9種天然產(chǎn)物對茶炭疽病的抑制效果

饒家瑞，雷志偉*，周玉鋒，段學(xué)藝，王會云

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 茶葉研究所，貴州 貴陽 550006；2.貴州師范學(xué)院，貴州 貴陽 550018)

0 引言

【研究意義】茶炭疽病是茶樹主要病害之一，不僅降低茶葉產(chǎn)量，還嚴重影響茶葉品質(zhì)及經(jīng)濟效益[1]。目前，茶生產(chǎn)上仍以見效較快的百菌清、代森鋅、吡唑醚菌酯和苯醚甲環(huán)唑等化學(xué)農(nóng)藥為主進行該病防治[2]。但化學(xué)農(nóng)藥長期使用導(dǎo)致的農(nóng)藥殘留和抗藥性問題日漸突出，并與茶葉的綠色安全生產(chǎn)理念不符。在農(nóng)作物生產(chǎn)中，除蟲菊酯[3]、香芹酚[4]和印楝素[5]等植物源農(nóng)藥因其活性成分來源于植物，本身具有降解途徑、成分易分解和安全間隔期短而被用于許多大田作物[6]，但目前針對茶樹病害的植物源農(nóng)藥鮮見報道。因此，探究植物源農(nóng)藥對茶炭疽病的抑制作用，對茶樹病害的綠色防控和綠色農(nóng)藥的研制具有重要意義。【前人研究進展】前人對茶炭疽病的防治進行了諸多研究，李阿根等[7]研究顯示，苯醚甲環(huán)唑?qū)缴讲杼烤也【哂幸欢ǖ姆乐涡Ч诘?次藥后的7 d、14 d和28 d的防效分別為91%、76%和70%；唐美君等[8]研究表明，吡唑醚菌酯對茶炭疽病有較好的防治效果；郭遲鳴等[9]報道，0.5%香菇多糖和6%阿泰靈抗茶炭疽病的EC50分別為9.40μg/mL和18.25μg/mL?！狙芯壳腥朦c】近年來，由于中生菌素高效、低毒農(nóng)藥在茶葉生產(chǎn)上的大量使用[9]，不僅使茶炭疽病的防治效果得到了一定控制，而且還降低了茶葉的農(nóng)藥殘留。但茶葉生產(chǎn)過程中對農(nóng)藥殘留量的限定劑量要求很高，其農(nóng)藥殘留對茶葉品質(zhì)的影響仍不可忽視。因此，尋找和研制植物源天然產(chǎn)物進行茶樹病害防治迫在眉睫?！緮M解決的關(guān)鍵問題】植物源天然產(chǎn)物主要指植物的次級代謝產(chǎn)物[10]，其種類繁多，如萜類[11]、多酚類[12]、黃酮類[13]和生物堿[14]等天然產(chǎn)物中均含有不同的抑菌成分。目前，具有抗菌活性的植物源天然產(chǎn)物中，多數(shù)都含有醛基[15-16]、酚類[17]和多羥基[18-19]等基團。因此，選擇含有以上基團的9種植物源天然產(chǎn)物進行抗茶炭疽病的生物活性測試，期望發(fā)現(xiàn)高活性天然產(chǎn)物，并通過活體試驗探尋天然產(chǎn)物對茶葉感染茶炭疽病的保護和治療效果，旨在為茶炭疽病植物源天然綠色農(nóng)藥的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 茶炭疽病病原菌 茶炭疽病病原菌經(jīng)分離純化測序為Colletotrichumcamelliae病菌，由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所提供。

1.1.2 藥劑 香草醛(C8H8O3)來源于甜菜和香草豆，愈創(chuàng)木酚(C7H8O2)來源于灌木樹皮，百里香酚(C10H14O)來源于香旱芹，均購于上海阿拉丁試劑有限公司；吲哚(C8H7N)來源于植物頂端，購于上海九鼎化學(xué)有限公司；槲皮素(C15H10O7)來源于山楂和洋蔥，香葉木素(C16H12O6)來源于檸檬，芹菜素(C15H10O5)來源于芹菜，均購于上海麥克林有限公司；肉桂酸(C9H8O2)來源于蜂膠，L-薄荷醇(C10H20O)來源于薄荷，均購于上海樂研試劑有限公司；98%萎銹靈，購于上海麥克林有限公司；無水乙醇，購于天津市富宇精細化工有限公司；吐溫-80，購于天津市大茂化學(xué)試劑廠；其他試劑均購于上海安耐吉化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器 恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技有限公司；高溫蒸汽滅菌鍋，上海沉匯儀器有限公司；BHC-1300II A/B3生物潔凈安全柜，Mill-Q型超純水制備，規(guī)格為20～200 μL、100～1 000 μL和1～5 mL的移液槍，電子天平。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 以香草醛等9種植物源天然產(chǎn)物為試驗對象，98%萎銹靈農(nóng)藥為陽性對照，DMSO吐溫水為空白對照，共設(shè)11個處理。處理1為香草醛，處理2為愈創(chuàng)木酚，處理3為百里香酚，處理4為吲哚，處理5為槲皮素，處理6為香葉木素，處理7為芹菜素，處理8為肉桂酸，處理9為L-薄荷醇，處理10為陽性對照(CK1)98%萎銹靈農(nóng)藥，處理11為空白對照(CK2)等量DMSO吐溫水。試驗3次重復(fù)，隨機排列。

