甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)子葉形胚發(fā)育成苗研究

萬(wàn)麗麗，王轉(zhuǎn)茸，徐 義，康 雷，楊光圣，辛 強(qiáng)，洪登峰，孫玉宏

（1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所，武漢 430085；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

1982年德國(guó)的Lichter首次報(bào)道從甘藍(lán)型油菜中成功分離游離小孢子，并利用小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)單倍體繼而加倍獲得雙單倍體（DHs）［1］。基因型、供體材料的生長(zhǎng)環(huán)境，小孢子發(fā)育階段、培養(yǎng)基成分以及不同脅迫處理是影響小孢子細(xì)胞胚發(fā)生以及再生的關(guān)鍵因素［2，3］。研究表明，調(diào)整培養(yǎng)基中的滲透壓能提高胚發(fā)生，32℃熱激處理小孢子細(xì)胞24～72 h能促進(jìn)胚的再生。熱激處理前將小孢子置于4℃處理24～48 h能增強(qiáng)小孢子的胚發(fā)生［4，5］。此外，在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中提高蔗糖的濃度、施加活性炭以及秋水仙堿能有效提高小孢子胚再生［6，7］。小孢子培養(yǎng)后得到的胚大多數(shù)是球形胚、心型胚或者類似于胚的結(jié)構(gòu)（Embryo-like structures，ELS），只有少數(shù)是子葉胚。子葉胚在成苗培養(yǎng)基上能夠快速生長(zhǎng)獲得生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)、根系發(fā)達(dá)的植株，通常稱其為高質(zhì)量胚，而其他類型的胚以及類似于胚的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上難以一次成苗，甚至褐化死亡。Kim等［8］建立了辣椒小孢子預(yù)培養(yǎng)體系，促使250 000個(gè)小孢子再生得到294.6個(gè)胚。但由于大多數(shù)胚是球形胚和類似于胚的結(jié)構(gòu)，必須轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上才能成苗。這個(gè)過(guò)程耗時(shí)費(fèi)力，限制了這類胚在育種和遺傳轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中的應(yīng)用［9，10］。為能快速獲得子葉胚，研究者對(duì)培養(yǎng)基中碳源、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、脯氨酸和維生素C含量等因素進(jìn)行篩選，確定有利于子葉胚發(fā)育的因素［11-13］。Irikova等［14］研究認(rèn)為，小孢子再生得到子葉胚取決于2個(gè)關(guān)鍵過(guò)程，一是小孢子細(xì)胞分裂誘導(dǎo)發(fā)生過(guò)程，二是分裂后繼續(xù)向胚發(fā)生過(guò)程。調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素比例能夠協(xié)調(diào)這2個(gè)遞進(jìn)發(fā)育過(guò)程［15］。此外，還需要在球形胚階段前應(yīng)用ABA以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)促進(jìn)合子胚和體細(xì)胞胚的發(fā)生［16］。

盡管甘藍(lán)型油菜中已經(jīng)建立了小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系，并成功應(yīng)用到重要農(nóng)藝性狀QTLs定位、小孢子胚遺傳轉(zhuǎn)化、雙單倍體的育種實(shí)踐，但不同基因型油菜小孢子培養(yǎng)獲得子葉胚的能力還是存在很大差別。為探索油菜小孢子培養(yǎng)中高質(zhì)量子葉胚發(fā)生的培養(yǎng)體系，本研究在3個(gè)不同基因型的F1雜交組合小孢子培養(yǎng)階段，設(shè)置不同培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基內(nèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和活性炭濃度等處理，篩選評(píng)價(jià)獲得能產(chǎn)生子葉胚的培養(yǎng)基以及培養(yǎng)方式，以期為甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

將3個(gè)油菜F1雜交組合6R×ZS11、7DH×ZS11、ZR×R11種植在田間，每個(gè)組合種植6行，共計(jì)50個(gè)單株。蕾薹期噴施葉面肥，提高抗逆能力，預(yù)防早衰，防控菌核病。

