29株淡水真菌固體發(fā)酵提取物的抑菌活性研究

李永建，韋明杰，張 凰

(昆明理工大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品學(xué)院，云南 昆明 650500)

0 引 言

近年來，真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物因結(jié)構(gòu)出新率高、生物活性顯著，是新藥物開發(fā)的重要來源，已成為藥物化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1].淡水真菌是真菌的一個(gè)重要類群，其生存環(huán)境與海洋真菌和土壤真菌的巨大差異，導(dǎo)致淡水真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性明顯不同于這兩類真菌.董錦艷等人[2]綜述了淡水真菌代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)其代謝物化學(xué)結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜多樣，多數(shù)具有抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗真菌、抗蟲等生物活性，在醫(yī)藥與農(nóng)藥研發(fā)等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景.這些具有重要意義的生物活性物質(zhì)多來自淡水真菌的固體發(fā)酵產(chǎn)物.由于很多抗生素來源于具有較好抑菌活性的發(fā)酵產(chǎn)物，所以對(duì)淡水真菌發(fā)酵產(chǎn)物的生物活性研究首選抑菌活性研究.

隨著真菌分類學(xué)的發(fā)展，越來越多的淡水真菌被發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，為我們研究淡水真菌的發(fā)酵產(chǎn)物的活性提供了更多的材料[3-6].由于很多抗生素來源于具有較好抑菌活性的真菌發(fā)酵產(chǎn)物，所以對(duì)淡水真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物生物活性的研究首選抑菌活性研究.Fisher和Anson[7]在1983年首次報(bào)道了淡水真菌的抑菌活性，文章中指出淡水真菌Massarinaaquatica可以抑制蠟狀芽孢桿菌和腐生葡萄球菌等.隨后，F(xiàn)isher等人[8]報(bào)道淡水真菌Helicoonrichonis可以抑制蠟狀芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等.近年來，關(guān)于淡水真菌抑菌活性的報(bào)道逐漸增加.Lindgomycesmadisonensis被報(bào)道可以抑制恥垢分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌[9]；Tricladiumcastaneicola可以抑制病原真菌Phytophthoracapsici[10]；Ophiocerasleptosporum可以抑制蠟狀芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌[11].由于同一目(order)真菌的親緣關(guān)系相近，所以發(fā)酵產(chǎn)物的活性也有相似之處，因此以目為單位研究淡水真菌的抑菌活性是必要的.統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)已報(bào)道的具有抑菌活性的淡水真菌共102株(含7株未確定分類地位的淡水真菌)，分布在8個(gè)綱(class)22個(gè)目中(表1).其中Pleosporales目數(shù)量最多，為28株，其次是Eurotiales目14株，Orbiliales目10株.抑活淡水真菌比例最高的目為Magnaporthales，占50%.

表1 已報(bào)道的具有抑菌活性淡水真菌在各目中的數(shù)量

為了增加對(duì)淡水真菌抑菌活性的認(rèn)識(shí)，也為了研究抑活淡水真菌在不同目的分布規(guī)律，本研究對(duì)隸屬于13個(gè)目的29株淡水真菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行抑菌活性篩選，并結(jié)合已報(bào)道的分布情況，總結(jié)了不同目淡水真菌的抑菌活性規(guī)律，為后期篩選淡水真菌的抑菌活性提供依據(jù)，以提高篩選效率.

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用淡水真菌菌株

實(shí)驗(yàn)選用了29株從泰國清邁和清萊等地區(qū)采集到的淡水腐木真菌的純培養(yǎng)物，詳見表2.

