UbcH5B活性位點突變體對野生型E2傳遞泛素活性的影響

李 貞，李雨欣，趙 博

(上海交通大學 藥學院，上海 200240)

0 引 言

蛋白質泛素化是一種重要的蛋白質翻譯后修飾.在真核細胞中，泛素分子通過泛素活化酶(Ubiquitin activating enzyme，E1)、泛素結合酶(Ubiquitin conjugating enzyme，E2)和泛素連接酶(Ubiquitin ligase，E3)的級聯(lián)反應，使底物帶上泛素標簽，此過程稱為蛋白質的泛素化[1].蛋白質泛素化參與體內許多重要的生物學過程，如蛋白質降解、DNA損傷修復和信號轉導等.

在人體細胞中，已發(fā)現(xiàn)的E2大約有40種，E2在蛋白質泛素化過程中發(fā)揮著重要的作用[2].E1啟動泛素化過程，被E1活化的泛素分子與E1的活性Cys共價結合，形成硫酯結合物E1～Ub.E1～Ub與E2作用，將E1上共價結合的Ub傳遞到E2的活性Cys，從而形成硫酯結合物E2～Ub.E2～Ub與E3相互作用，將結合的Ub分子直接傳遞到底物或者先傳遞到E3的活性Cys，再傳遞到底物[3].E2都有一個保守的泛素結合域(Ubiquitin conjugating domain，UBC domain)，UBC domain大約由150～200個氨基酸殘基組成，包含一個可以結合從E1轉移的Ub分子的催化活性Cys，以及與E1和E3結合的位點[4].E2活性Cys是E2發(fā)揮傳遞泛素功能的關鍵位點，若將其突變成Ala或者Val，E2與Ub將不能形成硫酯結合物E2～Ub[5].若將E2的活性Cys突變成Ser，則得到更加穩(wěn)定的氧酯結合物E2-Ub[6].另外，除了活性Cys，E2上還有其他的位點對E2的活性有影響，有些E2(如UbcH5c)背面的保守Ser 22，若將其突變成Arg，則結合泛素的活性變弱[7].

除了在泛素傳遞中發(fā)揮橋接作用，E2對泛素鏈組裝和泛素化調控也有重要的作用.如有些E2可以決定泛素鏈的連接類型，尤其是與RING家族E3合作傳遞泛素[8].有趣的是，E2的活性也受到調節(jié).例如Ube2T靠近其催化活性位點的Lys可以在體內發(fā)生單泛素化，從而負調節(jié)范可尼貧血通路[9]；UBE2S靠近催化中心的Lys發(fā)生自泛素化，抑制UBE2S活性Cys再次與Ub結合[10].但目前仍需要更深入研究E2活性調節(jié)，才能明確其真正分子機制和相關的生理作用.

另外，E2也參與一些疾病的進程，包括神經退行紊亂、免疫失調和癌癥等[11].如E2-25K參與擴張的多聚谷氨酰胺蛋白的聚集形成，從而參與亨廷頓病[12].此外，Ube2T突變與范可尼貧血癥有關[13]，UBE2N和其合作的UBE2V1在惡性黑色瘤中高度表達，通過MEK/FRA1/SOX10信號通路促進黑色素瘤的生長[14].因此，靶向E2對于某些疾病治療具有較大的發(fā)展前景.如使用靶向UBE2N的小分子抑制劑NSC697923，可以抑制黑色瘤的生長[14].因此，深入了解E2的泛素化活性調節(jié)不僅利于深入理解復雜的泛素化網絡，而且促進靶向E2的疾病治療.

為了更加深入了解E2泛素化活性調節(jié)，本文研究E2活性位點突變體對野生型E2傳遞泛素的影響.選擇已報道與E1具有最高結合力的E2——UbcH5B[15]，將其保守的催化活性位點Cys85突變成Ser，獲得突變體UbcH5B-C85S.突變體UbcH5B-C85S可以結合從E1轉移的Ub，形成比硫酯結合物E2～Ub更加穩(wěn)定的氧酯結合物E2-Ub，并且結合的Ub較難以從突變體中解離，可能導致Ub分子不能傳遞到E3.在野生型E2參與的體外泛素轉移反應中加入突變體UbcH5B-C85S，分別在E2和E3水平上分析突變體對野生型E2泛素轉移的影響.

