的差異，難以對靈芝不同提取物的改善睡眠功效進行科學評價。本研究將采用相同動物模型，使用相同的生藥劑量評價靈芝醇提物、水提物和多糖的改善睡眠作用，以期為合理開發(fā)靈芝改善睡眠的功能性食品提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝子實體 金寨縣利民生物科技股份有限公司；SPF 級雄性ICR 小鼠（240 只，(18±2) g） 濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，許可證號SCXK（魯）2014-0007；羅通定片 四川迪菲特藥業(yè)有限公司；戊巴比妥鈉、巴比妥鈉 北京華業(yè)寰宇化工有限公司；BCA 蛋白濃度測定試劑盒 北京蘭杰柯科技有限公司公司；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid, GABA）、5-羥色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）、多巴胺（Dopamine, DA）、酶聯(lián)免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay, Elisa）試劑盒上海澤葉生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉、95%乙醇 國藥集團化學試劑有限公司。

W501 升降恒溫水浴鍋 申勝生物技術(shù)有限公司；DGF30/7-I 電熱鼓風干燥箱 南京實驗儀器廠；Hei-VAP Advantage 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 德國Heidolph 公司；FD-1A-50 冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；CT15RT 高速冷凍離心機 上海天美科學儀器有限公司；AL104 分析天平 美國梅特勒托利多公司；MDF-U73V 超低溫冰箱 日本SANYO 公司；MLS-3750 高壓蒸汽滅菌鍋 日本三洋電器株式會社。

1.2 實驗方法

1.2.1 靈芝子實體提取物的制備

1.2.1.1 靈芝子實體水提物的制備 稱取靈芝子實體干粉適量，按照料液比1:30（g/mL）加入去離子水，90 ℃水浴浸提2 h，浸提2 次后將濾液65 ℃減壓濃縮至一定體積后冷凍干燥得到靈芝子實體水提物（提取率為5.14%）[19]。

1.2.1.2 靈芝子實體醇提物的制備 稱取靈芝子實體干粉適量，按照料液比1:30（g/mL）加入95%乙醇，60 ℃水浴浸提2 h，浸提2 次，藥渣置于烘箱60℃干燥備用，醇提液65 ℃減壓濃縮至一定體積后烘干得到靈芝子實體醇提物（提取率為4.18%）[20]。

1.2.1.3 靈芝子實體多糖的制備 稱取制備靈芝子實體醇提物后干藥渣適量，按照料液比1:30（g/mL）加入去離子水，90 ℃水浴浸提2 h，浸提2 次后將濾液65 ℃減壓濃縮至一定體積，用終濃度為80%的乙醇進行醇沉，4 ℃下靜置24 h 后抽濾，沉淀冷凍干燥得到靈芝子實體多糖（提取率為1.06%）[21]。

1.2.2 動物分組 240 只ICR 小鼠飼養(yǎng)于SPF 級動物房（溫度(24±20) ℃，相對濕度50%～60%，明暗交替12 h），適應性飼養(yǎng)1 周后隨機分為3 個批次（n=80），第1 批進行直接睡眠實驗和延長戊巴比妥鈉睡眠實驗，第2 批進行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗，第3 批進行巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗。每批小鼠分為8 組（n=10），分別為正常對照組、陽性對照組、靈芝子實體水提物高劑量組（GLW-H）和低劑量組（GLW-L）、靈芝子實體醇提物高劑量組（GLE-H）和低劑量組（GLE-L）以及靈芝子實體多糖高劑量組（GLP-H）和低劑量組（GLP-L）。以《中華人民共和國藥典》2020 版中靈芝子實體的人體（60 kg）推薦攝入量（6～12 g/d）中值（9 g/d）的10 倍、20 倍為依據(jù)[15]，結(jié)合靈芝子實體不同提取物的提取率，確定靈芝子實體水提物低、高劑量組給藥濃度為77.1 mg/kg和154.2 mg/kg，醇提物低、高劑量組給藥濃度為62.7 mg/kg 和125.4 mg/kg，多糖低、高劑量組給藥濃度為15.9 mg/kg 和31.8 mg/kg。靈芝子實體不同提取物和陽性對照組藥物（羅通定片，15 mg/kg）溶劑為0.5%羧甲基纖維素鈉溶液[22]，按照10 mL/kg 劑量灌胃小鼠，正常對照組每日灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，連續(xù)灌胃30 d。

