藥用植物青蒿不同種類的內(nèi)生菌抑菌活性分析

摘 要： 為了研究青蒿不同種類的內(nèi)生菌抑制細(xì)菌和抑制真菌的活性，該研究采用組織塊法和研磨法從青蒿的根、莖、葉中分離內(nèi)生細(xì)菌、放線菌和真菌，以大腸埃希菌（Escherichia coli）（CICC 23657）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）（CICC 10275）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（CICC 10384）、黑曲霉（Aspergillus niger）（CICC 2487）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（CICC 33032）為指示菌，采用瓊脂塊法和雙層平板法檢測內(nèi)生菌的抑菌活性。結(jié)果表明：（1）從青蒿植株中共分離到76株內(nèi)生菌，其中內(nèi)生細(xì)菌19株、內(nèi)生放線菌34株、內(nèi)生真菌23株。從分離部位來看，56株來自于莖段、17株來自于根段、3株來自葉片。（2）內(nèi)生細(xì)菌中抑菌活性菌株占總菌株的比例最高，為95%，內(nèi)生放線菌和內(nèi)生真菌中抑菌活性菌株的比例分別為41%、35%。（3）內(nèi)生細(xì)菌的抗菌譜較廣;雖然內(nèi)生放線菌的抗菌譜較窄，但其中高抗菌株較多，尤其對釀酒酵母的抑菌效果好。綜上結(jié)果顯示，藥用植物青蒿中存在著豐富的有抑菌活性的內(nèi)生菌，且不同種類的內(nèi)生菌抑菌活性不同。

關(guān)鍵詞： 青蒿， 內(nèi)生細(xì)菌， 內(nèi)生放線菌， 內(nèi)生真菌， 抑菌活性

中圖分類號(hào)： Q939 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A ?文章編號(hào)： 1000-3142（2021）07-1112-08

Abstract： In order to study the antimicrobial activity of different species of endophytes from Artemisia annua against bacteria and fungi， and provide the basis for the production of natural antimicrobial substances by endophytes. Endophytes were isolated from the roots， stems and leaves of A. annua by tissue isolation and grinding methods. With five representative microorganisms， Escherichia coli CICC 23657， Bacillus subtilis CICC 10275， Staphylococcus aureus CICC 10384， Aspergillus niger CICC 2487 and Saccharomyces cerevisiae CICC 33032 were used as indicating microorganisms， the antimicrobial activity of endophytes were detected by agar block method and double layer agar plate method. The results were as follows： （1） A total of 76 strains of endophytes were isolated from A. annua， including 19 strains of endophytic bacteria， 34 strains of endophytic actinomycetes and 23 strains of endophytic fungi. According to the plant parts of endophytes isolated， 56 strains were isolated from the stems， 17 from the roots and 3 from the leaves. （2）Among the endophytic species， 95% of the bacteria， 41% of the actinomycetes and 35% of the fungi showed antimicrobial activity， respectively. （3）The antimicrobial spectrum of endophytic bacteria was broad， while antimicrobial spectrum of endophytic actinomycetes was narrow， but there were many strains of endophytic actinomycetes with high antimicrobial activity， especially some strains of endophytic actinomycetes had strong antimicrobial activity against Saccharomyces cerevisiae. It can be seen that there are abundant endophytes with antimicrobial activity in A. annua， and different species of endophytes from A. annua showed different antimicrobial activity.

Key words： Artemisia annus， endophytic bacteria， endophytic actinomycetes， endophytic fungi， antimicrobial activity

植物內(nèi)生菌是一類重要的微生物資源，從20世紀(jì)90年代起逐漸成為微生物學(xué)家們關(guān)注的熱點(diǎn)（赫榮喬，2009;Wang & Dai， 2011;Sheng et al.， 2011）。近年來，越來越多的研究證明內(nèi)生菌可產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的次級(jí)代謝產(chǎn)物，因此，從植物內(nèi)生菌中獲得各種新資源是很有可能的（陳向東，2012）。藥用植物青蒿中最有價(jià)值的化學(xué)成分是青蒿素。青蒿素是目前治療瘧疾最有效的藥物，我國科學(xué)家屠呦呦因?yàn)榘l(fā)現(xiàn)青蒿素而獲得了2015年度的諾貝爾獎(jiǎng)（張鐵軍等，2016），而且這一成果正在申請新藥——可用于治療紅斑狼瘡。藥用植物青蒿中可能存在著能產(chǎn)生青蒿素的內(nèi)生菌，而青蒿素具有抗菌作用（文學(xué)，2009）。從青蒿中尋找有抗菌活性的內(nèi)生菌，進(jìn)一步研究其代謝產(chǎn)物，有助于找到產(chǎn)青蒿素的內(nèi)生菌。

