瑞華麥523 PPO活性及1BL/1RS易位相關(guān)基因的分子檢測

王歆，金彥剛，夏中華，錢祿巧，鄭甲成

摘要：【目的】了解小麥品種瑞華麥523及其親本鄭麥9023和煙1604的PPO和1BL/1RS易位相關(guān)基因的遺傳信息，旨在提高優(yōu)質(zhì)小麥品種選育的效率?！痉椒ā坷眯←淧PO活性基因的分子標(biāo)記PPO18、PP0-B5、PPO16和PPO29及1BL/1RS易位的分子標(biāo)記H20，檢測小麥品種瑞華麥523及其親本相關(guān)基因的等位變異及來源?！窘Y(jié)果】小麥品種瑞華麥523在2AL染色體上PPO等位基因?yàn)镻PO-A1a基因型，與親本鄭麥9023一樣，為高活性PPO，不含親本煙1604的低活性PPO;在2BL染色體上PPO等位基因?yàn)锳型，與親本一致，是高活性PPO;在2DL染色體上PPO等位基因?yàn)镻PO-D1b基因型，與親本鄭麥9023一樣，是一個高活性PPO，不含親本煙1604的低活性PPO;利用分子標(biāo)記H20檢測表明，瑞華麥523和親本鄭麥9023一樣，是一個非1BL/1RS易位系。【結(jié)論】瑞華麥523是一個具有高活性PPO、非1BL/1RS易位系的小麥品種，其小麥PPO和1BL/1RS易位相關(guān)基因主要來自母本鄭麥9023，為該品種的推廣應(yīng)用和培育優(yōu)質(zhì)小麥新品種提供理論參考。

關(guān)鍵詞： 瑞華麥523;多酚氧化酶;易位系;分子標(biāo)記

中圖分類號： S512.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）09-2369-06

Molecular detection of PPO activity and 1BL/1RS translocation related genes in wheat cultivar Ruihuamai 523

WANG Xin1， JIN Yan-gang1，2， XIA Zhong-hua2， QIAN Lu-qiao1， ZHENG Jia-cheng1

（1College of Agronomy， Anhui Science and Technology University，F(xiàn)engyang， Anhui? 233100， China; 2Jiangsu Ruihua Agricultural Technology Co.， Ltd./Engineering & Technology Research Center for Wheat Commercial

Improvement in Jiangsu， Suqian， Jiangsu? 223800， China）

Abstract：【Objective】To understand the genetic information of PPO and 1BL/1RS translocation related genes of wheat cultivars Ruihuamai 523 and its parents Zhengmai 9023 and Yan 1604 for the efficiency of high quality wheat breeding. 【Method】The allelic variation and origin of the wheat cultivar Ruihuamai? 523 and its parent-related genes were detected using the molecular markers PPO18， PP0-B5， PPO16 and PPO29 and 1BL/1RS translocations of wheat PPO activity gene. 【Result】The PPO allele of wheat Ruihuamai 523 on chromosome 2AL was the PPO-A1a genotype， like the parent Zhengmai 9023. It was a highly active PPO， lowactive PPO without parent Yan 1604. The PPO allele on chromosome 2BL chromosome was type A， consistent with both parents. It was a highly active PPO. The PPO allele on chromosome 2DL was the PPO-D1b genotype， like the parent Zhengmai 9023， it was a highly active PPO， lowactive PPO without pa-rent Yan 1604. Using the molecular marker H20 detection indicated that， Ruihuamai 523 was the same as the parent Zhengmai 9023， it was a non-1BL/1RS translocation line. 【Conclusion】The wheat cultivar Ruihuamai 523 is a non 1B/1R translocation line with high activity of PPO.Its genes associated with PPO and 1BL/1RS translocation are mainly derived from female Zhengmai 9023. It provides some references for the variety application and the cultivation of new high quality wheat varieties.

Key words： Ruihuamai 523; polyphenoloxidase; translocation line; molecular marker

Foundation item： National Key Research and Development Program of China（2017YFD0100702）;Major New Variety Creation Project of Agriculture in Jiangsu （PZCZ201706）;Jiangsu Project for Transformation of Scientific and Technological Achievements（BA2017138）