1.2.2 抗茶炭疽病的生物活性初篩

1) PDA培養(yǎng)基的配制。將土豆去皮后稱取800 g，放入4.5 L清水中熬煮后去掉土豆殘渣，將熬制完畢的土豆濾液與80 g瓊脂、80 g葡萄糖、12 g磷酸二氫鉀、6.0 g硫酸鎂 和40 mg維生素 B1混合均勻，然后以每瓶90 mL 轉(zhuǎn)移到 250 mL 錐形瓶中封口，并放入滅菌鍋在 121℃條件下高壓滅菌20 min，冷卻備用。

2) 藥液配制。用精度為0.001 0 g的天平稱取各待測天然產(chǎn)物10 mg，先用0.5 mL DMSO溶解，再轉(zhuǎn)移至有4.5 mL無菌吐溫水的15 mL離心管中搖勻，最后將其加入到制備好的45 mL PDA培養(yǎng)基中混勻，得到天然產(chǎn)物的最終濃度為100 μg/mL。趁熱將錐形瓶中含有各待測天然產(chǎn)物的培養(yǎng)基分別平均倒入3個培養(yǎng)皿中冷卻備用。

3) 茶炭疽病抑制率的測定。采用菌絲生長速率法[20]測定9種天然產(chǎn)物對茶炭疽病的抑制率。先用4.0 mm的打孔器在提前活化好的真菌培養(yǎng)基中打孔，用無菌接種針將直徑為4.0 mm的菌餅接種到含有不同天然產(chǎn)物的PDA培養(yǎng)基中，置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 6 d，空白對照組菌落長到 6.0 cm 左右時，采用“十字交叉法”用直尺測量菌落直徑，并計算抑制率。

抑制率=[(空白對照組凈菌落直徑-處理組凈菌落直徑)/空白對照組凈菌落直徑]×100%

1.2.3 抗茶炭疽病EC50的測定 根據(jù)9種天然產(chǎn)物抗茶炭疽病的初篩活性結(jié)果，挑選出活性較好的天然產(chǎn)物，按照濃度為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL的梯度配置藥液，采用菌絲生長速率法測定各濃度天然產(chǎn)物的抑菌活性。按照初篩方法計算各濃度下的天然產(chǎn)物抑制率，并以天然產(chǎn)物濃度的對數(shù)為自變量(x)，相對抑制率為因變量(y)，取對數(shù)得到天然產(chǎn)物對茶炭疽病的線性回歸方程，計算各天然產(chǎn)物的抑制率、抑制中質(zhì)量濃度EC50及相關(guān)系數(shù)(R)。根據(jù)EC50判斷天然產(chǎn)物的毒力大小，即天然產(chǎn)物的EC50越小，其對茶炭疽病病原菌的毒力越強。

1.2.4 對接種茶炭疽病茶葉的保護和治療效果 選擇貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所自主研發(fā)的茶葉品種“黔茶1號”作為受測植株。采摘帶細枝的嫩茶葉進行活體試驗。使用張欣等[21]的方法接種真菌，使用SCHAAD等[22]的方法評估葉片感病等級(DSA)，觀察篩選出的高活性天然產(chǎn)物對茶葉感染茶炭疽病后的保護和治療效果。