1 材料和方法

1.1 材料

PCR擴增野生型E2和突變體基因的引物由生工生物工程(上海) 股份有限公司合成，Taq DNA 聚合酶購自Toyobo公司，限制性內切酶NdeI、XhoI、NcoI、NotI、HindⅢ 和T4 DNA 連接酶購自NEB公司，pET28a和 pET28a-Flag載體由本實驗室保存.E.coliXL1-Blue 及E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞由本實驗室制備.瓊脂糖購自BIOWEST公司，質粒小提試劑盒和DNA凝膠回收試劑盒購自Omega公司.10 ～180 kDa彩色預染蛋白質marker購自Thermo Scientific，Western blot有關試劑購自生工生物工程(上海) 股份有限公司.Rabbit anti-HA antibody購自Abcam公司；Mouse-anti-Flag antibody購自Sigma-Aldrich公司；二抗Alexa Fluor 790偶聯(lián)的anti-mouse-IgG購自Jackson Immuno-Research公司；Lysis buffer(50 mM Tris Base，500 mM NaCl，5mM 咪唑，pH 7.5)；Wash buffer(50 mM Tris Base，500 mM NaCl，20 mM 咪唑，pH 7.5)，Elution buffer(50 mM Tris Base，500 mM NaCl，250 mM咪唑，pH 7.5)，透析緩沖液(25 mM Tris Base，150 mM NaCl，5 mM DTT，pH 7.5)，泛素轉移反應緩沖液TBS(20 mM Tris Base，150 mM NaCl，pH 7.5)等其余試劑由本實驗室配制.

1.2 表達載體的構建

1.2.1 野生型UbcH5B、E2-25K和UbcH7表達載體的構建

使用含有UbcH5B、UbcH7和E2-25K基因的質粒及pET28a-Flag原核表達載體，分別利用酶切位點NcoI/HindⅢ、NcoI/NotI和NcoI/NotI 設計特異性引物(見表1)，以含有UbcH5B、UbcH7和E2-25K基因的質粒為模板，PCR擴增得到野生型E2基因，經瓊脂糖凝膠電泳分離后切膠回收.使用相應的限制性內切酶分別雙酶切對應的目的基因和載體，酶消化后的載體經瓊脂糖凝膠電泳分離后，與消化后的插入片段分別試劑盒回收.連接回收的目的片段和載體，然后將酶連產物電轉化至E.coliXL1-Blue感受態(tài)細胞，將復蘇的菌液涂布于LB/kan平板.37℃培養(yǎng)過夜，挑取3～5個新鮮的單克隆，小規(guī)模培養(yǎng)并提取質粒.雙酶切鑒定重組質粒，并將陽性的重組質粒送至測序公司測序，最后比對序列.

1.2.2 突變體UbcH5B-C85S表達載體的構建

利用Overlap PCR 將UbcH5B的 Cys85突變成Ser.根據Overlap PCR原理，設計特異的上下游引物和包含突變位點的中間重疊引物(見表1).以包含UbcH5B基因的質粒為模板，分別擴增突變體的基因片段1和基因片段2，PCR擴增程序為94℃預熱2 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，68℃延伸1 min，35個循環(huán)，最后68℃延伸10 min.將擴增得到的突變體的基因片段1和基因片段2進行重疊，按照上述PCR程序擴增 10個循環(huán)，然后加入上游引物和下游引物，再擴增 25個循環(huán)，得到突變體UbcH5B-C85S基因.使用NdeI和XhoI酶切UbcH5B-C85S 插入片段和pET28a載體，再根據1.2.1所述方法完成后續(xù)構建，最終測序鑒定是否實現(xiàn)定點突變.

表1 野生型UbcH5B、UbcH7和E2-25K及突變體UbcH5B-C85S表達載體構建使用的引物序列

1.3 蛋白表達和純化

將成功構建的表達質粒pET28a-UbcH5B-Flag、pET28a-UbcH7-Flag、pET28a-E2-25K-Flag和pET28a-UbcH5B-C85S化學轉化至E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞, 涂布于LB/kan平板，37℃培養(yǎng)過夜，挑取1～2個新鮮的單克隆于LB/kan培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至對數期，并轉移至1 L LB/kan培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng).待培養(yǎng)菌液的OD600約為0.6，加入1 mM IPTG，16℃誘導表達過夜.次日離心收集菌液沉淀 (4℃，6 000 rpm，10 min)，加入10 mL Lysis buffer充分重懸，冰上靜置裂解30 min.高壓破碎菌液后離心(4℃，12 000 r/min，30 min)，收集上清.將含有可溶蛋白的上清液采用Ni-NTA 親和層析柱純化(重組蛋白的C末端融合His6標簽).在上清液中加入1 mL Ni-NTA beads，4℃充分混合2 h. 將混合液加入干凈的純化柱中，靜置30 min，加入10 mL Lysis buffer平衡，后加入10 mL Wash buffer 洗滌3次，最后用3 mL的Elution buffer洗脫目的蛋白.取5～10 μL蛋白洗脫液，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，95℃ 加熱5 min，SDS-PAGE分離，考馬斯亮藍染色2 h，后脫色觀察蛋白條帶.蛋白洗脫液于4℃透析過夜，次日通過BCA法測定蛋白濃度，純化的蛋白分裝凍存于-80℃.