0 引言

【研究意義】小麥多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）活性受多基因控制，其影響小麥品質(zhì)等性狀。隨著小麥基因組學(xué)的深入研究和分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用，小麥品質(zhì)性狀相關(guān)基因的定位、克隆及分子標(biāo)記開發(fā)，為利用分子育種技術(shù)培育農(nóng)作物新品種產(chǎn)生了一種重要的育種策略（何中虎等，2006;萬建民，2006;薛勇彪等，2007），因此，從分子水平上分析小麥品質(zhì)相關(guān)基因及遺傳機(jī)制，可為小麥遺傳育種和品種改良提供理論依據(jù)。【前人研究進(jìn)展】國內(nèi)外相關(guān)研究表明，小麥籽?；蛎娣鄣亩喾友趸富钚?、小麥—黑麥易位系1BL/1RS與小麥加工品質(zhì)密切相關(guān)（馬紅勃等，2015;高華利等，2016）。小麥籽?；蛎娣鄣亩喾友趸富钚耘c面制品顏色相關(guān)，多酚氧化酶活性在不同小麥品種間存在較大差異（楊子博等，2016），控制小麥多酚氧化酶活性的主效基因位于小麥第2同源染色體上，其相關(guān)基因被定位并開發(fā)相應(yīng)的分子標(biāo)記：在2A染色體長臂上的分子標(biāo)記PPO18能檢測出控制高、低多酚氧化酶活性的等位基因PPO-A1a和PPO-A1b（Sun et al.，2005）;在2B染色體長臂上的分子標(biāo)記PPO-B5能精確區(qū)分不同多酚氧化酶活性的小麥品種（祝梓博，2017）;在2D染色體長臂上的分子標(biāo)記PPO16和PPO29分別與較低或較高多酚氧化酶活性相關(guān)，其對應(yīng)等位基因分別是PPO-D1a和PPO-D1b（He et al.，2007）。1BL/1RS小麥—黑麥易位系攜帶抗銹病、白粉病等基因，在抗病性及產(chǎn)量等方面有一定的優(yōu)勢（周陽等，2004）。目前，檢測小麥品種1BL/1RS易位系的方法較多，其中PCR方法具有簡單、快速的特點(diǎn)（王曉軍等，2008;張勇等，2012）。瑞華麥523是江蘇瑞華農(nóng)業(yè)科技有限公司用母本鄭麥9023和父本煙1604雜交，連續(xù)定向系統(tǒng)選擇育成的小麥新品種，2014和2017年分別通過江蘇省和國家審定，該品種屬弱春性中熟小麥品種，產(chǎn)量潛力和綜合性狀良好，適宜在黃淮海麥區(qū)南部冬麥區(qū)中、晚茬種植（金彥剛等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】有關(guān)小麥品種瑞華麥523的選育、品種特性和栽培措施研究報(bào)道較多，但與其品質(zhì)性狀相關(guān)基因及遺傳分析不多。【擬解決的關(guān)鍵問題】對小麥品種瑞華麥523及其親本鄭麥9023和煙1604的多酚氧化酶、1BL/1RS易位系等品質(zhì)性狀基因進(jìn)行分子檢測和分析，明確相關(guān)基因在小麥品種瑞華麥523中的分布狀況，為小麥品種改良和親本選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的小麥品種為瑞華麥523及其親本鄭麥9023和煙1604，由江蘇瑞華農(nóng)業(yè)科技有限公司提供，種植于江蘇瑞華農(nóng)業(yè)科技有限公司淮北基地江蘇省宿遷市塘湖農(nóng)場，常規(guī)管理，幼苗期間采取其葉片。

1. 2 基因組DNA提取

在田間采取小麥幼嫩的葉片，按Murray和Thompson（1980）的CTAB法提取小麥基因組總DNA，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA含量，并稀釋最終濃度50 ng/μL備用，試驗(yàn)材料重復(fù)2次確保試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1. 3 品質(zhì)性狀相關(guān)基因特異性分子標(biāo)記及檢測

按照Sun等（2005）、祝梓博（2017）和He等（2007）開發(fā)的特異性分子標(biāo)記PPO18、PP0-B5、PPO16和PPO29，檢測小麥品種瑞華麥523及其親本在2A、2B和2D染色體上PPO活性的等位變異。利用Liu等（2008）開發(fā)的分子標(biāo)記H20檢測小麥1BL/1RS易位系，其相關(guān)引物序列由生工生物工程（上海）有限公司合成，引物信息見表1。15 μL PCR反應(yīng)體系：小麥基因組50 ng/μL DNA 2.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，1×PCR Mix（上海近岸蛋白質(zhì)科技有限公司）12 μL（含Taq酶、dNTPs、MgCl2、反應(yīng)緩沖液），在EDC-810基因擴(kuò)增儀（東勝國際貿(mào)易有限公司）上擴(kuò)增。

