強(qiáng)心一號(hào)配方對(duì)膿毒癥小鼠海馬區(qū)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響

王雪蕊 劉清泉 徐霄龍 白云靜 哈雁翔 郭玉紅

摘要 目的：探討強(qiáng)心一號(hào)配方對(duì)膿毒癥小鼠認(rèn)知功能障礙和海馬區(qū)神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響。方法：將60只C57BL/6小鼠分為假手術(shù)組、模型組、強(qiáng)心組，每組20只。模型組和強(qiáng)心組采取盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）制備膿毒癥模型。強(qiáng)心組于術(shù)后2 h給予強(qiáng)心一號(hào)配方灌胃治療，濃度為1 g/kg體質(zhì)量，模型組和假手術(shù)組分別給予1 mL生理鹽水灌胃治療。術(shù)后10 d采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）檢測(cè)小鼠海馬組織中炎癥介質(zhì)蛋白表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)海馬組織炎癥介質(zhì)基因表達(dá)水平。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組Morris水迷宮逃避潛伏期和目標(biāo)象限的時(shí)間顯著降低，海馬組織中白細(xì)胞介素1-β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）蛋白和基因表達(dá)水平顯著增高（P<0.05）;與模型組比較，強(qiáng)心組逃避潛伏期和目標(biāo)象限時(shí)間顯著升高，海馬組織IL-1β和TNF-α蛋白和基因表達(dá)水平顯著下降（P<0.05）。各組小鼠Morris水迷宮游泳速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：強(qiáng)心一號(hào)配方對(duì)CLP小鼠認(rèn)知功能障礙具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與減輕海馬區(qū)神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 膿毒癥;中藥;強(qiáng)心一號(hào)配方;認(rèn)知功能;水迷宮;海馬;炎癥介質(zhì);神經(jīng)炎癥

Abstract Objective：To investigate the effects of Qiang-xin1 Formula on cognitive dysfunction and neuroinflammation in hippocampus of sepsis mice.Methods：A total of 60 healthy male C57BL/6 mice were selected as the research objects and were randomly divided into a sham group，a model group and a Qiang-xin1 group，with 20 cases in each group.Cecal ligation and puncture （CLP） was used to establish sepsis model in model group and Qiang-xin1 group.Two hours after operation，1g/kg·bw of Qiang-xin1 Formula was orally administrated in the Qiang-xin1 group，and 1 mL of normal saline was orally administrated in the model group and the sham operation group.Morris water maze test was used to evaluate the spatial learning and memory ability in CLP mice 10 days after surgery.ELISA was used to detect the protein levels of inflammatory factors in the hippocampus of mice.Realtime PCR was used to detect the expression of inflammatory factors in the hippocampus.Results：Compared with the sham group，the escape latency and the time in the target quadrant accessed by Morris water maze test were significantly reduced in the model group.The protein and gene levels of IL-1 β，IL-6，TNF-α in the hippocampus were significantly increased （P<0.05） in the model group.Compared with the model group，the escape latency and the time in the target quadrant accessed by Morris water maze test were significantly increased in Qiang-xin1 group （P<0.05）.The protein and gene levels of IL-1β and TNF-α were significantly down-regulated in Qiang-xin1 group （P<0.05）.The swimming speed in the Morris water maze test showed no difference among each groups.Conclusion：Qiang-xin1 Formula has protective effect on cognitive dysfunction in CLP mice，and the mechanism may be related to the reduced neuroinflammation in the hippocampus.

Keywords Sepsis; Chinese Medicinal; Qiang-xin1 Formula; Cognitive function; Morris water maze; Hippocampus; Inflammatory Factor; Neuroinflammation