1.4 體外泛素轉移分析

1.4.1 野生型E2與突變體的泛素反應活性檢測

利用泛素轉移反應(不含E3和底物)檢測所表達的UbcH5B、UbcH7、E2-25K和UbcH5B-C85S與泛素的反應活性.50 μL反應體系中包括了20 μM HA-Ub、1 μM Ube1、10 μM E2、1 mM ATP和10 mM Mg2+.30℃ 反應2 h.加入還原(含有100 mM DTT)或者非還原(不含DTT)的5×SDS-PAGE上樣緩沖液終止反應，樣品于95℃煮沸5 min.取16 μL的樣品于10% SDS-PAGE膠中進行分離，轉膜結束后使用5%脫脂牛奶室溫封閉1.5 h.使用含5% BSA的TBS，稀釋anti-HA 抗體和anti-Flag抗體，4℃過夜孵育一抗.使用含5% BSA的TBS，稀釋anti-Rabbit IgG抗體和anti-Mouse IgG抗體，在室溫孵育二抗1 h.每次孵育抗體后使用TBS-T(0.1% Tween-20)洗膜4次，每次洗10 min.最終使用雙色紅外熒光成像儀掃膜分析.

1.4.2 E2水平分析突變體UbcH5B-C85S對野生型E2泛素反應的影響

為了探究UbcH5B-C85S 對E2水平的泛素轉移反應的影響，在野生型UbcH5B、E2-25K、UbcH7與Ub反應體系中(20 μM HA-Ub、1 μM Ube1、10 μM E2、1 mM ATP和10 mM Mg2+)，同時加入系列梯度濃度(0.5、1、5、10、20 μM)的UbcH5B-C85S，30℃反應1 h.加入5×非還原的SDS-PAGE上樣緩沖液終止反應，然后SDS-PAGE分離和使用anti-Flag抗體進行Western blot分析.

1.4.3 E3水平分析突變體UbcH5B-C85S對野生型E2傳遞泛素的影響

為了探究UbcH5B-C85S是否影響野生型UbcH5B傳遞Ub到TRIM23，首先檢測UbcH5B-C85S 是否參與TRIM23的自泛素化.在野生型UbcH5B與Ub反應體系中(2 μM HA-Ub、0.5 μM Ube1、2 μM UbcH5B、0.5 μΜ TRIM23、1 mM ATP和10 mM Mg2+)，同時加入系列濃度梯度的野生型UbcH5B和UbcH5B-C85S，并使?jié)舛瓤偤蜑? μM.另外，在UbcH5B的泛素轉移反應中(2 μM HA-Ub、0.5 μM Ube1、2 μM UbcH5B、0.5 μΜ TRIM23, 1 mM ATP和10 mM Mg2+)，加入UbcH5B-C85S(2 μM、4 μM、8 μM和16 μM)，30℃反應10 min，加入5×還原的SDS-PAGE上樣緩沖液終止反應，SDS-PAGE分離和使用anti-HA抗體進行Western blot分析.

2 結 果

2.1 野生型UbcH5B、E2-25K、UbcH7和突變體 UbcH5B-C85S的構建及表達

為了更加廣泛地探究突變體UbcH5B-C85S對E2泛素化過程的影響，選取3個野生型E2——UbcH5B、E2-25K、UbcH7.分別將野生型UbcH5B、E2-25K、UbcH7基因構建到pET28a-Flag載體(C末端融合Flag和His6標簽)，UbcH5B-C85S構建到pET28a載體(C末端融合His6標簽).PCR擴增UbcH5B、E2-25K、UbcH7基因(圖1a)，Overlap PCR定點突變得到突變體UbcH5B-C85S基因(圖1b)，這些插入片段和酶切后載體(圖1c)均符合預期大小.通過雙酶切(圖1d)和測序鑒定重組質粒，最終確定成功構建野生型UbcH5B、E2-25K、UbcH7和突變體UbcH5B-C85S(圖1e)的原核表達載體.