PPO18擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性40 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，37個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PPO-B5擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性45 s，57 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PPO16擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min，退火溫度由68 ℃開始，其后每個循環(huán)降低0.3 ℃，退火1 min，72 ℃延伸45 s，40個循環(huán);72 ℃延伸10 min。PPO29擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性1 min，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，38個循環(huán);72 ℃延伸10 min。H20擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性1 min ，64 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，25個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠（含0.1%的4S Green核酸染色劑）電泳分離檢測，緩沖液為0.5×TBE溶液，120 V電壓電泳50 min，在凝膠成像儀下觀察、拍照、保存、記錄，試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2. 1 瑞華麥523 PPO-2A位點(diǎn)等位變異

利用分子標(biāo)記PPO18對小麥品種瑞華麥523及親本鄭麥9023和煙1604在PPO-2A位點(diǎn)進(jìn)行檢測，產(chǎn)生了2種大小不同的帶型，即685 bp和876 bp帶（圖1）。瑞華麥523和親本鄭麥9023在PPO-A1a等位變異類型中可擴(kuò)增出685 bp帶，表明其含有較高的PPO活性;而親本煙1604在PPO-A1b等位變異類型中可擴(kuò)增出876 bp帶，表明其含有較低的PPO活性。初步表明瑞華麥523在PPO-2A位點(diǎn)上的PPO活性，與親本鄭麥9023一樣，基因型為PPO-A1a，是一個高活性PPO位點(diǎn)，而親本煙1604中的低活性多酚氧化酶特征帶在瑞華麥523中沒有檢測到。

2. 2 瑞華麥523 PPO-2B位點(diǎn)等位變異

分子標(biāo)記PPO-B5在PPO-2B位點(diǎn)上可產(chǎn)生450 bp、230 bp和190 bp 3種帶型，其中，含有450 bp、230 bp和190 bp帶的為A型，含有450 bp和230 bp帶的為B型含有230 bp和190 bp帶的為C型，只含有190 bp帶的為D型，A型和C型為高PPO，B型和D型為低PPO（祝梓博，2017）。本研究中利用分子標(biāo)記PPO-B5對小麥品種瑞華麥523及其親本鄭麥9023和煙1604在PPO-2B位點(diǎn)進(jìn)行檢測，均產(chǎn)生450 bp、230 bp和190 bp 3種帶型，是A型帶（圖2），初步表明瑞華麥523與親本鄭麥9023和煙1604在PPO-2B位點(diǎn)上基因型均為A型?？梢姡鹑A麥523在PPO-2B位點(diǎn)上的PPO活性，與親本鄭麥9023和煙1604一樣，均含有較高活性PPO等位基因。

2. 3 瑞華麥523 PPO-2D位點(diǎn)等位變異

利用分子標(biāo)記PPO16和PPO29對小麥品種瑞華麥523及其親本鄭麥9023和煙1604在PPO-2D位點(diǎn)進(jìn)行檢測，產(chǎn)生了2種不同的帶型PPO-D1a和PPO-D1b。瑞華麥523和親本鄭麥9023能在PPOD1b位點(diǎn)擴(kuò)增出490 bp帶（圖3-A），表明其含有較高的PPO活性;親本煙1604在PPO-D1a位點(diǎn)擴(kuò)增出713 bp帶（圖3-B），表明其含有較低的PPO活性。初步表明瑞華麥523在PPO-2D位點(diǎn)上的PPO活性，與親本鄭麥9023一樣，具有高活性PPO，而親本煙1604中的低活性PPO特征帶在瑞華麥523沒有檢測到。

2. 4 瑞華麥523 1BL/1RS易位系的檢測

利用與1BL/1RS易位系緊密連鎖的分子標(biāo)記H20，在含有1BL/1RS易位系的小麥品種中能擴(kuò)增出1598 bp帶，反之則無（Liu et al.，2008）。本研究中用分子標(biāo)記H20對瑞華麥523及親本鄭麥9023和煙1604小麥品種進(jìn)行1BL/1RS易位系的檢測，擴(kuò)增結(jié)果（圖4）顯示，親本煙1604能擴(kuò)增出1598 bp帶，表明親本煙1604是1BL/1RS易位系;而瑞華麥523和親本鄭麥9023中無相應(yīng)的擴(kuò)增條帶，說明瑞華麥523與親本鄭麥9023一樣，不攜帶1BL/1RS易位系，也表明親本煙1604所攜帶的1BL/1RS易位系沒有遺傳給小麥品種瑞華麥523，初步表明瑞華麥523是一個非1BL/1RS易位系。