1.2.3 小鼠體重增長、臟器指數(shù)測定 第1 批小鼠實驗開始和結(jié)束時稱量小鼠體重，觀察各組小鼠實驗前后體重變化。體重增長計算公式：體重增長=小鼠灌胃第30 d 體重－小鼠灌胃第1 d 體重；第1 批小鼠實驗結(jié)束后，二氧化碳處死小鼠（處死前1 d 禁食不禁水），取小鼠肝、肺、脾、腎和胸腺并稱重。小鼠臟器指數(shù)計算公式：臟器指數(shù)=臟器重量（mg）/小鼠體重（g）。

1.2.4 直接睡眠實驗 灌胃1 h 內(nèi)觀察小鼠睡眠情況，以小鼠翻正反射消失1 min 為入睡指標，記錄各組入睡動物數(shù)及睡眠時間，觀察受試物對小鼠是否有直接睡眠作用[23]。

1.2.5 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗 預實驗確定小鼠戊巴比妥鈉注射劑量為38 mg/kg。末次灌胃30 min 后，給小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量為38 mg/kg，注射量為0.2 mL/只小鼠），觀察受試物能否延長小鼠睡眠時間以及各組小鼠睡眠時間的差異[23]。

1.2.6 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗 預實驗確定小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠劑量為24 mg/kg。末次灌胃 30 min 后，給各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量為24 mg/kg，注射量為0.2 mL/只小鼠），記錄30 min 內(nèi)各組入睡小鼠數(shù)量[23]。

1.2.7 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗 預實驗確定小鼠巴比妥鈉注射劑量為240 mg/kg。末次灌胃 30 min后，給各組小鼠腹腔注射巴比妥鈉（劑量為240 mg/kg，注射量為0.2 mL/只小鼠），觀察受試物能否縮短小鼠的睡眠潛伏期，比較各組小鼠入睡時間的差異[23]。

1.2.8 小鼠腦組織中GABA、5-HT 和DA 含量測定

第1 批小鼠實驗結(jié)束后，二氧化碳處死小鼠（處死前1 d 禁食不禁水），迅速取出腦組織，稱取一定腦組織于冰浴條件下用生理鹽水制備10%腦組織勻漿液，離心后取上清液，用BCA 試劑盒進行蛋白質(zhì)定量，然后按照ELISA 試劑盒說明書檢測小鼠腦組織中GABA、5-HT 和DA 的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS20.0 軟件統(tǒng)計分析，以均數(shù)±標準差（±sD）表示，應用LSD 檢驗各組實驗數(shù)據(jù)間的顯著性差異，采用Origin 2019 軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝子實體不同提取物對小鼠體重和臟器指數(shù)的影響

由表1 可知，給藥組小鼠與正常對照組小鼠體重增長無顯著性差異（P>0.05），即靈芝子實體提取物對小鼠的體重無影響；給藥組小鼠與正常對照組小鼠肝、肺、脾、腎和胸腺的臟器指數(shù)均無統(tǒng)計學差異（P>0.05），表明靈芝子實體提取物對小鼠臟器無毒害作用。

表1 靈芝子實體不同提取物對小鼠體重和臟器指數(shù)的影響Table 1 Effects of different extracts from Ganoderma lucidum fruit bodies on body weight and viscera index of mice

2.2 靈芝子實體不同提取物對小鼠直接睡眠的影響

觀察各組小鼠灌胃60 min 內(nèi)的活動情況。由表2 可知，各組小鼠活動正常，均無出現(xiàn)翻正消失，即靈芝子實體提取物對小鼠無直接催眠作用。

表2 靈芝子實體不同提取物對小鼠直接睡眠作用Table 2 Effects of different extracts from Ganoderma lucidum fruit bodies on the direct sleep of mice

2.3 靈芝子實體不同提取物對小鼠戊巴比妥鈉睡眠時間的影響

末次灌胃30 min 后，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量為38 mg/kg，注射量為0.2 mL/只小鼠），觀察小鼠睡眠狀態(tài)。由圖1 可知，陽性對照組較正

圖1 靈芝子實體不同提取物對小鼠延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響Fig.1 Effects of different extracts from Ganoderma lucidum fruit bodies on duration of sodium pentobarbital-induced sleep of mice

