戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的影響

戊唑醇（Tebuconazole）是一種高效、廣譜、內(nèi)吸性三唑類殺菌劑，具有活性高、防治效果好、性價比高等優(yōu)勢。戊唑醇的大量使用和丟棄使其通過多種途徑進(jìn)入水體，對水生生態(tài)系統(tǒng)造成了巨大危害，并可通過食物鏈在魚類等水生生物體內(nèi)富集并最終進(jìn)入人體，對人體健康構(gòu)成威脅[1-2]。戊唑醇主要在肝臟中代謝，分子中特丁基結(jié)構(gòu)的一個甲基可被氧化后羥化，隨后與葡萄糖醛酸或硫酸發(fā)生結(jié)合反應(yīng)[3]。在哺乳動物體內(nèi)，氧化產(chǎn)物可進(jìn)一步代謝為三元醇或酮類衍生物。然而，當(dāng)各個臟器和解毒酶系統(tǒng)未發(fā)育完全前，尤其是對于體外胚胎發(fā)育的動物，戊唑醇對其胚胎發(fā)育的影響尚不清楚。

本文探究了戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的潛在影響。使用不同濃度的戊唑醇（10，20，40 mg/L）處理處于囊胚末期的熱帶爪蟾胚胎，持續(xù)至裂縫胚孔期結(jié)束。統(tǒng)計胚胎的死亡率、畸形率；檢測胚胎中NRF2、SOD、CAT和NQO1的表達(dá)情況及DNA損傷效應(yīng)。當(dāng)戊唑醇濃度為20 mg/L時，胚胎出現(xiàn)大量畸形；當(dāng)戊唑醇濃度達(dá)到40 mg/L時，胚胎的存活率顯著下降；戊唑醇對DNA存在一定的損傷作用；體內(nèi)NRF2、SOD、CAT和NQO1的表達(dá)水平隨著戊唑醇濃度的增加而下降。戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎有顯著毒性作用，干擾原腸運動，影響器官發(fā)育，誘導(dǎo)胚胎發(fā)育畸形甚至死亡。

熱帶爪蟾個體小、生長周期短、胚胎發(fā)育模式與人類相似，且基因組簡單，爪蟾胚胎致畸實驗（FETAX）是檢測污染物發(fā)育毒性的常用檢測方法[4-5]。本文通過戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的影響研究，進(jìn)一步確定戊唑醇的毒性作用，以探究環(huán)境中戊唑醇對脊椎動物胚胎發(fā)育的潛在影響。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1主要試劑

人絨毛膜促性腺激素（HCG）購于寧波第二激素廠，半胱氨酸和戊唑醇購于生工生物公司。

1.1.2實驗材料

實驗熱帶爪蟾由溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)院羊棲菜研究所實驗室培育。

1.2實驗方法

1.2.1胚胎獲取

選取本實驗室飼養(yǎng)的多對雌雄熱帶爪蟾，采用人工注射HCG的方法進(jìn)行誘導(dǎo)產(chǎn)卵，使用2%半胱氨酸溶液去除卵外膠質(zhì)膜，待發(fā)育到囊胚末期、原腸胚前期對正常胚胎進(jìn)行染毒實驗。

1.2.2胚胎暴露實驗

使用熱帶爪蟾培養(yǎng)液將戊唑醇稀釋成0、10、20、40 mg/L等4個濃度，為了避免受精過程的不確定性帶來的誤差，在囊胚期于顯微鏡下挑選發(fā)育正常的胚胎，并從囊胚期開始處理至原腸期結(jié)束。向培養(yǎng)皿中加入50 mL戊唑醇溶液，于恒溫培養(yǎng)箱（26±0.5）℃黑暗培養(yǎng)12 h，之后每24 h更換培養(yǎng)液。

1.2.3顯微觀察

每間隔6 h記錄各濃度組胚胎死亡、畸形、孵化情況，于體視顯微鏡下觀察胚胎并拍照記錄。

1.2.4Ⅱ相解毒酶及抗氧化酶mRNA表達(dá)水平檢測

根據(jù)NCBI和Xenbase數(shù)據(jù)庫獲取編碼熱帶爪蟾Nrf2、SOD、CAT、NQO1和β-actin的完整序列，并設(shè)計引物（見表1）。選取試驗組與對照組發(fā)育的胚胎，通過Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA為模板，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。

1.2.5 DNA損傷效應(yīng)檢測

連續(xù)培養(yǎng)96 h后，每組隨機挑選10只熱帶爪蟾胚胎，提取胚胎總DNA，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA條帶的拖尾情況，比較不同濃度戊唑醇對胚胎DNA的損傷效應(yīng)。

1.2.6數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05表示差異顯著，P< 0.01表示差異極顯著，結(jié)果以平均值±SD表示。