表2 29株淡水真菌列表

1.1.2 供試病原菌

實(shí)驗(yàn)選用的6種食源性病原細(xì)菌分別為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis(ATCC6633)、李斯特菌Listeriamonocytogenes(ATCC19115)、志賀菌Shigellasp.(CMCC51105)、沙門氏菌Salmonellasp.(CMCC50093)、大腸桿菌Escherichiacoli(ATCC25922)和金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus(ATCC29213).選用的3株植物病原真菌分別為灰葡萄孢菌Botrytiscinerea、水稻枯紋菌Rhizoctoniasolani和尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 真菌發(fā)酵和產(chǎn)物提取

真菌發(fā)酵和產(chǎn)物提取是在Ayers和Reyes-Estebanez發(fā)酵和提取的方法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)[14-15].具體為將淡水真菌菌株接種在PDA培養(yǎng)基表面，在27℃下培養(yǎng)到菌落直徑3～5 cm.在超凈工作臺(tái)中用無菌吸管將菌落分割成直徑0.5 cm、大小均勻的圓形菌落.取10～15個(gè)菌落置于滅菌后的100 mL PDB液體培養(yǎng)基中，封口后放于恒溫?fù)u床中以180 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)至發(fā)酵液粘稠(不同真菌的發(fā)酵速度不同，約為5～15 d).在250 mL三角瓶中加入40 g大米和等體積珍珠巖，以及60 mL蒸餾水，封口后浸泡1 d，121℃滅菌20 min.將5 mL發(fā)酵液加入大米培養(yǎng)基中，封口后，先在恒溫?fù)u床中180 r/min、28℃培養(yǎng)6 d，再取出于28℃恒溫靜置培養(yǎng)，直到菌體布滿所有大米.

在發(fā)酵后的固態(tài)培養(yǎng)基中加入100 mL乙酸乙酯浸提，超聲30 min停1 h，超聲三次后靜置，直至乙酸乙酯層澄清，過濾得到乙酸乙酯層，每瓶固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物用乙酸乙酯重復(fù)浸提3次.將三次浸提液混合后用無水硫酸鈉除去浸提液中的少量水分，將浸提液真空濃縮干燥(水浴溫度≤40℃).稱取干燥后的提取物10 mg，用二甲基亞砜溶解，配制成濃度為10 mg/mL的發(fā)酵液備用.

1.2.2 抑菌活性篩選

根據(jù)鄭毅等人[1,20]的實(shí)驗(yàn)方法，用牛津杯法進(jìn)行病原細(xì)菌的抑制實(shí)驗(yàn)，用濾紙片法進(jìn)行病原真菌的抑菌實(shí)驗(yàn).牛津杯法：用生理鹽水將在LB液體培養(yǎng)基中活化的病原細(xì)菌稀釋成濃度為(0.8～2)×105cfu/mL的菌懸液.吸取80 μL的病原細(xì)菌菌液均勻涂布在LB瓊脂平板上.在每個(gè)平板上放置3個(gè)牛津杯，每個(gè)牛津杯中加入10 μL的發(fā)酵液，37℃培養(yǎng)18～24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑.濾紙片法：取直徑為6 mm的濾紙片，浸泡在濃度為10 mg/mL的發(fā)酵液中(每片濾紙片承載的樣品量大約為10 μg).將風(fēng)干后的濾紙片放在接種了病原真菌的PDA平板上，培養(yǎng)3～4 d，觀察是否出現(xiàn)抑菌圈.

2 結(jié)果與討論

2.1 對(duì)病原細(xì)菌的抑制效果

淡水真菌固態(tài)發(fā)酵提取物抑制病原細(xì)菌的結(jié)果見表3.29株淡水真菌至少對(duì)2種病原細(xì)菌具有抑制作用，其中6株對(duì)全部6種供試病原細(xì)菌均具有抑制作用(圖1)，占比20.7%，它們?yōu)镃lohesyomycesaquaticusMFLUCC 15-0979(Pleosporales目)、DictyochaetaaquaticaMFLUCC 15-0983(Chaetosphaeriales目)、DictyosporellathailandensisMFLUCC 15-0985(Sordariomycetes中不確定目)、DistoseptisporatectonaeMFLUCC 15-0981(Distoseptisporales目)、PseudoproboscisporathailandensisMFLUCC 15-0989(Annulatascales目)和Tubeufiasp. MFLUCC 15-0998(Tubeufiales目).其中，Tubeufiasp. MFLUCC 15-0998抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)4種病原細(xì)菌抑菌圈直徑均大于12.00 mm.能夠抑制5種病原細(xì)菌的淡水真菌為11株，能夠抑制4種和3種病原細(xì)菌的均為5株，剩余2株只能抑制2種病原細(xì)菌.