3 討論

本研究利用相關(guān)分子標(biāo)記對小麥品種瑞華麥523在小麥第2同源連鎖群的PPO變異位點(diǎn)進(jìn)行分子檢測與分析，結(jié)果表明，瑞華麥523是一個具有較高PPO活性的小麥品種，其高活性PPO主要來自親本鄭麥9023小麥品種。小麥?zhǔn)敲嬷破返闹饕?，小麥籽粒中的PPO影響面制品色澤，利用控制小麥的PPO活性的相關(guān)分子標(biāo)記PPO16、PPO18和PPO29可輔助選擇低PPO活性的小麥品種（晏權(quán)等，2020）。楊子博等（2016）利用有關(guān)標(biāo)記對黃淮麥區(qū)254份小麥品種中PPO-2A和PPO-2D位點(diǎn)的等位變異檢測，篩選出低PPO活性組合PPO-A1b和PPO-D1a組合;王黎明等（2017）利用相關(guān)功能標(biāo)記，分析379份來自7個不同生態(tài)麥區(qū)的小麥種質(zhì)PPO活性基因等位變異的差異與分布狀況;在小麥第2同源連鎖群上也定位、克隆多酚氧化酶的有關(guān)基因，相應(yīng)分子標(biāo)記可有效地區(qū)分小麥品種多酚氧化酶活性的高低（祝梓博，2017）。因此，利用PPO18、PPO16與PPO29等分子標(biāo)記能快速鑒定小麥種質(zhì)中PPO活性的高低，本研究將這些分子標(biāo)記綜合利用檢測瑞華麥523及其親本PPO活性，研究結(jié)果與前人基本一致。隨著現(xiàn)代分子遺傳學(xué)、基因組學(xué)技術(shù)成果及研究理論在植物育種學(xué)中的應(yīng)用，產(chǎn)生了分子育種技術(shù)（王紅梅等，2020）。目前，以轉(zhuǎn)基因育種、分子標(biāo)記輔助育種和基因編輯技術(shù)等為代表的作物分子育種技術(shù)已成為作物遺傳改良的重要手段（黎裕等，2010），利用小麥分子育種技術(shù)能快速地鑒定和分析小麥種質(zhì)資源的重要基因。

本研究利用與小麥1BL/1RS易位基因相關(guān)分子標(biāo)記，檢測瑞華麥523及其親本鄭麥9023和煙1604，結(jié)果表明瑞華麥523是一個非1BL/1RS易位系小麥品種。國內(nèi)相關(guān)研究表明，小麥1BL/1RS易位系因攜帶抗小麥葉銹病、稈銹病、條銹病和白粉病等基因，其作為重要的小麥資源已被廣泛利用（董冬等，2011）。在1BL/1RS易位系中，醇溶蛋白和麥谷蛋白被黑麥堿蛋白所替代。與醇溶蛋白和麥谷蛋白相比，黑麥堿蛋白含有更多的谷氨酰胺，使得面粉形成較少的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，面筋強(qiáng)度下降，最后導(dǎo)致面包的加工品質(zhì)降低和食用品質(zhì)下降（馬小樂等，2015）;董冬等（2011）研究表明，來自同一遺傳背景下小麥1BL/1RS品系的平均產(chǎn)量顯著低于非1BL/1RS品系，說明小麥1BL/1RS對產(chǎn)量沒有顯著的正向作用，同時(shí)，因易位系1R短臂上的相關(guān)抗病基因已喪失抗性，因此，小麥1BL/1RS易位系在特定的遺傳背景和生態(tài)條件下已不具備可繼續(xù)利用的價(jià)值。也有研究表明，在黃淮海麥區(qū)，非1BL/1RS易位系小麥品種（系）占55%以上，強(qiáng)筋小麥品種絕大多數(shù)為非1BL/1RS易位系，推廣面積較大的鄭麥9023是一個非1BL/1RS易位系的強(qiáng)筋小麥（王曉軍等，2008）。本研究結(jié)果表明瑞華麥523與鄭麥9023一樣，是一個非1BL/1RS易位系，因此，利用小麥1BL/1RS易位基因相關(guān)分子標(biāo)記能準(zhǔn)確地區(qū)分小麥1BL/1RS易位系，提高優(yōu)質(zhì)抗病小麥新品種選育的效果。

4 結(jié)論

利用相關(guān)分子標(biāo)記檢測瑞華麥523及其親本鄭麥9023和煙1604中小麥PPO活性基因和1BL/1RS易位基因的遺傳信息，瑞華麥523是一個具有高活性PPO、非1BL/1RS易位系的小麥品種，其小麥PPO和1BL/1RS易位相關(guān)基因主要來自母本鄭麥9023。

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（責(zé)任編輯 鄧慧靈）