常對照組能顯著延長小鼠睡眠時間（P<0.05），睡眠時間延長了56.02%。靈芝子實體水提物、醇提物、多糖均能不同程度的延長小鼠睡眠時間，且睡眠延長時間與劑量呈正相關(guān)；與正常對照組比較，GLW-H、GLW-L、GLE-H、GLE-L、GLP-H 組均能顯著延長小鼠睡眠時間（P<0.05），分別延長了29.01%、18.96%、44.57%、23.90%和21.51%。三種提取物高劑量組之間小鼠睡眠時間比較：GLE-H 組較GLW-H 與GLP-H 組睡眠時間顯著提高（P<0.05）；GLW-H 與GLP-H 雖無顯著性差異（P>0.05），但GLW-H 組小鼠睡眠時間整體上較GLP-H 組有延長的趨勢。

2.4 靈芝子實體不同提取物對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠的影響

末次灌胃30 min 后，各組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（劑量為24 mg/kg，注射量為0.2 mL/只小鼠），觀察30 min 內(nèi)各組入睡小鼠的數(shù)量。由表3 可知，陽性對照組睡眠率為70%，較正常對照組有顯著提高（P<0.05）；與正常對照組比較，GLE-H 組睡眠率為60%，能顯著提高小鼠睡眠率（P<0.05），雖GLWH、GLW-L、GLE-L、GLP-H 組均能提高小鼠的睡眠率，但是并不具有顯著性差異（P>0.05）。

表3 靈芝不同提取物對小鼠戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗睡眠發(fā)生率的影響Table 3 Effects of different extracts from Ganoderma lucidum fruit bodies on the sleep rate of pentobarbital sodium subthreshold hypnotic experiment of mice

2.5 靈芝子實體不同提取物對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

末次灌胃30 min 后，各組小鼠腹腔注射巴比妥鈉（劑量為240 mg/kg，注射量為0.2 mL/只小鼠），觀察小鼠的入睡時間。由圖2 可知，陽性對照組較正常對照組小鼠睡眠潛伏期顯著縮短了45.03%（P<0.05），靈芝子實體水提物、醇提物、多糖均能不同程度的縮短小鼠睡眠潛伏期，且有一定的量效關(guān)系；與正常對照組比較，GLW-H、GLW-L、GLE-H、GLE-L、GLP-H 組均能顯著縮短小鼠睡眠潛伏期（P<0.05），分別縮短了24.87%、12.82%、31.92%、20.25%和17.67%。三種提取物高劑量組間小鼠睡眠潛伏期相比較：GLE-H 組小鼠睡眠潛伏期顯著短于 GLP-H 組（P<0.05） ； GLW-H 組 較 GLE-H 與GLP-H 組睡眠潛伏期均無顯著性差異（P>0.05），但通過比較睡眠潛伏期長短，發(fā)現(xiàn)降低小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的趨勢為：GLE-H>GLW-H>GLP-H。

圖2 靈芝子實體不同提取物對小鼠巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響Fig.2 Effects of different extracts from Ganoderma lucidum fruit bodies on latency of barbital sodium-induced sleep of mice

2.6 靈芝子實體不同提取物對小鼠腦組織中GABA、5-HT 和DA 含量的影響

由圖3 可知，陽性對照組較正常對照組小鼠腦組織中GABA、5-HT 含量顯著升高（P<0.05），分別增加了60.11%和51.48%；GLW-H、GLE-H、GLEL、GLP-H 組小鼠腦組織中GABA、5-HT 含量均有不同程度增加升高（P<0.05）。與正常對照組比較，GLW-H、GLE-H、GLE-L、GLP-H 組小鼠腦組織中GABA 含量分別增加了27.82%、41.53%、24.22%和21.54%，5-HT 含量分別增加了24.14%、33.11%、16.87%和16.77%。陽性對照組較正常對照組小鼠腦組織中DA 含量顯著下降（P<0.05），但靈芝子實體提取物各組與正常對照組小鼠腦組織中的DA 含量均無顯著性差異（P>0.05）。三種提取物高劑量組小鼠腦組織中GABA、5-HT 含量相比較：GLE-H 組較GLP-H 組顯著升高（P<0.05）；GLW-H 較GLEH 與GLP-H 無顯著性差異（P>0.05），但通過比較GABA、5-HT 含量，發(fā)現(xiàn)提升小鼠腦內(nèi)GLW-H 組小鼠腦內(nèi)GABA、5-HT 含量的趨勢為：GLE-H>GLW-H>GLP-H。