采摘細枝嫩茶葉帶回實驗室用純凈水洗凈備用。將活性最優(yōu)天然產(chǎn)物、陽性對照和空白對照分別設(shè)置保護組和治療組。試驗按2 d進行，第1天，分別取9片帶細枝嫩葉用濕棉花包裹其葉柄，將濃度為500 μg/mL活性最優(yōu)的天然產(chǎn)物和陽性對照萎銹靈分別均勻噴灑在保護組茶葉上(空白對照噴灑等量DMSO吐溫水)，自然晾干，待第2天接種炭疽病菌；治療組則在無菌條件下，用針頭輕輕刺破茶葉表面約4 mm2，然后接種相應(yīng)面積的炭疽病菌餅。第2天，將保護組的9片茶葉在無菌條件下用針頭輕輕刺破嫩葉片表面約4 mm2，然后接種相應(yīng)面積的炭疽病菌餅；將治療組的9片嫩葉均勻噴灑500μg/mL的百里香酚和陽性對照萎銹靈(空白對照噴灑等量DMSO吐溫水)，待其自然晾干。然后將嫩葉移于培養(yǎng)皿中，放置于25℃和90%相對濕度的培養(yǎng)箱中，5 d后觀察各組茶葉葉片感病等級。葉片感病等級：1級，DSA <5%；3級，DSA為6%～10%；5級，DSA為11%～20%；7級，DSA為21%～50%；9級，DSA>50%。

病情指數(shù)= [∑(每個感病等級的葉片數(shù)×相應(yīng)等級) / (葉片總數(shù)×最高感病等級)] ×100%

病情控制效率= (C-T)/C×100%

式中，C為對照組病情指數(shù)，T為藥物組病情指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010和DPS對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 9種天然產(chǎn)物對茶炭疽病菌的抑制率

茶炭疽病菌在100μg/mL濃度的9種天然產(chǎn)物藥液中均能生長。由表1可知，茶炭疽病菌培養(yǎng)6 d時的菌落平均直徑以CK2最大，為5.4 cm，與各處理差異均達極顯著；處理5其次，為4.8 cm，除處理7外，與各處理差異均達極顯著；處理3最小，為0.9 cm，與各處理差異均達極顯著。即除CK2外，以處理5的菌落生長速度最快，處理3最慢。

表1 9種天然產(chǎn)物(100 μg/mL)處理茶炭疽病的菌落直徑及抑制率

菌落直徑小于CK1的僅有處理3。9種天然產(chǎn)物對茶炭疽病菌的抑制率以處理3最高，為83.33%，較CK1(74.69%)增加8.64百分點；處理2其次，為76.55%，比CK1增加1.86百分點，其余7個處理的抑制率均低于CK1。說明，百里香酚和愈創(chuàng)木酚2種天然產(chǎn)物對茶炭疽病的抗菌活性均較好，并以百里香酚的抗菌活性最強。

2.2 2種抗菌活性較高的天然產(chǎn)物對茶炭疽病菌的毒力強度

2.2.1 不同濃度2種天然產(chǎn)物對茶炭疽病菌的抑制率 從表2可知，在6.75～100 μg/mL濃度下，隨著藥劑濃度增加，百里香酚、愈創(chuàng)木酚和CK1的菌落直徑均呈極顯著減小趨勢；在相同濃度下，百里香酚和愈創(chuàng)木酚的菌落直徑均小于CK1。

表2 2種天然產(chǎn)物不同濃度處理茶炭疽病的菌落直徑及抑制率

對茶炭疽病的抗菌活性以百里香酚最佳，在100 μg/mL 、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL濃度下的抑制率分別為85.05%、69.44%、54.49%、41.86%和27.57%，比CK1(73.42%、60.13%、41.2%、27.91%和12.29%)分別增加11.63百分點、9.31百分點、13.29百分點、13.95百分點和15.28百分點。說明，百里香酚在各濃度下的抗菌活性均優(yōu)于陽性對照萎銹靈。

2.2.2 毒力回歸方程 通過擬合得到2種天然產(chǎn)物對茶炭疽病病原菌的毒力方程(表3)：y百里香酚= 1.307 6x+ 3.341 6 (R=0.988 9)，y愈創(chuàng)木酚= 1.206 9x+ 3.310 6 (R=0.988 1)，相關(guān)系數(shù)均>0.95，表明2種天然產(chǎn)物藥劑濃度與抑制率間均存在良好的線性關(guān)系。

2.2.3 毒力強度 從表3看出，百里香酚和愈創(chuàng)木酚2種天然產(chǎn)物的EC50分別為18.55 μg/mL和25.11 μg/mL， 比CK1(35.33 μg/mL)分別減少用藥劑量16.78 μg/mL和10.22 μg/mL。表明，百里香酚對茶炭疽病病原菌的毒力強度最大，愈創(chuàng)木酚其次，均優(yōu)于陽性藥物對照萎銹靈。