國內(nèi)外關(guān)于內(nèi)生菌的研究報(bào)道雖然很多，但關(guān)于青蒿內(nèi)生菌的研究報(bào)道較少。劉金花等（2011）從黃花蒿的根、莖和葉中分離到內(nèi)生菌80株，通過形態(tài)觀察對內(nèi)生菌的種類進(jìn)行了初步鑒定;錢一鑫等（2014）對68株青蒿內(nèi)生真菌的抗腫瘤抗氧化活性進(jìn)行研究，篩選到8株內(nèi)生真菌具有細(xì)胞毒活性，5株內(nèi)生真菌有清除DPPH自由基活性;田小曼等（2008）從青蒿中分離到63株內(nèi)生菌，以棉花枯萎病菌等12種農(nóng)作物病原真菌為靶標(biāo)菌，研究內(nèi)生菌的抗病原真菌活性，篩選到1株內(nèi)生真菌、9株內(nèi)生細(xì)菌和3株內(nèi)生放線菌有較高抗菌活性;魏寶陽等（2008）從黃花蒿莖中分離到13株內(nèi)生真菌，以金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌為指示菌，研究內(nèi)生真菌的抗細(xì)菌活性，發(fā)現(xiàn)12株內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物至少對1種指示細(xì)菌有抑菌活性。目前尚未發(fā)現(xiàn)青蒿內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌和內(nèi)生真菌抗細(xì)菌和抗真菌活性的全面研究。

本研究以大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為指示細(xì)菌，以釀酒酵母和黑曲霉為指示真菌，全面研究青蒿內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌和內(nèi)生真菌對指示細(xì)菌和指示真菌的抑制效果，為今后青蒿內(nèi)生菌產(chǎn)天然抑菌物質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1藥用植物標(biāo)本 健康、無病蟲害野生青蒿的完整植株，9月份采自重慶市涪陵區(qū)蒿枝壩山上，取樣后流水沖洗干凈，分別取下其根、莖、葉，1 d內(nèi)處理完畢。

1.1.2 供試指示菌 本研究所用的指示細(xì)菌和指示真菌均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，指示細(xì)菌中的大腸埃希菌為革蘭氏陰性，枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性，指示真菌有黑曲霉和釀酒酵母，具體如表1所示。

1.1.3 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基名稱及用途如表2所示。

1.2 內(nèi)生菌的分離純化

青蒿的根、莖、葉經(jīng)5.4%次氯酸鈉表面消毒一定時(shí)間（根和莖各10 min，葉5 min）、無菌水漂洗后，無菌條件下，將根和莖切成1 cm左右的小段，葉進(jìn)行研磨。將根、 莖小段和0.1 mL葉的研磨上清液分別接種在牛肉膏蛋白胨、高氏I號(hào)和PDA平板上，放在合適的溫度下培養(yǎng)，從中分離內(nèi)生細(xì)菌、放線菌和真菌。

消毒可靠性檢驗(yàn)采用漂洗液檢查法和組織印跡檢查法（李玲玲等，2019）。

分離成功后采用平板劃線的方法進(jìn)行純化。

1.3 內(nèi)生真菌抑菌活性初篩

內(nèi)生真菌培養(yǎng)：挑取經(jīng)活化的內(nèi)生真菌菌絲或孢子點(diǎn)接至PDA固體平板中央，28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，備用。

指示細(xì)菌培養(yǎng)：將三種指示細(xì)菌分別接種于牛肉膏蛋白胨斜面上，37 ℃培養(yǎng)18 h。

抑菌初篩試驗(yàn)：采用瓊脂塊法（李玲玲等，2015）。

1.4 內(nèi)生菌發(fā)酵上清液抑菌活性測定

1.4.1 指示菌培養(yǎng) 將三種指示細(xì)菌分別接種于牛肉膏蛋白胨斜面上，36 ℃培養(yǎng)18 h;將釀酒酵母、黑曲霉接種于PDA斜面上，28 ℃分別培養(yǎng)2、7 d。

1.4.2 內(nèi)生菌上清液的制備 內(nèi)生菌的培養(yǎng)：將分離到的內(nèi)生細(xì)菌分別接入100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，放入36 ℃搖床，培養(yǎng)24 h;將分離到的內(nèi)生放線菌分別接入100 mL高氏I號(hào)液體培養(yǎng)基中，放入28 ℃搖床，培養(yǎng)5d;將分離到的內(nèi)生真菌分別接入100 mL PDA液體培養(yǎng)基中，放入28 ℃搖床，培養(yǎng)5 d。

