黨武辣椒快繁技術(shù)體系的優(yōu)化

鐘興菊， 劉紅美， 曾麗娜， 劉利利

(貴州醫(yī)科大學 生物與工程學院， 貴州 貴陽 550025)

0 引言

【研究意義】辣椒(CapsicumannuumL.)屬于茄科作物，在人類生產(chǎn)和生活中占有重要地位[1]，中國是世界第一大辣椒生產(chǎn)國與消費國[2]。近年來，貴州省作為中國辣椒的重要產(chǎn)區(qū)，將辣椒作為12個特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)之一進行打造[3]，貴州已成為我國辣椒種植面積最大的省份，因此可以說辣椒是貴州最具代表性的傳統(tǒng)特色優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)[4-5]。保證種苗質(zhì)量和數(shù)量的充足供應，對發(fā)展辣椒產(chǎn)業(yè)至關重要，因此針對不同辣椒品種開展快速繁育體系研究具有重要的現(xiàn)實意義?！厩叭搜芯窟M展】貴州省以山地、丘陵為主，這兩類地形面積占全省總面積的92.5%，地域環(huán)境變化導致地方自有辣椒品種種性退化[6]。為保持優(yōu)良品種的純度，提高其種性，防止品種退化，更好地發(fā)揮種質(zhì)優(yōu)勢的作用，急需對品種進行提純復壯[7]。組培快繁技術(shù)可避免常規(guī)的系統(tǒng)選育方法周期長、受不良因素影響大、品質(zhì)不穩(wěn)定等缺點[8]，故采用組培快繁技術(shù)對辣椒提純復壯，是實現(xiàn)辣椒改良的有效方法之一[9]?！狙芯壳腥朦c】黨武辣椒作為貴州省貴安新區(qū)地方品種，是長期人工選擇與自然選擇的產(chǎn)物，含有豐富的基因型。由于黨武辣椒經(jīng)過長期的自然雜交、機械混雜等[10]，品質(zhì)上出現(xiàn)明顯分化，病蟲害比較嚴重，加之農(nóng)戶的種植方式粗放，產(chǎn)量與品質(zhì)逐年降低。在對辣椒再生體系的研究中，激素配比、基因型及外植體類型對辣椒快繁再生具有重要影響[11]，亟待一套適合當?shù)乩苯钒l(fā)展的優(yōu)質(zhì)繁育體系。【擬解決的關鍵問題】通過對黨武辣椒去頂芽子葉的側(cè)芽分化離體培養(yǎng)快速繁育，篩選不同的消毒方法、外植體、植物生長調(diào)節(jié)劑及培養(yǎng)條件等，建立一套適合黨武辣椒快速繁育的技術(shù)體系，為黨武辣椒優(yōu)質(zhì)種苗生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

黨武辣椒種子采自貴州省貴安新區(qū)黨武鎮(zhèn)黨武辣椒種植區(qū)，試驗種子發(fā)芽率在93%以上。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲取 將種子放入培養(yǎng)瓶并滴入3 mL洗潔精，加入無菌水搖洗10 min，自來水流水沖洗1.5～2 h；將種子瀝干水分，倒入75%酒精搖洗30 s，無菌水清洗2次，再加3%次氯酸鈉溶液搖洗10 min，無菌水清洗5次，接種于1/2 MS培養(yǎng)基上(1/2 MS +蔗糖30 g/L +瓊脂8 g/L，pH 5.95～6.05)培養(yǎng)，放入培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為每天16 h光照，光照強度為2 500 lx[12]，溫度為25℃，10 d后統(tǒng)計發(fā)芽率。

1.2.2 外植體選擇 選取外植體為去掉頂芽且?guī)в腥~片(葉片留0.1～0.3 cm)的莖尖段(1 cm)[13]。

1.2.3 側(cè)芽分化培養(yǎng)基激素種類、苗齡與生長調(diào)節(jié)劑濃度的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，在此基礎上通過添加6-芐氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、赤霉素(GA3)、吲哚乙酸(IAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、硝酸銀(AgNO3)6種不同類型生長調(diào)節(jié)劑(表1)和不同激素配比進行側(cè)芽分化試驗(表2)，以芽分化率和分化倍數(shù)為參考指標，篩選出適合黨武辣椒側(cè)芽分化的激素和生長調(diào)節(jié)劑的配比；用初篩效果較好的用于愈傷組織途徑的2個配方和直接成苗途徑的1個配方再分別對15～30 d不同苗齡的外植體進行外植體苗齡梯度分化試驗；依據(jù)激素調(diào)控模式原理，通過微調(diào)低NAA濃度與調(diào)高6-BA濃度進行優(yōu)化試驗，篩選最佳配比濃度的生長調(diào)節(jié)劑。以上所有培養(yǎng)基均附加蔗糖 30 g/L +瓊脂 8 g/L(pH 5.95～6.10)。25 d后統(tǒng)計分化率。