1.2 方法

1.2.1 小孢子的分離和收集 在田間摘取3個(gè)油菜F1雜交組合材料的主花序和分支的花蕾，放入事先鋪上潤(rùn)濕濾紙的塑料盒中。將塑料盒置于4℃展示柜中1 d，次日選取長(zhǎng)度3.0～4.2 mm油菜花蕾，此時(shí)雄蕊中的小孢子處于單核晚期至二核小孢子早期，將30～40個(gè)花蕾置于50%（V/V）次氯酸鈉溶液中滅菌10 min，之后轉(zhuǎn)移到無(wú)菌ddH2O中浸泡3次，每次10 min。將滅菌處理后的花蕾放入50 mL無(wú)菌離心管中，加入10 mL小孢子抽提緩沖液，用研磨棒擠壓花蕾，使得小孢子從雄蕊中釋放到抽提緩沖液中，補(bǔ)充抽提緩沖液定容到40 mL。含有小孢子的抽提緩沖液經(jīng)過(guò)75μm的過(guò)濾網(wǎng)過(guò)濾，通過(guò)過(guò)濾網(wǎng)去除研磨后顆粒較大的花蕾組織，收集過(guò)濾后的液體，置于控溫15℃離心機(jī)中700 r/min離心5 min，保留沉淀物，去除上層液體，加入40 mL抽提緩沖液，輕輕垂懸沉淀中的小孢子細(xì)胞，置于控溫15℃離心機(jī)中700 r/min再次離心5 min，收集小孢子細(xì)胞，用NLNM液體培養(yǎng)基（根據(jù)NLN13培養(yǎng)基修改，見(jiàn)表1）輕輕垂懸后沉淀進(jìn)入下一步試驗(yàn)。

表1 NLNM培養(yǎng)基組成成分及配制流程

1.2.2 小孢子預(yù)培養(yǎng) 將收集得到的小孢子細(xì)胞用NLNM液體培養(yǎng)基垂懸后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀將小孢子細(xì)胞數(shù)調(diào)整為20×104個(gè)/mL，每個(gè)直徑為60 mm×20 mm培養(yǎng)皿中加入10～12 mL小孢子懸浮液體，培養(yǎng)皿用Parafilm封口，置于（31±1）℃培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)48 h。

1.2.3 小孢子再生培養(yǎng) 將“1.2.2”步驟中的小孢子液體置于離心溫度為15℃的離心機(jī)中500 r/m離心5 min，收集得到的小孢子按照1×104個(gè)/mL的密度調(diào)整。取調(diào)整密度后的小孢子懸浮液5 mL加入到直徑60 mm×15 mm的培養(yǎng)皿中，之后補(bǔ)充10 mL的NLNM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿用Parafilm封口，置于塑料容器中，在25℃下暗培養(yǎng)2周。將小孢子懸浮培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到配制固液雙層培養(yǎng)基的90 mm×15 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)生長(zhǎng)。固液雙層培養(yǎng)基的組成：上層是NLN13液體培養(yǎng)基，下層是由B5基本培養(yǎng)基+0.1%活性炭+0.25 mg/L 6-BA+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel（pH為5.85，高溫滅菌）。為保證小孢子懸浮液能夠均勻分散在上層液體培養(yǎng)基中，上層NLN13液體培養(yǎng)基體積與轉(zhuǎn)移的小孢子懸浮液的體積為1∶1。小孢子細(xì)胞在固-液雙層培養(yǎng)基上置于25℃暗培養(yǎng)2周，其中每1～2周補(bǔ)充NLN13液體培養(yǎng)基5 mL。當(dāng)胚大小肉眼可見(jiàn)，將含有固-液雙層培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿置于23℃暗室內(nèi)的搖床上培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為25 r/min。如果再生得到的胚是子葉胚，直接挑選出來(lái)轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基，再生培養(yǎng)基的組成成分是B5基本培養(yǎng)基+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel的固體培養(yǎng)基。如果再生的胚屬于非子葉胚（球形胚、心型胚或者類似于胚的結(jié)構(gòu)），用滅菌的小勺子將這類胚轉(zhuǎn)移平鋪到再生培養(yǎng)基上，加入5～10 mL NLN13液體培養(yǎng)基淺層覆蓋胚組織，培養(yǎng)3～4周，每周及時(shí)補(bǔ)充NLN13液體培養(yǎng)基保證胚組織處于被淺層覆蓋狀態(tài)。