(a) PCR擴增E2-25K、UbcH7、UbcH5B基因；(b)重疊延伸PCR擴增UbcH5B-C85S基因；(c)使用限制性內切酶雙酶切pET28a和pET28a-Flag載體(Ctrl 1：完整的pET28a質粒；Vector 1：酶切后的pET28a質粒；Ctrl 2：完整的pET28a-Flag質粒；Vector 2：酶切后的pET28a-Flag質粒)；(d)雙酶切鑒定重組質粒(Ctrl 1：完整的pET28a質粒；Ctrl 2：完整的pET28a-Flag質粒；P 1-4分別為雙酶切后的重組質粒pET28a-UbcH5B-C85S、pET28a-E2-25K-Flag、pET28a-UbcH7-Flag和pET28a-UbcH5B-Flag)；(e)UbcH5B-C85S與UbcH5B氨基酸序列比對.

將成功構建的UbcH5B、E2-25K、UbcH7和UbcH5B-C85S表達載體進行原核表達，并采用Ni-NTA親和柱層析純化.SDS-PAGE顯示純化后的UbcH5B、UbcH7、E2-25K和UbcH5B-C85S有明顯的單一條帶，其分子量與理論分子量接近，并且蛋白純度超過90%(圖2).這些結果證明成功表達UbcH5B、E2-25K、UbcH7和UbcH5B-C85S, 并且純度較高.

圖2 純化后的野生型UbcH5B、E2-25K、UbcH7和突變體UbcH5B-C85S的SDS-PAGE分析結果

2.2 野生型E2和突變體UbcH5B-C85S的活性鑒定

為了鑒定表達的UbcH5B、UbcH7、E2-25K和UbcH5B-C85S的活性，利用體外泛素轉移反應，通過Western blot分析E2與泛素反應的活性.由于E2與Ub的結合物可能對DTT敏感程度不同[16]，因此，分別加入還原(含有100mM DTT)或者非還原(不含DTT)上樣緩沖液終止E1-E2的泛素傳遞反應，并且分別使用anti-HA抗體和anti-Flag抗體進行Western blot分析.結果發(fā)現(xiàn)在還原和非原性條件下都顯示UbcH5B-C85S與Ub形成氧酯結合物UbcH5B-Ub條帶(圖3a和圖3b第6泳道).由于UbcH5B-C85S沒有融合Flag 標簽，因此使用anti-Flag抗體檢測不到UbcH5B-Ub條帶(圖3c 和圖3d).相似地，UbcH5B和E2-25K 在還原和非還原條件下都可以與Ub反應，并且出現(xiàn)明顯的“l(fā)adder”條帶(圖3a、圖3b、圖3c和圖3d的第4、10泳道).相比而言，在非還原條件下，UbcH7～Ub條帶非常明顯，也顯示“l(fā)adder”條帶(圖3b)，但在還原條件下幾乎不顯示UbcH7～Ub條帶，說明UbcH7～Ub對DTT較敏感.這些結果證明表達的UbcH5B、UbcH7、E2-25K和UbcH5B-C85S都具有泛素反應活性.

注：E2與一個Ub分子結合的條帶使用“★” 標記

2.3 突變體UbcH5B-C85S對野生型E2體外泛素反應的影響

突變體UbcH5B-C85S可以與Ub 形成更加穩(wěn)定的氧酯化合物，若將其加入野生型E2的泛素反應中，有可能與野生型E2競爭結合從E1活性位點解離的Ub，從而可能抑制野生型E2與Ub的反應.另外由于UbcH5B、UbcH7、E2-25K在非還原條件下均可以檢測到E2～Ub的條帶，為驗證以上推測，在非還原條件下使用anti-Flag抗體通過Western blot 分析UbcH5B-C85S對UbcH5B、UbcH7、E2-25K體外泛素反應的影響.在正常E1-E2的Ub轉移反應中，分別加入系列濃度的UbcH5B-C85S，共同反應一段時間，通過野生型E2和E2-Ub條帶的強弱變化，判斷UbcH5B-C85S是否可以抑制野生型E2參與的泛素反應.

為了觀察UbcH5B-C85S對野生型E2泛素反應的影響，加入20 μM UbcH5B-C85S后觀察到UbcH5B～Ub條帶變弱，而UbcH5B本身條帶變強，表明UbcH5B-C85S對UbcH5B參與的泛素反應產生一定的抑制作用(圖4a).類似地，E2-25K～Ub條帶也變弱(圖4b)，但UbcH7～Ub條帶沒有明顯變化(圖4c).以上結果表明UbcH5B-C85S對這3個野生型E2參與的泛素化反應影響程度不同，當反應中加入UbcH5B-C85S的量為野生型E2的2倍，對UbcH5B和E2-25K的泛素化反應有部分抑制作用，但對UbcH7的泛素化影響較小.