表1 側(cè)芽分化培養(yǎng)基的植物生長調(diào)節(jié)劑組合

表2 側(cè)芽分化培養(yǎng)基組合

1.2.4 生根配方篩選 選擇愈傷誘導途徑中生長良好的1～2 cm苗[14]，以MS為基本培養(yǎng)基，在此基礎上添加0.01～0.5 mg/L不同濃度的NAA，15 d統(tǒng)計生根率，篩選出最佳生根配方。

1.2.5 馴化移栽 愈傷途徑中15～20 d的生根壯苗到苗高2 cm及以上后馴化移栽；直接成苗途徑中，選擇側(cè)芽分化生長良好的苗，待生根幼苗長出白色壯根[15]且達1 cm左右即可，揭開封口膜于培養(yǎng)室內(nèi)(25℃，2 500 lx)煉苗2～3 d，移栽到營養(yǎng)土(草炭土和珍珠巖[16-17]按體積比4︰1比例混合)中。

2 結(jié)果與分析

2.1 側(cè)芽分化培養(yǎng)基的最優(yōu)植物生長調(diào)節(jié)劑

由表3可見，試驗組2、試驗組3、試驗組5的分化率和分化倍數(shù)較高，NAA和6-BA搭配是適宜于黨武辣椒的最佳激素組合。試驗組2(NAA 0.05 mg/L+6-BA 0.5 mg/L)可直接促進側(cè)芽分化與生根，未發(fā)生愈傷組織，直接先分化出芽再長出根，苗生長綠色粗壯，但出根12 d后出現(xiàn)白化現(xiàn)象，7 d左右出現(xiàn)白化現(xiàn)象的苗有轉(zhuǎn)綠現(xiàn)象，但其轉(zhuǎn)綠后的生長效果不及未白化的苗。2,4-D、GA3對黨武辣椒的誘導效果較NAA、6-BA差；試驗組6、試驗組7中的IAA濃度不適用；試驗組5中GA3生長綠點效果較IAA的差。

表3 不同試驗組的側(cè)芽分化情況

2.2 不同激素配比的最優(yōu)側(cè)芽分化培養(yǎng)基

由表4可知，初篩試驗取苗齡15 d的外植體，側(cè)芽分化率最高的2種激素配比是0.1 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA 。試驗組的平均分化倍數(shù)為0.36，各試驗組均長出不同程度的愈傷組織(試驗組6=試驗組7>試驗組8=試驗組9>試驗組5>試驗組2=試驗組3>試驗組1>試驗組4)，其中試驗組1和試驗組4長出的分化芽粗壯綠色；試驗組6、試驗組7最先出現(xiàn)明顯的膨大愈傷，但后期出現(xiàn)較嚴重的褐化現(xiàn)象；試驗組8、試驗組9的愈傷組織結(jié)構(gòu)疏松、顏色淺而透明，質(zhì)地良好，但側(cè)芽分化效果不佳。

表4 NAA和6-BA不同配比的側(cè)芽分化程度

2.3 側(cè)芽分化的最佳苗齡和生長調(diào)節(jié)劑濃度

選取15 d、20 d、25 d、30 d共4個梯度苗齡的外植體，選用篩選的適合愈傷誘導途徑最佳的2個激素配比0.1 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA +1.0 mg/L 6-BA，與直接成苗途徑0.05 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA 進行試驗。從表5看出，黨武辣椒側(cè)芽分化的最適苗齡為25～30 d，其中30 d苗齡在0.05 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA 培養(yǎng)基上芽分化率為186%，分化效果最佳，愈傷出現(xiàn)不明顯；25～30 d苗齡的平均分化倍數(shù)為1.28，是15 d苗齡初篩試驗的3.56倍。

表5 不同苗齡與激素比的側(cè)芽分化情況

2.4 25 d、30 d苗齡下側(cè)芽培養(yǎng)基的最佳生長調(diào)節(jié)劑濃度

從表6可見，愈傷途徑分化芽6-BA的最佳濃度為5.0 mg/L，30 d苗齡的外植體分化率優(yōu)于25 d，因在達到快繁效果的同時也需考慮辣椒脫毒效果，故選取25～30 d的苗較佳；0.07 mg/L NAA 的愈傷分化效果較0.05 mg/L優(yōu)，但0.05 mg/L NAA的側(cè)芽分化生長效果較mg/L NAA 0.07 優(yōu)。由此表明，25～30 d苗齡、培養(yǎng)基條件為0.05～0.07 mg/L NAA +5.0 mg/L 6-BA是黨武辣椒側(cè)芽分化的最佳培養(yǎng)基濃度配比。