1.2.4 小孢子植株再生 經(jīng)過(guò)4周培養(yǎng)后，將正常的子葉胚（含有胚根、下胚軸以及2片對(duì)稱子葉）轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基B5基本培養(yǎng)基+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel的固體培養(yǎng)基。在室內(nèi)培養(yǎng)溫度25℃，光周期為16 h光照/8 h黑暗，其中每一層的光合作用光子通量密度PPFD為100μmol/（m·s）。在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)6～8周后轉(zhuǎn)移到土缽中生長(zhǎng)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010軟件計(jì)算平均值，SPSS 13.0軟件進(jìn)行方差分析，新復(fù)數(shù)極差法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 固液雙層培養(yǎng)基與液體培養(yǎng)基上再生胚的比較

統(tǒng)計(jì)分析不同品系的小孢子細(xì)胞在固液雙層培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基上的出胚數(shù)和高質(zhì)量子葉胚數(shù)目的差異（圖1），結(jié)果顯示，3個(gè)品系在液體培養(yǎng)基中的出胚總數(shù)高于固液雙層培養(yǎng)基；3個(gè)品系在固液雙層培養(yǎng)中子葉胚數(shù)占總出胚數(shù)的72.1%、87.0%和85.6%，高于液體培養(yǎng)基上子葉胚數(shù)目，并且差異顯著（圖2）。

圖1 在液體培養(yǎng)基和固液雙層培養(yǎng)基上甘藍(lán)型油菜小孢子出胚情況

圖2 3個(gè)甘藍(lán)型油菜品系小孢子在液體以及固液雙層培養(yǎng)基上的出胚數(shù)目及子葉胚比率

2.2 不同振蕩周期培養(yǎng)后的出胚類型以及數(shù)目的分析

選取60個(gè)花蕾分離的小孢子在25℃暗培養(yǎng)2周，之后轉(zhuǎn)移到固液雙層培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)皿置于轉(zhuǎn)速為25 r/min的搖床上分別培養(yǎng)1周、2周、3周，培養(yǎng)溫度為25℃，統(tǒng)計(jì)球型或者心型胚、子葉型胚、類似于胚結(jié)構(gòu)的數(shù)目。結(jié)果顯示，振蕩培養(yǎng)1周后的子葉型胚數(shù)比未振蕩培養(yǎng)的子葉型胚數(shù)多，球型或者心型胚的數(shù)目顯著減少（圖3）。

圖3 固液雙層培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)對(duì)出胚的影響

2.3 培養(yǎng)溫度與子葉胚產(chǎn)生的相關(guān)性分析

將在25℃下暗培養(yǎng)2周的小孢子轉(zhuǎn)移到不同溫度（25、23、21、19、17℃）下先振蕩培養(yǎng)1周，之后在相應(yīng)溫度下繼續(xù)靜置培養(yǎng)3周，統(tǒng)計(jì)出胚總數(shù)以及子葉胚數(shù)（表2）。結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)溫度的降低，平均60個(gè)花蕾的出胚總數(shù)在降低，在培養(yǎng)溫度從21℃降低到17℃時(shí)，出胚總數(shù)相比在25℃培養(yǎng)溫度下出胚數(shù)目分別減少了47.2%、71.5%、79.1%。對(duì)不同培養(yǎng)溫度下子葉胚數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，在23℃培養(yǎng)條件下正常子葉胚的數(shù)目占出胚總數(shù)的62.1%，顯著高于其他培養(yǎng)溫度下的子葉胚數(shù)目。