中圖分類號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.14.008

膿毒癥是指宿主對(duì)微生物感染的應(yīng)答反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的多器官功能障礙[1]，是導(dǎo)致重癥監(jiān)護(hù)病房（Intensive Care Unit，ICU）患者死亡的“頭號(hào)殺手”[2]。膿毒癥患者常伴隨大腦的局灶性或者彌漫性的功能障礙，出現(xiàn)如注意力缺乏、譫妄、昏迷、認(rèn)知功能異常等一系列臨床綜合征，被稱為膿毒癥相關(guān)性腦病（Sepsis-associated Encephalopathy，SAE）。ICU患者中SAE的發(fā)病率高達(dá)70%以上[3]，SAE是膿毒癥患者死亡的危險(xiǎn)因素[4]。不僅如此，幸存的膿毒癥患者多伴有遠(yuǎn)期認(rèn)知障礙、抑郁癥、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙和記憶存儲(chǔ)損傷等遠(yuǎn)期神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，是導(dǎo)致生命質(zhì)量下降和醫(yī)療成本增加的主要原因[5]。因此，及時(shí)有效地預(yù)防和治療SAE對(duì)于改善膿毒癥患者的生存率和提高生命質(zhì)量至關(guān)重要。本課題組在多年治療膿毒癥的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)下，總結(jié)明確了強(qiáng)心一號(hào)配方對(duì)膿毒癥小鼠的療效[6-7]。本研究觀察強(qiáng)心一號(hào)配方對(duì)膿毒癥小鼠認(rèn)知功能損害和海馬區(qū)神炎癥反應(yīng)的影響，為強(qiáng)心一號(hào)配方的臨床應(yīng)用提供理論證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 本研究所用SPF級(jí)動(dòng)物均采購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司（生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2014-0004，使用許可證號(hào)：SCXK（京）2015-0023）。動(dòng)物為C57BL/6J背景小鼠，60只，雄性，鼠齡10～12周，體質(zhì)量20～23 g，各組小鼠自由進(jìn)水進(jìn)食，保持室溫恒定，由北京中醫(yī)醫(yī)院研究所按純系動(dòng)物要求專人飼養(yǎng)。

1.1.2 藥物 強(qiáng)心一號(hào)配方中藥物均由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。組成包括：水紅花子30 g、黃芪30 g、茯苓20 g、丹參20 g、五味子10 g。藥物煎煮方法同既往文獻(xiàn)[6-7]。

1.1.3 試劑與儀器 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega，美國(guó)，批號(hào)：A3500），實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒（TaKaRa，日本，批號(hào)RR047A），小鼠白細(xì)胞介素-6（IL-6，批號(hào)：M6000B）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α，批號(hào)：MTA00B）和白細(xì)胞介素-1β（IL-1β，批號(hào)：MLB00C）均購(gòu)于美國(guó)R&D公司，戊巴比妥鈉（上海榕柏生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：57-33-0）。Morris水迷宮（Styling，美國(guó)，型號(hào)：LM-WM0010），Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)（Supermaze，美國(guó)，型號(hào)：XR-XM101），Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀（Bio-Rad，美國(guó)，型號(hào)：ABI7500），臺(tái)式離心機(jī)（BECKMAN，美國(guó)，型號(hào)：Allegra X-30R），酶標(biāo)儀（Biotek，美國(guó)，型號(hào)：ELx808）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和強(qiáng)心組，每組20只。模型組和強(qiáng)心組小鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）復(fù)制膿毒癥動(dòng)物模型。采用1%戊巴比妥鈉對(duì)動(dòng)物進(jìn)行腹腔麻醉后，行手術(shù)操作，假手術(shù)組小鼠行假手術(shù)操作，方法同既往文獻(xiàn)報(bào)道[7-8]。術(shù)后各組小鼠自由進(jìn)水進(jìn)食，保持室溫恒定。

1.2.2 給藥方法 強(qiáng)心組于造模后2 h開(kāi)始給予1 g/kg體質(zhì)量強(qiáng)心一號(hào)配方灌胃，1次/d，時(shí)間為每天8：00-10：00，灌胃體積為1 mL。模型組和假手術(shù)組于造模術(shù)后2 h開(kāi)始給予1 mL生理鹽水灌胃，1次/d，時(shí)間為每天8：00-10：00。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 認(rèn)知功能測(cè)定 采用Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力。該試驗(yàn)包括定位航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。水迷宮試驗(yàn)在直徑100 cm、高度40 cm的圓形水箱中進(jìn)行。水溫維持在（22±1）℃，分為東北、西北、東南、西南4個(gè)象限。一個(gè)可移動(dòng)的隱蔽平臺(tái)（直徑5 cm）被放置在目標(biāo)象限（東北方向）水面以下0.5 cm的深處。每次調(diào)試完設(shè)備后，于上午8：30正式開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。假手術(shù)組、模型組、強(qiáng)心組小鼠各20只，依次進(jìn)行試驗(yàn)。定位航行試驗(yàn)：各組小鼠于CLP術(shù)后第6天開(kāi)始訓(xùn)練試驗(yàn)，每只老鼠連續(xù)訓(xùn)練4 d，每天接受3次訓(xùn)練。給小鼠90 s的時(shí)間來(lái)尋找平臺(tái)。小鼠一旦定位到水下平臺(tái)，就可以在平臺(tái)上停留10 s。期間攝像自動(dòng)記錄每只小鼠逃避潛伏期和游泳速度。每次訓(xùn)練試驗(yàn)結(jié)束后小鼠被放回籠子里休息10 min后開(kāi)始下1次訓(xùn)練?？臻g探索試驗(yàn)：在訓(xùn)練的5 d（CLP術(shù)后第10天）通過(guò)移除平臺(tái)進(jìn)行探索試驗(yàn)，允許小鼠自由游泳90 s，攝像自動(dòng)記錄各小鼠在目標(biāo)象限的時(shí)間。