表3 2種天然產(chǎn)物和對照藥劑對茶炭疽病病原菌的毒力回歸方程及EC50

2.3 百里香酚對接種茶炭疽病茶葉的保護和治療效果

從表4看出，保護組和治療組的茶炭疽病發(fā)病率均為100%，表明茶葉片成功接種了茶炭疽病菌。從病情指數(shù)看，噴灑等量DMSO吐溫水的CK2，其保護組和治療組的病情指數(shù)分別為77.78%和76.92%，均高于百里香酚(52.38%和47.62%)和CK1(61.9%和57.14%)。從控制效率看，百里香酚保護組和治療組對茶炭疽病的控制效率分別為32.66%和38.09%，比CK1(20.42%和25.72%)分別高12.24百分點和12.37百分點。表明，百里香酚用于治療茶炭疽病的效果優(yōu)于陽性對照藥物萎銹靈，是潛在的綠色植物源農(nóng)藥。

表4 百里香酚(500 μg/mL)和對照藥劑對茶葉感染茶炭疽病的保護和治療效果

3 討論

茶炭疽病(Colletotrichum)是貴州較為嚴重的茶樹病害，可導(dǎo)致茶樹大量落葉而影響春茶萌芽，使茶葉品質(zhì)和產(chǎn)量降低[23]。王玉春[24]從15個省的茶葉主產(chǎn)區(qū)茶樹病葉上分離獲得106株炭疽病菌，經(jīng)過基因系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和形態(tài)學(xué)鑒定，發(fā)現(xiàn)了C.acutatum、C.boninense、C.cliviae和C.gloeosporioides等12個種，通過致病力測試表明，C.aenigma、C.camelliae、C.endophytica、C.fructicola和C.truncatum可侵染茶樹并使其感病。本研究所用的茶炭疽病菌(Colletotrichumcamelliae)對茶樹具有較強的侵染性，選用香草醛等9種植物源天然產(chǎn)物包含的化學(xué)結(jié)構(gòu)主要有苯環(huán)、吲哚雜環(huán)、環(huán)己烷和苯并吡喃酮，其中苯環(huán)上連接了供電子基團羥基和甲基的百里香酚對茶炭疽病具有較強抗性，其EC50為18.55 μg/mL，試驗結(jié)果對今后研制茶炭疽病的綠色環(huán)保農(nóng)藥具有一定參考價值。因此，以后將嘗試用百里香酚進行相應(yīng)綠色農(nóng)藥研制，進行大田茶炭疽病的防治效果觀察，并對其藥物殘留進行檢測分析，旨在為植物源天然產(chǎn)物農(nóng)藥研制及田間病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

9種天然產(chǎn)物(香草醛、愈創(chuàng)木酚、百里香酚、吲哚、槲皮素、香葉木素、芹菜素、肉桂酸、L-薄荷醇)在100 μg/mL濃度下抗茶炭疽病的生物活性研究結(jié)果顯示，百里香酚和愈創(chuàng)木酚對炭疽病菌的抑制率分別為83.33%和76.55%，比陽性對照萎銹靈分別增加8.64百分點和1.86百分點，且百里香酚與陽性對照萎銹靈差異達極顯著，但愈創(chuàng)木酚與陽性對照萎銹靈差異不顯著。

活性較高天然產(chǎn)物在6.75～100 μg/mL濃度下的茶炭疽病菌菌落直徑及其抑制率研究結(jié)果表明，百里香酚、愈創(chuàng)木酚和陽性對照萎銹靈均隨藥劑濃度增加，其對應(yīng)菌落直徑呈極顯著減小趨勢；在相同濃度下，百里香酚和愈創(chuàng)木酚處理的菌落直徑均小于陽性對照萎銹靈。對茶炭疽病的抑制率以百里香酚最佳，在100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL和6.75 μg/mL濃度下的抑制率分別為85.05%、69.44%、54.49%、41.86%和27.57%，比陽性對照萎銹靈(73.42%、60.13%、41.20%、27.91%和12.29%)分別增加11.63百分點、9.31百分點、13.29百分點、13.95百分點和15.28百分點；愈創(chuàng)木酚其次，均優(yōu)于陽性對照萎銹靈。百里香酚和愈創(chuàng)木酚的EC50分別為18.55 μg/mL和 25.11 μg/mL，比陽性對照萎銹靈(35.53 μg/mL)分別減少用藥劑量16.98 μg/mL和10.42 μg/mL。說明，百里香酚對茶炭疽病的毒力強度最大，愈創(chuàng)木酚其次，均優(yōu)于陽性藥物對照萎銹靈。

活性最優(yōu)天然產(chǎn)物百里香酚抗茶炭疽病活體試驗結(jié)果顯示，在500μg/mL濃度下，百里香酚保護組和治療組對茶炭疽病的控制效率分別為32.66%和38.09%，比陽性對照萎銹靈(20.42%和25.72%)分別高12.24百分點和12.37百分點。百里香酚用于治療茶炭疽病的效果優(yōu)于陽性對照藥物萎銹靈，是潛在的綠色植物源農(nóng)藥。