圖4 UbcH5B-C85S部分抑制泛素傳遞到UbcH5B(a)和E2-25K(b)，但對UbcH7影響較小(c)

2.4 突變體UbcH5B-C85S對野生型UbcH5B體外泛素傳遞的影響

為了進一步探究UbcH5B-C85S是否阻礙Ub從E2轉移到E3，利用UbcH5B參與一個RING家族的 E3——TRIM23(分子量約為64kDa)的體外自泛素化[17].首先檢測UbcH5B-C85S自身是否可以參與TRIM23的泛素化.通過逐漸減少野生型UbcH5B的量和逐漸增加突變體UbcH5B-C85S的量，并且保持兩者總量為2 μM，結果顯示TRIM23自泛素化的“smear”條帶逐漸減弱.此外，當反應體系僅有UbcH5B-C85S時，幾乎沒有出現(xiàn)“smear”條帶(圖5a)，即使反應中的UbcH5B-C85S為16 μM，也沒有顯示TRIM23泛素化的“smear”條帶(圖5b).這些結果證實UbcH5B-C85S不能將Ub傳遞到TRIM23.更重要的是，在野生型UbcH5B參與的TRIM23自泛素化反應中，加入16 μM UbcH5B-C85S(圖5b和圖5d)，結果顯示TRIM23自泛素化水平明顯降低(圖5b)，表明UbcH5B-C85S抑制野生型UbcH5B參與TRIM23體外自泛素化.

圖5 UbcH5B-C85S不參與TRIM23泛素化(a)，但抑制UbcH5B 傳遞Ub到TRIM23(b)；(c)與圖(b)的等量相同反應體系的SDS-PAGE 分析結果

3 討 論

在蛋白質泛素化過程中，E2可以結合來自E1的泛素分子，隨后與E3合作將其傳遞到底物蛋白.隨著對E2的深入研究，發(fā)現(xiàn)E2不僅在泛素化過程中作為中間傳遞者，而且在調節(jié)泛素化過程中也有重要的作用[18].如某些E2背面可以非共價結合另一個Ub分子，從而別構活化RING 家族E3介導的泛素傳遞[6].此外，有的E2在其UBC domain或者非保守的N末端或者C末端延展區(qū)發(fā)生自泛素化，從而抑制E2本身的活性[10, 18].但目前研究E2水平的泛素化反應調控仍然較少.

本研究選擇與E1結合力較高的UbcH5B作為研究對象，將其催化活性的Cys85突變體成Ser，研究突變體UbcH5B-C85S是否可以調控泛素化.通過Western blot分析體外泛素轉移反應，發(fā)現(xiàn)UbcH5B-C85S、UbcH5B和E2-25K在非還原和還原條件下都顯示E2結合Ub的條帶，但在還原條件下沒有明顯的UbcH7結合Ub的條帶，表明UbcH7與Ub結合物可能對DTT更加敏感.當反應體系加入20 μM UbcH5B-C85S (野生型E2的2倍)，在一定程度抑制UbcH5B和E2-25K與Ub反應，但對 UbcH7與Ub反應干擾較小，暗示UbcH7可能通過另外的機制調節(jié)其反應活性.由此推測，不同E2的泛素轉移活性調節(jié)機制可能有差異.在UbcH5B-C85S不能將泛素傳遞到TRIM23前提下，將其加入UbcH5B參與的TRIM23體外自泛素化反應，當加入16 μM UbcH5B-C85S(UbcH5B 8倍)，TRIM23的自泛素化受到損害，表明UbcH5B-C85S阻礙野生型UbcH5B傳遞Ub到TRIM23.

目前，我們主要在體外泛素轉移反應中研究突變體UbcH5B-C85S對野生型E2泛素化的影響，為了更加深入理解E2的活性調節(jié)機制，我們將在體內(如細胞水平)研究突變體UbcH5B-C85S對野生型E2泛素化的影響.并且在相應的疾病模型中研究E2突變體對泛素轉移活性的影響，將為與E2活性調控關聯(lián)的疾病治療提供一定的依據.

4 結 論

為了研究UbcH5B活性位點突變體UbcH5B-C85S對野生型E2傳遞泛素活性的影響，通過體外泛素轉移反應，分別在E2水平和E3水平檢測UbcH5B-C85S對野生型E2參與泛素化過程的影響，獲得以下結論：

1) UbcH5B和E2-25K與Ub的結合物對DTT耐受，而UbcH7與Ub結合物則對DTT較敏感.

2) UbcH5B-C85S可以部分抑制UbcH5B和E2-25K與Ub的結合，但對UbcH7的泛素反應影響較小.

3) UbcH5B-C85S可以阻礙野生型UbcH5B參與TRIM23的體外自泛素化.