1.2.3.2 海馬組織炎癥介質(zhì)蛋白水平檢測(cè) 于CLP造模后第10天，采用隨機(jī)數(shù)字表法將檢測(cè)完Morris水迷宮的假手術(shù)組、模型組、強(qiáng)心組小鼠各選出10只。動(dòng)物麻醉后進(jìn)行斷頭處理，小鼠腦組織放于冰盒上并迅速分離海馬組織，經(jīng)液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）參照試劑盒步驟對(duì)海馬組織中炎癥介質(zhì)的水平進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.3.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)海馬組織炎癥介質(zhì)mRNA表達(dá)水平 于CLP造模后第10天，將剩余測(cè)完Morris水迷宮的假手術(shù)組、模型組、強(qiáng)心組小鼠各10只，采用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，用含有肝素的0.9%氯化鈉溶液灌注心臟，然后進(jìn)行斷頭處理。小鼠腦組織放于冰盒上并迅速分離海馬組織，經(jīng)液氮快速冷凍后轉(zhuǎn)入-80 ℃保存，待檢測(cè)。按照說(shuō)明書(shū)利用Trizol法提取細(xì)胞總RNA。將總RNA提取、測(cè)濃度、反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn)。小鼠IL-6、IL-1β、TNF-α和GAPDH引物均通過(guò)Premier3軟件設(shè)計(jì)，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度同既往文獻(xiàn)[7]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。Morris水迷宮數(shù)據(jù)采用多因素重復(fù)測(cè)量方差分析。其他數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），方差齊時(shí)采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠認(rèn)知功能比較 1）定位航行試驗(yàn)：重復(fù)測(cè)量方差分析檢測(cè)時(shí)間和分組之間存在交互作用（F=21.3，P<0.01），各組小鼠逃避潛伏期隨時(shí)間變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=209.69，P<0.05），逃避潛伏期根據(jù)分組變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=213.59，P<0.05）。與假手術(shù)組比較，模型組小鼠逃避潛伏期顯著增加（P<0.05）;與模型組比較，強(qiáng)心組大鼠逃避潛伏期明顯縮短（P<0.05）。見(jiàn)圖1A和表1。各組小鼠的游泳速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1B和表2。2）空間探索試驗(yàn)：與假手術(shù)組比較，模型組小鼠在平臺(tái)所在目標(biāo)象限時(shí)間百分比顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，強(qiáng)心組小鼠在目標(biāo)象限時(shí)間百分比顯著增加（P<0.05）。見(jiàn)圖1C。

2.2 各組小鼠海馬組織IL-1β、TNF-α和IL-6基因及蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組海馬組織中炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α和IL-6的蛋白和基因表達(dá)水平均顯著增高（P<0.05）;與模型組比較，強(qiáng)心組海馬組織中IL-1β和TNF-α的蛋白和基因表達(dá)水平顯著下降（P<0.05），IL-6的蛋白和基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著變化。見(jiàn)圖2～3。

3 討論

膿毒癥的高致病率和高死亡率一直是全球面臨的重大難題，據(jù)統(tǒng)計(jì)據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)，全球每年有2 100萬(wàn)膿毒癥患者[1]，ICU出院后的膿毒癥患者1年病死率高達(dá)40%[9]，5年病死率高達(dá)80%[10]。SAE患者住院期間都常出現(xiàn)譫妄、煩躁、嗜睡、昏睡等腦功能障礙的臨床癥狀，出院后有較高的失語(yǔ)、抑郁、認(rèn)知功能障礙的風(fēng)險(xiǎn)。研究表明，膿毒癥患者出現(xiàn)情緒及認(rèn)知功能障礙的概率是正常人的3倍，約25%的膿毒癥患者在出院后1年內(nèi)出現(xiàn)認(rèn)知障礙，約70%的患者在ICU出院后1年出現(xiàn)認(rèn)知障礙[11-12]。認(rèn)知功能障礙不僅影響患者生命質(zhì)量，同時(shí)需要更多的康復(fù)治療及護(hù)理[13]，給家庭和社會(huì)帶來(lái)長(zhǎng)期的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。尋找有效的改善SAE認(rèn)知功能障礙的治療方式具有重大意義。