表3 29株淡水真菌固態(tài)發(fā)酵提取物對(duì)病原細(xì)菌的抑制效果

圖1 6株淡水真菌的抑菌效果圖

在革蘭氏陽性菌中，對(duì)全部3種供試病原菌均表現(xiàn)出抑制活性的淡水真菌共14株，占比48.3%，抑菌圈平均直徑分布在9.75～13.8 mm.李斯特菌被抑制的概率最高，共23株，占比79.3%，隸屬于10個(gè)目.其中DictyochaetaaquaticaMFLUCC 15-0983的抑菌效果最好，抑菌圈平均直徑為12.38 mm.22株淡水真菌能抑制金黃色葡萄球菌，占比75.9%，隸屬于12個(gè)目.其中Strain MFLUCC 15-0988的抑菌效果最好，抑菌圈平均直徑為13 mm.Chaetothyriales、Distoseptisporales、Savoryellales和Sporidesmiales 4個(gè)目對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌活性是首次報(bào)道.21株淡水真菌能抑制枯草芽孢桿菌，占比72.4%，隸屬于9個(gè)目.其中DictyosporellathailandensisMFLUCC 15-0985的抑菌效果最好，抑菌圈平均直徑為13.8mm.本研究首次揭示了Chaetothyriales、Distoseptisporales、Jahnulales、Magnaporthales和Sporidesmiales 5個(gè)目對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性，但未觀察到Pleurotheciales目的3株淡水真菌對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌活性，此前也沒有Pleurotheciales目淡水真菌抑制枯草芽孢桿菌的報(bào)道.

在革蘭氏陰性菌中，對(duì)全部3種供試病原菌均表現(xiàn)出抑制活性的淡水真菌共10株，占比34.5%，抑菌圈平均直徑分布在10.34～13.98 mm.志賀菌被抑制的概率最高，共24株，占比82.6%，隸屬于11個(gè)目.其中DictyochaetathailandensisMFLUCC 15-0985的抑菌活性最強(qiáng)，抑菌圈平均直徑為13.98 mm.前人研究中只報(bào)道了一株Tubeufiales目淡水真菌Helicosporiumsp.可以抑制志賀菌[21]，而本研究首次揭示了Annulatascales、Atractosporales、Chaetosphaeriales、Chaetothyriales、Distoseptisporales、Hypocreales、Jahnulales、Pleosporales、Pleurotheciales和Sporidesmiales 10個(gè)目對(duì)志賀菌的抑菌活性.20株淡水真菌能抑制大腸桿菌，占比69%，隸屬于11個(gè)目.其中Tubeufiasp. MFLUCC 15-0998的效果最好，抑菌圈平均直徑為13.03 mm.本研究首次揭示了Annulatascales、Atractosporales、Distoseptisporales和Tubeufiales 4個(gè)目對(duì)大腸桿菌的抑菌活性.20株淡水真菌能抑制沙門氏菌，占比69%，隸屬于9個(gè)目.其中Pleurotheciaceaesp.2. MFLUCC 15-0994的抑菌效果最好，抑菌圈平均直徑為13.42 mm.Monkai等人[11]和Choi等人[21]也選用了沙門氏菌做淡水真菌抑菌活性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果均未顯示出對(duì)沙門氏菌的抑菌活性.而本研究中首次觀察到9個(gè)目淡水真菌對(duì)沙門氏菌具有抑菌活性，分別為Annulatascales、Chaetosphaeriales、Distoseptisporales、Hypocreales、Jahnulales、Pleosporales、Pleurotheciales、Savoryellales和Tubeufiales.