圖3 靈芝子實體不同提取物對小鼠腦組織中GABA、5-HT 和DA 含量的影響Fig.3 Effects of different extracts from Ganoderma lucidum fruit bodies on contents of GABA, 5-HT and DA in brain tissue of mice

3 討論與結(jié)論

近年來探討中藥對睡眠的研究越來越受到人們的重視，如五味子、黃精、巴戟天通過調(diào)節(jié)腦中GABA、5-HT 含量改善小鼠睡眠[24?26]。靈芝多糖可能通過上調(diào)大鼠血清和腦組織中TNF-α含量從而增加了非快速眼動睡眠時長[27]，靈芝孢子粉和三萜和多糖也有一定的改善睡眠作用[28?29]，但是并沒有對靈芝子實體不同提取物在同一生藥劑量下進行系統(tǒng)性評價。

研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)遞質(zhì)與睡眠的關(guān)系密不可分。GABA 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與受體GABAA、GABAB受體結(jié)合起到鎮(zhèn)靜、抗焦慮的作用，是臨床上用于治療失眠癥的部分藥物的目標靶點[30?31]。哺乳動物腦組織中5-HT 主要存在于中縫背核中，可調(diào)節(jié)睡眠-覺醒電路，其含量增加可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮，起到促進睡眠的作用[32?33]。DA 在人體中起著情緒調(diào)節(jié)、睡眠覺醒等作用[34?35]，現(xiàn)代臨床常用DA 受體拮抗劑作為鎮(zhèn)靜劑[36]。因此腦組織中GABA、5-HT 和DA 含量的變化對睡眠具有重要影響。

本實驗結(jié)果表明靈芝子實體不同提取物對小鼠體重增長、臟器指數(shù)無明顯影響，且無直接睡眠作用（P>0.05）。因靈芝子實體不同提取物的主要成分不同，故對小鼠改善睡眠的效果不一致。從延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、降低巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗結(jié)果 發(fā)現(xiàn)GLW-H、GLW-L、GLE-H、GLE-L 與GLP-H 都呈陽性，但具有一定差異，其改善睡眠功效總體趨勢為： GLE-H>GLW-H>GLE-L>GLP-H>GLW-L。可見，靈芝子實體提取物的高劑量組改善睡眠效果均優(yōu)于相同提取物的低劑量組，且在相同生藥劑量下改善睡眠功效總體趨勢為靈芝子實體醇提物最佳，水提物次之，隨后是靈芝子實體多糖。本研究中靈芝子實體醇提物主要成分為靈芝三萜，水提物中包含靈芝多糖和靈芝酸等成分，靈芝酸屬于靈芝三萜類物質(zhì)，預計靈芝三萜發(fā)揮主要的改善睡眠功效。靈芝三萜在體外實驗中被證明與GABAA受體具有一定強度親和力，可能通過GABAA受體增強GABA 能神經(jīng)元從而改善睡眠[37]。俞盈等[38]研究結(jié)果表明，100 mg/kg 的靈芝三萜酸促睡眠效果強于陽性藥地西泮（2.5 mg /kg），說明靈芝三萜酸具有顯著的改善睡眠的作用。為了探究靈芝子實體提取物改善睡眠的作用機制，檢測了小鼠腦組織中GABA、5-HT 與DA 的含量，發(fā)現(xiàn)GLW-H、GLE-H、GLE-L和GLP-H 組對小鼠腦內(nèi)DA 含量無顯著影響（P>0.05），但能顯著提升GABA、5-HT 含量（P<0.05），其中GLE-H 對小鼠腦內(nèi)GABA 和5-HT 含量提升效果最佳。

綜上所述，靈芝子實體水提物、醇提物和多糖均具有一定的改善睡眠作用，在相同生藥劑量下總體趨勢為：靈芝子實體醇提物>靈芝子實體水提物>靈芝子實體多糖，其改善睡眠作用可能與上調(diào)小鼠腦內(nèi)GABA、5-HT 含量有關(guān)。有研究表明靈芝多糖可過增強大鼠腦內(nèi)GABA 能神經(jīng)元和5-HT 能神經(jīng)元，增加了非快速眼動睡眠期間δ波時長起到改善睡眠的作用[39]。本研究中靈芝子實體多糖對小鼠睡眠的改善同樣具有一定的統(tǒng)計學意義，未來將對靈芝三萜和靈芝子實體多糖關(guān)于改善睡眠是否具有協(xié)同作用進行深入研究。