SAE患者出現(xiàn)神志癥狀和認(rèn)知功能障礙，可屬中醫(yī)學(xué)“神昏”“癡呆”范疇[14]。本課題組帶頭人劉清泉教授多年來(lái)總結(jié)了大量的臨床及基礎(chǔ)研究工作，提出了“外來(lái)之毒與內(nèi)生毒邪互結(jié)”是膿毒癥的主要病因，“正虛毒損，絡(luò)脈閉阻”是基本病機(jī)[15]。SAE的發(fā)生是由于熱毒、痰濁、瘀血互結(jié)于心腦清竅，而致氣機(jī)逆亂，蒙蔽心神。其病位在腦，與心、肝、脾、腎皆相關(guān)。本病以氣血、腎精虧虛為本，痰濁、瘀血為標(biāo)，臨床多見(jiàn)虛實(shí)夾雜之證，“扶正解毒通絡(luò)”應(yīng)為其主要治則[16]。強(qiáng)心一號(hào)配方中黃芪補(bǔ)氣升陽(yáng)、養(yǎng)血益中;茯苓寧心安神、益氣生津;丹參通絡(luò)活血;水紅花子利水化痰消積;五味子養(yǎng)陰益氣、鎮(zhèn)驚安神。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心一號(hào)配方對(duì)于可以顯著降低膿毒癥小鼠的死亡率[6]。在本研究中，我們利用評(píng)價(jià)小動(dòng)物空間學(xué)習(xí)記憶能力的“金標(biāo)準(zhǔn)”Morris水迷宮檢測(cè)強(qiáng)心一號(hào)配方對(duì)SAE認(rèn)知功能障礙的改善作用。各組小鼠的游泳速度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明CLP造模和強(qiáng)心一號(hào)配方干預(yù)對(duì)小鼠運(yùn)動(dòng)功能沒(méi)有影響。定位航向試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心一號(hào)配方可以顯著提高膿毒癥小鼠的逃避潛伏期和象限時(shí)間百分比，說(shuō)明強(qiáng)心一號(hào)配方對(duì)膿毒癥小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力具有一定改善作用。

大腦海馬體是與人類的學(xué)習(xí)記憶等高級(jí)功能有密切關(guān)系的重要功能區(qū)，是腦內(nèi)參與學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知和突觸可塑性的重要部分。研究表明，海馬區(qū)的過(guò)度神經(jīng)炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致SAE認(rèn)知功能障礙的重要原因之一[17-18]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，血腦屏障的破壞會(huì)導(dǎo)致循環(huán)中的細(xì)胞因子和免疫炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)至深部腦區(qū);腦區(qū)中的細(xì)胞因子激活細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。過(guò)度的炎癥反應(yīng)引起小膠質(zhì)細(xì)胞激活、神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等病理生理學(xué)過(guò)程，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[19]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常人比較，SAE患者海馬區(qū)IL-6等炎癥介質(zhì)表達(dá)顯著升高[20]。在膿毒癥動(dòng)物模型中，造模6 h內(nèi)即可觀察到炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β和IL-6等表達(dá)的升高，并持續(xù)升高至造模后10～30 d[21-22]。既往研究表明，炎癥介質(zhì)的升高與膿毒癥認(rèn)知功能障礙的嚴(yán)重程度和死亡率的升高成正相關(guān)[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CLP術(shù)后10 d，模型組海馬組織中炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α和IL-6表達(dá)水平顯著增高，強(qiáng)心一號(hào)配方可顯著改善炎癥介質(zhì)IL-1β和TNF-α的表達(dá)水平。說(shuō)明強(qiáng)心一號(hào)配方改善SAE認(rèn)知功能障礙的機(jī)制可能與降低海馬組織神經(jīng)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

但是，強(qiáng)心一號(hào)配方是否是通過(guò)改善突觸可塑性、減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、降低小膠質(zhì)細(xì)胞激活等分子機(jī)制來(lái)改善膿毒癥認(rèn)知功能障礙，仍需要進(jìn)一步研究。

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（2019-12-13收稿 責(zé)任編輯：王明）