表2 不同培養(yǎng)溫度對(duì)小孢子胚發(fā)育的影響

2.4 固液雙層培養(yǎng)基上不同濃度活性炭對(duì)子葉胚數(shù)的影響

為提高子葉胚數(shù)目，通過(guò)設(shè)置雙層培養(yǎng)基中固體成分中活性炭的濃度梯度，篩選最優(yōu)活性炭的濃度（表3）。試驗(yàn)結(jié)果顯示，在添加0.10%活性炭的固液雙層培養(yǎng)基中子葉胚數(shù)最多，顯著性高于其他濃度的培養(yǎng)基。

表3 不同濃度活性炭對(duì)小孢子出胚數(shù)和子葉胚數(shù)的影響

2.5 不同濃度6-BA對(duì)小孢子出胚的影響

在固液雙層培養(yǎng)基上，添加不同濃度6-BA后統(tǒng)計(jì)小孢子出胚數(shù)和子葉胚數(shù)，結(jié)果顯示，在0.256 mg/L 6-BA處理后，平均60個(gè)花蕾的出胚總數(shù)最多，達(dá)到97.2個(gè)，顯著高于其他處理濃度下的出胚總數(shù)，并且高質(zhì)量子葉胚數(shù)目也最多，與其他處理差異顯著（表4）。

表4 不同濃度6-BA處理下小孢子出胚數(shù)和子葉胚數(shù)

2.6 不同類型的胚在生根培養(yǎng)基上一次性成苗率分析

將子葉胚轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基B5基本培養(yǎng)基+3%（m/V）蔗糖+0.5%Phytagel的固體培養(yǎng)基，將球型或心型胚以及類似于胚的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到上述固體培養(yǎng)后加入淺層NLN13培養(yǎng)基，將這類非子葉胚覆蓋。生長(zhǎng)4周后統(tǒng)計(jì)上述主要3種類型的胚直接轉(zhuǎn)化成植株，形成次生胚后轉(zhuǎn)化成植株，形成愈傷組織后轉(zhuǎn)化成植株以及胚褐化死亡的數(shù)目（表5）。結(jié)果顯示，3個(gè)品系中的子葉胚直接轉(zhuǎn)化成植株的數(shù)目顯著高于球型或心型胚以及類似于胚的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化成植株的數(shù)目，在培養(yǎng)基中子葉胚死亡數(shù)目顯著低于類似于胚結(jié)構(gòu)的死亡數(shù)。