2.2 對(duì)病原真菌的抑制效果

29株淡水真菌固態(tài)發(fā)酵提取物抑制病原真菌結(jié)果見表4，效果圖見圖2.共有17株淡水真菌對(duì)至少1種供試植物病原真菌表現(xiàn)出抑菌活性，占篩選淡水真菌總數(shù)的58.6%.僅有PseudoasteromassariaspadiceaMFLUCC 15-0973對(duì)3種供試植物病原真菌均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性.抑制2種病原真菌的淡水真菌為3株，其中DictyosporellathailandensisMFLUCC 15-0985和Longipedicellatasp. MFLUCC 15-0965都對(duì)水稻枯紋菌具有較強(qiáng)的抑制效果.抑制1種病原真菌的淡水真菌為13株.在這3種病原真菌中，尖孢鐮刀菌被抑制的概率最高，共8株，占比27.6%，隸屬于Pleosporales、Pleurotheciales和Tubeufiales.在前人研究中，有41.2%的測試菌株能抑制尖孢鐮刀菌，效果比較好的為Aspergillus(Eurotiale目)和Chloridiumsp.(Chaetosphaeriales目)[22-24].7株淡水真菌能抑制灰葡萄孢菌，占比24.1%，隸屬于Annulatascales目、Atractosporales目、Chaetothyriales目、Hypocreales目、Jahnulales目和Pleosporales目.在前人的研究中，有50%的測試菌株能抑制灰葡萄孢菌，分別為Massarina和Pithomyces(Pleosporales目)、Cladosporium(Capnodiales目)、Aspergillus、Paecilomyces和Penicillium(Eurotiales目)、Papulaspora(Coronophorales目)、Cephalosporium(Hypocreales目)、Trichaegum(Ascomycota不確定目)[7，22-23].由此可見，Hypocreales目和Pleosporales目真菌抑制灰葡萄孢菌的概率較大.抑制水稻枯紋菌的7株淡水真菌分別隸屬于Pleosporales目、Savoryellales目和Tubeufiales目.在前人的研究中，只有23.6%的測試菌株對(duì)其具有抑菌活性，效果比較好的為Chloridiumsp.(Chaetosphaeriales目)、Delitschiacorticola和Massarinabipolaris(Pleosporales目)、Monacrosporiumellipsosporum(Orbiliales目)和Tiarosporellapaludosa(Botryosphaeriales目)[7,22,25-26].所以，Pleosporales目的真菌能夠抑制水稻枯紋菌的概率較大.

表4 29株淡水真菌固態(tài)發(fā)酵提取物對(duì)病原真菌的抑制效果

圖2 淡水真菌對(duì)病原真菌較為顯著的抑菌效果圖

本研究所測試的29株淡水真菌中，16株隸屬于糞殼菌綱(Sordariomycetes)，11株隸屬于座囊菌綱(Dothideomycetes)，1株隸屬于散囊菌綱(Eurotiomycetes)，1個(gè)為未鑒定菌株(表2).結(jié)合已有報(bào)道，具有抑菌活性的淡水真菌在不同目的分布見圖3.從圖中可以看出，本研究首次報(bào)道了4個(gè)目的淡水真菌的抑菌活性，分別為Atractosporales、Distoseptisporales和Sporidesmiales，隸屬于糞殼菌綱，以及Chaetothyriales，隸屬于散囊菌綱.總體上看，47株隸屬于座囊菌綱，18株隸屬于散囊菌綱，40株隸屬于糞殼綱.具有抑菌活性淡水真菌最多的目為Pleosporales，共32株，其次為Eurotiales目14株，Magnaporthales目10株.Pleosporales目抑活淡水真菌較多與其淡水真菌總量較大有關(guān).Pleosporales目淡水真菌總數(shù)為215株[12]，具有抑菌活性淡水真菌僅占14.88%.Magnaporthales目淡水真菌總數(shù)為18株[13]，具有抑菌活性的淡水真菌占55.56%.