表6 25 d、30 d苗齡下不同激素比的側(cè)芽分化情況

2.5 不同濃度NAA誘導愈傷成苗的生根效果

不同濃度NAA誘導，9 d可見有根生長。從誘導率及苗的整體生長狀態(tài)(表7)對比看，0.01～0.05 mg/L NAA是誘導根的最佳的NAA濃度；0.1 mg/L NAA組的葉子生長狀態(tài)良好，但誘導率不高；0.5 mg/L NAA組的幼苗葉子出現(xiàn)枯黃狀態(tài)，且生長狀態(tài)不佳。表明，黨武辣椒根的最佳誘導濃度為0.01～0.05 mg/L NAA。

表7 NAA不同濃度誘導愈傷成苗根的生長情況

2.6 馴化移栽的存活率

愈傷途徑、直接成苗途徑生長良好的苗馴化2～3 d進行移栽，12 d后的存活率大于95%。

3 討論

3.1 辣椒外植體選擇與誘導分化

試驗選取去掉頂芽且?guī)в腥~片的莖尖段，優(yōu)點在于去除頂端優(yōu)勢的外植體可更好地進行光合作用，利用子葉葉柄的側(cè)芽獲得更佳的側(cè)芽分化效果。蘇榮存等[18]對韓國的優(yōu)良辣椒砧木驕珍108的研究中，種子發(fā)芽率達70%左右；許多研究選取的辣椒外植體有下胚軸[12-13,19-20]、子葉[21]、帶生長點的莖尖[22-24]和花藥[25]等，選取胚根[19]作為外植體的研究鮮有報道。張茹等[12，26]研究表明，在選擇的外植體中，誘導率依次為帶子葉葉柄的芽>子葉芽>下胚軸。

3.2 不同培養(yǎng)基與誘導分化

辣椒植物組織培養(yǎng)幾乎以MS培養(yǎng)基為主，運用激素調(diào)控模式原理，根據(jù)培養(yǎng)目的進行愈傷誘導或誘導分化直接成苗，6-BA在一定范圍內(nèi)(0～5 mg/L)，濃度越大越有利于誘導分化[22]，再配以其他植物調(diào)節(jié)劑NAA、TAA等效果更好。在篩選適合黨武辣椒側(cè)芽分化的植物生長調(diào)節(jié)劑類型和優(yōu)化試驗中發(fā)現(xiàn)，0.05 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA 可將黨武辣椒直接分化成苗；0.05～0.07 mg/L NAA +5.0 mg/L 6-BA 是對黨武辣椒進行愈傷誘導的最適配比。該結(jié)果與前人研究結(jié)果有所差異：覃芳[13]以子葉和下胚軸為外植體，篩選出最佳誘導出芽的激素配方是0.8 mg/L NAA +3 mg/L 6-BA ；柳建軍等[15]以下胚軸、子葉、帶柄子葉為外植體，得出5 mg/L 6-BA+0.5～1 mg/L IAA + 4 mg/L AgNO3為分化頻率最高的配方；龍鳳等[26]得出5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA為芽誘導分化的最佳激素組合。而肖英等[24]研究認為，IAA較適于辣椒生長點的轉(zhuǎn)綠成活，同時愈傷途徑分化芽6-BA的最佳濃度為5.0 mg/L。

直接成苗途徑中，生根12 d左右會出現(xiàn)白化現(xiàn)象，雖然7 d后白化有所轉(zhuǎn)綠，但整體上影響快繁技術(shù)的成功率。該途徑從育苗到生根整個快繁過程周期需50 d；愈傷途徑整個快繁周期需70 d。

3.3 不同苗齡與誘導分化

苗齡是辣椒外植體形成不定芽的一個重要因素[27]，一般認為辣椒離體培養(yǎng)的最佳苗齡在12～15 d，這樣可獲得較好的莖尖脫毒和分化效果[10]。經(jīng)4個苗齡梯度試驗得出，25～30 d苗齡較適合黨武辣椒的快繁技術(shù)體系培養(yǎng)。

4 結(jié)論

通過黨武辣椒側(cè)芽分化快繁技術(shù)體系優(yōu)化試驗表明，分化效果最佳的苗齡是25～30 d；直接分化出芽和根成苗途徑的最佳培養(yǎng)基是MS +0.05 mg/L NAA +0.5 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂 (pH 5.95～6.05)，分化倍數(shù)可達1.86倍；MS +0.05～0.07 mg/L NAA +5.0 mg/L 6-BA +30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂 (pH 5.95～6.05)是愈傷經(jīng)分化芽再長根的最佳培養(yǎng)基，分化倍數(shù)可達2倍以上；最佳生根培養(yǎng)基激素濃度為0.01～0.05 mg/L NAA ，根長而粗壯，苗生長狀態(tài)良好。