2結(jié)果與分析

2.1熱帶爪蟾胚胎形態(tài)變化

在胚胎發(fā)育至Stage 9-10時，使用戊唑醇染毒處理后，爪蟾胚胎后期的發(fā)育受到不同程度的影響。如圖1所示，與對照組相比，染毒6 h，胚胎表現(xiàn)為原腸運動受干擾，細(xì)胞遷移和胚孔閉合無法正常進(jìn)行，嚴(yán)重的導(dǎo)致死亡；染毒后24 h，部分胚胎出現(xiàn)尾部上彎、短尾等畸形變性，更嚴(yán)重的導(dǎo)致胚胎異常及死亡；染毒后72 h，胚胎出現(xiàn)小眼、腸道水腫、尾巴彎曲、嘴巴突出和卵黃囊外漏等異常表型；染毒后96 h，已有大量胚胎死亡，存活胚胎多表現(xiàn)不同程度的異常，例如體色深、小眼癥狀及尾部下彎、嘴巴水腫等。

2.2戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎死亡率和畸形率的影響

不同濃度戊唑醇處理后胚胎發(fā)育死亡率和畸形率統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示，隨著戊唑醇濃度的升高，胚胎死亡率呈上升趨勢，且當(dāng)濃度為20 mg/L時有極顯著差異（P<0.01）。胚胎畸形率隨戊唑醇濃度增加呈上升趨勢，但沒有呈明顯正相關(guān)，且當(dāng)濃度為40 mg/L時具有極顯著差異（P<0.01）。在染毒后96 h，胚胎存活率隨戊唑醇濃度增加而逐漸下降，當(dāng)濃度為20 mg/L時有極顯著差異（P<0.01），當(dāng)濃度為40 mg/L存在顯著差異（P<0.05）。綜上，戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎死亡率和畸形率有顯著影響，導(dǎo)致胚胎出現(xiàn)不同程度的畸形甚至導(dǎo)致死亡。戊唑醇毒性存在累積效應(yīng)，胚胎存活率隨時間推移逐漸降低直至全部死亡。

2.3戊唑醇誘導(dǎo)熱帶爪蟾細(xì)胞氧化損傷

為了進(jìn)一步探索戊唑醇對胚胎發(fā)育致畸作用的分子機制，在戊唑醇處理6 h后，檢測了NRF2、SOD、CAT及NQO1幾種編碼與機體氧化還原狀態(tài)密切相關(guān)的II相解毒酶和抗氧化酶基因的表達(dá)情況。結(jié)果如圖3及圖4所示，當(dāng)胚胎處于Stage 13時，其體內(nèi)Nrf2、SOD和CAT表達(dá)量相對較低，在經(jīng)過戊唑醇處理后，NRF2和CAT的表達(dá)受到進(jìn)一步抑制。與之對應(yīng)，NQO1的表達(dá)量在對照組中較高，經(jīng)戊唑醇處理后，表達(dá)水平隨濃度增加顯著降低（P<0.01）。綜上所述，熱帶爪蟾胚胎中抗氧化系統(tǒng)在胚胎發(fā)育早期尚未完善，且戊唑醇能顯著抑制相關(guān)基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胚胎細(xì)胞的氧化損傷。

2.4戊唑醇誘導(dǎo)熱帶爪蟾胚胎染色體DNA損傷

在戊唑醇處理后96 h，提取熱帶爪蟾胚胎的基因組DNA，并檢測戊唑醇對胚胎DNA造成的損傷。結(jié)果如圖5所示，與對照組相比，10、20 mg/L實驗組DNA條帶出現(xiàn)明顯拖尾，說明戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎DNA產(chǎn)生較大損傷。

3討論與結(jié)論

在戊唑醇對斑馬魚的急性毒性試驗中發(fā)現(xiàn)，戊唑醇比較穩(wěn)定，但過量則易殘留在土壤和水中，對魚類等水生生物造成危害[6- 7]。不同濃度戊唑醇處理均會對熱帶爪蟾胚胎產(chǎn)生影響，10 mg/L戊唑醇就開始對胚胎發(fā)育產(chǎn)生顯著影響；20 mg/L戊唑醇會造成胚胎出現(xiàn)不同程度的畸形，例如脊柱彎曲、尾部彎曲、腸道水腫、小眼和體色異常等。其潛在機制可能與戊唑醇抑制了胚胎細(xì)胞中Ⅱ相解毒酶和抗氧化酶基因表達(dá)有關(guān)。Nrf2是抗氧化系統(tǒng)主要的調(diào)控因子，而醌氧化還原酶（NQO1）、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等抗氧化酶對活性氧清除具有重要作用[8]。當(dāng)胚胎受到外界強烈刺激時，Nrf2、NQO1、CAT、SOD等基因的表達(dá)被顯著抑制從而誘導(dǎo)胚胎氧化損傷。通過該實驗，既探究了戊唑醇對熱帶爪蟾胚胎發(fā)育的影響，同時也為戊唑醇對人類及脊椎動物早期胚胎發(fā)育的影響提供借鑒。值得注意的是，低濃度戊唑醇即會對胚胎發(fā)育產(chǎn)生較大影響，因此需合理預(yù)估其安全使用濃度。

參考文獻(xiàn)

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[7]錢麗娟，劉青坡，郭素珍，等.爪蟾胚胎致畸實驗（FE‐TAX）在檢測污染物發(fā)育毒性中的應(yīng)用[J].安全與環(huán)境學(xué)報，2009，9（4）：24.

[8]胡流芳. Keap1_Nrf2_ARE信號通路的抗氧化應(yīng)激作用及其調(diào)控機制[J].國際藥學(xué)研究雜志，2016，43（1）：146.

（溫州大學(xué)徐曼，朱振濤）