圖3 具有抑菌活性(抑制病原細(xì)菌或真菌)的淡水真菌在座囊菌綱(1～5)、散囊菌綱(6～8)和糞殼菌綱(9～22)不同目的分布(柱狀圖上的數(shù)字來自本研究結(jié)果)

3 結(jié) 論

本研究中13個(gè)目(29株)淡水真菌都具有抑菌活性，至少可以抑制食源性病原細(xì)菌枯草芽孢桿菌、李斯特菌、志賀菌、沙門氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌中的2種.其中有6株淡水真菌對(duì)6種病原細(xì)菌都具有抑制活性，它們分別隸屬于Annulatascales目、Chaetosphaeriales目、Distoseptisporales目、Pleosporales目和Tubeufiales目.只有9個(gè)目(17株)淡水真菌可以抑制植物病原真菌.具有抑制活性的淡水真菌數(shù)量最多的3個(gè)目分別為Tubeufiales目、Pleosporales目和Pleurotheciales目.本研究的主要結(jié)論和貢獻(xiàn)如下：

1)首次報(bào)道了Atractosporales目、Chaetothyriales目、Distoseptisporales目和Sporidesmiales目淡水真菌的抑菌活性.

2)針對(duì)革蘭氏陽性菌，首次報(bào)道了4個(gè)目(Chaetothyriales、Distoseptisporales、Savoryellales和Sporidesmiales)淡水真菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性；5個(gè)目(Chaetothyriales、Distoseptisporales、Jahnulales、Magnaporthales和Sporidesmiales)淡水真菌對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制活性.

3)針對(duì)革蘭氏陰性菌，首次報(bào)道了11個(gè)目(Annulatascales、Atractosporales、Chaetosphaeriales、Chaetothyriales、Distoseptisporales、Hypocreales、Jahnulales、Pleosporales、Pleurotheciales、Sporidesmiales和Tubeufiales)淡水真菌對(duì)志賀菌的抑制活性，4個(gè)目(Annulatascales、Atractosporales、Distoseptisporales和Tubeufiales)淡水真菌對(duì)大腸桿菌的抑制活性，9個(gè)目(Annulatascales、Chaetosphaeriales、Distoseptisporales、Hypocreales、Jahnulales、Pleosporales、Pleurotheciales、Savoryellales和Tubeufiales)淡水真菌對(duì)沙門氏菌的抑制活性.

4)針對(duì)植物病原真菌，首次報(bào)道了3個(gè)目(Pleosporales、Pleurotheciales和Tubeufiales)淡水真菌對(duì)尖孢鐮刀菌的抑制活性，4個(gè)目(Annulatascales、Atractosporales、Chaetothyriales和Jahnulales)淡水真菌對(duì)灰葡萄孢菌的抑制活性，2個(gè)目(Savoryellales和Tubeufiales)淡水真菌對(duì)水稻枯紋菌的抑制活性.

結(jié)合本研究結(jié)果和已報(bào)道的淡水真菌抑菌活性可以看出，具有抑菌活性的淡水真菌主要分布在Pleosporales目、Eurotiales目和Magnaporthales目.但是目前所測試的淡水真菌的樣本量還不夠多，今后隨著淡水真菌的不斷報(bào)道，以及測試樣品量的不斷增大，這一結(jié)論可能會(huì)被質(zhì)疑.本研究在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，不僅為淡水真菌的抑菌活性研究補(bǔ)充了可靠數(shù)據(jù)，豐富了淡水真菌抑菌活性的分布，也初步總結(jié)了具有抑菌活性的淡水真菌在不同菌目的大致分布和抑菌規(guī)律，增加了對(duì)淡水真菌的認(rèn)識(shí)，對(duì)淡水真菌研究具有重要意義.