表5 3個(gè)甘藍(lán)型油菜品系不同類型胚轉(zhuǎn)化成植株的數(shù)量

3 討論與結(jié)論

小孢子培養(yǎng)所得到的愈傷和胚進(jìn)一步成苗的能力取決于培養(yǎng)基的成分。相比液體培養(yǎng)基，在固體培養(yǎng)基上所得到的胚生活力和成苗的能力更強(qiáng)。本研究結(jié)果得出，3個(gè)F1家系在液體培養(yǎng)基上所得到的胚大多數(shù)是球形或者類似于胚的結(jié)構(gòu)，子葉胚數(shù)目較少，而在固-液雙層培養(yǎng)基上能夠產(chǎn)生大量的子葉胚。前人采用雙層培養(yǎng)基通常是組成成分相同的液體和固體培養(yǎng)基［17，18］，而本試驗(yàn)中所配制的雙層培養(yǎng)基中下層的固體成分由B5、活性炭以及6-BA組成，上層液體培養(yǎng)基由NLN13組成，這樣的雙層培養(yǎng)基中子葉胚出胚率高。液體培養(yǎng)基中胚的產(chǎn)量高，而在固體培養(yǎng)基上胚的質(zhì)量?jī)?yōu)。Li等［19］研究中發(fā)現(xiàn)，將大麥的小孢子細(xì)胞在液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3周，將類似于胚的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)3周，再生獲得胚的數(shù)目顯著高于在液體培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)6周所得數(shù)目，并且直徑大于1.5 mm的胚數(shù)目多，更容易進(jìn)一步發(fā)育成苗。在本研究中發(fā)現(xiàn)，雖然固-液雙層培養(yǎng)基上所得到的胚總數(shù)目少于液體培養(yǎng)基，但是子葉胚的數(shù)目在總數(shù)中所占比率顯著增加。相比固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，小孢子細(xì)胞在液體中培養(yǎng)更容易產(chǎn)生愈傷組織，可能是由于液體培養(yǎng)基較好的流動(dòng)性使小孢子細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)緊密接觸的同時(shí)，也受到了有害物質(zhì)或者生長(zhǎng)抑制物的干擾，有部分聚集在培養(yǎng)皿底部的胚生長(zhǎng)緩慢，甚至死亡［20，21］。為改良小孢子細(xì)胞發(fā)育的生長(zhǎng)環(huán)境，可不斷更新液體培養(yǎng)基和降低培養(yǎng)溫度等方法來(lái)減少抑制物的產(chǎn)生。小孢子胚發(fā)生過(guò)程受到乙烯、ACC（乙烯合成的前導(dǎo)物質(zhì)）以及乙烯利等抑制物質(zhì)的脅迫，人為施加乙烯合成抑制劑如活性炭能夠促進(jìn)胚發(fā)生［22］。此外，芥菜型油菜小孢子培養(yǎng)中加入PCIB等拮抗乙烯產(chǎn)生的物質(zhì)后能產(chǎn)生大量的檸檬型胚、香蕉型胚或者飛碟型胚，證明了抑制了乙烯的產(chǎn)生也會(huì)抑制子葉的延伸和正常生長(zhǎng)。根據(jù)小孢子細(xì)胞發(fā)育的時(shí)期，調(diào)整合適濃度的活性炭以及PCIB等成分保證了出胚數(shù)目和胚的質(zhì)量［23］。

本研究通過(guò)兩步法培養(yǎng)（先液體培養(yǎng)后固液雙層培養(yǎng)）油菜小孢子細(xì)胞具有3個(gè)方面的優(yōu)勢(shì)：①NLNM液體培養(yǎng)基促進(jìn)小孢子細(xì)胞的胚誘導(dǎo)發(fā)生。②在固液雙層培養(yǎng)基上能夠經(jīng)過(guò)固體培養(yǎng)基上的活性炭吸附液體培養(yǎng)基中釋放的有害物質(zhì)，同時(shí)不影響液體培養(yǎng)基對(duì)小孢子胚的營(yíng)養(yǎng)供給；經(jīng)過(guò)振蕩培養(yǎng)起到增氧的作用，固體培養(yǎng)基中添加的6-BA為小孢子胚的發(fā)育提供基本的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)；將液體培養(yǎng)基中小孢子再生的胚轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)基上后可以在獲得更多營(yíng)養(yǎng)的同時(shí)稀釋培養(yǎng)液中的有毒物質(zhì)。③培養(yǎng)小孢子細(xì)胞2～3周后降低培養(yǎng)溫度，雖然會(huì)抑制胚前發(fā)育階段，但是對(duì)胚后發(fā)育階段有利，有助于小孢子胚從圓形結(jié)構(gòu)向球型胚階段轉(zhuǎn)化，有效提高胚的質(zhì)量，同時(shí)能夠促進(jìn)胚向植株的轉(zhuǎn)變。

綜上所述，本研究中所建立的油菜高質(zhì)量子葉胚培養(yǎng)的技術(shù)體系既能提高出胚數(shù)量，同時(shí)還能保證子葉胚，提高了小孢子培養(yǎng)獲得雙單倍體的效率。