內(nèi)生菌上清液的制備：將培養(yǎng)好的內(nèi)生菌菌懸液分別移入滅菌離心管中，12 000 r·min-1，離心10 min，小心吸出上清液，轉(zhuǎn)移至新的滅菌離心管中，用于抑菌活性篩選。

1.4.3 內(nèi)生菌發(fā)酵上清液抑菌活性篩選 采用雙層平板法（李玲玲等，2015）。將滴碟后的雙層平板先放入4 ℃冰箱預(yù)培養(yǎng)7 h，然后將接有供試細(xì)菌的雙層平板置于36 ℃恒溫培養(yǎng)18 h;接有供試釀酒酵母和黑曲霉的雙層平板置于28 ℃分別恒溫培養(yǎng)2、5 d。觀察并測量抑菌圈直徑。

1.5 數(shù)據(jù)分析

抑菌圈大小采用三次試驗(yàn)重復(fù)測量，采用SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)由平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

2.1 青蒿內(nèi)生菌的分離結(jié)果

各種消毒可靠性檢驗(yàn)平板上均未長菌，內(nèi)生菌分離平板上長菌，證明分離成功。從分離成功的平板上挑選不一樣的菌落或菌苔進(jìn)行劃線純化，直至得到純化的典型菌落。根據(jù)劃線純化過程中菌落的形態(tài)、顏色、邊緣狀態(tài)、透明度、表面干濕狀態(tài)等特征不同，統(tǒng)計(jì)分離出的菌株數(shù)。由表3可知，從青蒿根、莖、葉中共分離到內(nèi)生菌76株，其中內(nèi)生細(xì)菌19株、內(nèi)生放線菌34株、內(nèi)生真菌23株。從分離部位來看，76株內(nèi)生菌中：56株來自于莖段;17株來自于根段;僅3株來自于葉內(nèi)。表明莖段的內(nèi)生資源較豐富。

為了便于區(qū)分，將從青蒿根內(nèi)分離到的內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌、內(nèi)生真菌菌株分別標(biāo)記為蒿根細(xì)1-3、蒿根放1-11、蒿根真1-3;從莖內(nèi)分離到的內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌、內(nèi)生真菌菌株分別標(biāo)記為蒿莖細(xì)1-15、蒿莖放1-22、蒿莖真1-19;從葉內(nèi)分離到的內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生放線菌、內(nèi)生真菌菌株分別標(biāo)記為蒿葉細(xì)1、蒿葉放1、蒿葉真1。

2.2 內(nèi)生真菌抑菌活性初篩

采用瓊脂塊法初步檢測23株內(nèi)生真菌對3種供試細(xì)菌的抑菌活性，檢測到有6株內(nèi)生真菌對供試細(xì)菌有抑菌活性，結(jié)果如表4和圖1所示。

從初篩效果來看，僅蒿莖真1和蒿莖真16菌株對3種供試細(xì)菌的抑菌效果較好。青蒿內(nèi)生真菌對供試細(xì)菌的抑菌效果整體較差，有抑菌活性菌株的比例僅為26.0%。

2.3 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵上清液抑菌活性檢測結(jié)果

對19株內(nèi)生細(xì)菌（3株來自于根段，15株來自于莖段，1株來自于葉）的發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌活性檢測，檢測到18株有抑菌活性，有抑菌活性菌株的比例為95%（表5）。

總體上看，青蒿內(nèi)生細(xì)菌中有抑菌活性的菌株比例較高、抑菌譜較廣，對于供試真菌和細(xì)菌均表現(xiàn)出一定的抑菌作用;有抑菌活性的內(nèi)生細(xì)菌共有18株，其中14株來自于莖段。

2.4 內(nèi)生放線菌發(fā)酵上清液抑菌活性檢測結(jié)果

對34株內(nèi)生放線菌（11株來自于根段，22株來自于莖段，1株來自于葉）的發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌活性檢測，檢測到14株有抑菌活性，有抑菌活性菌株的比例為41%（表6和圖2）。

總體上看，青蒿內(nèi)生放線菌中有抑菌活性的菌株抗菌譜較窄，多數(shù)菌株僅對一種供試菌有抑菌活性，所有內(nèi)生放線菌均未對大腸埃希菌表現(xiàn)出抑菌活性。但是，內(nèi)生放線菌對供試真菌的抑菌效果較好，有抑菌活性的菌株多數(shù)為高抗菌株，特別是對釀酒酵母的抑菌效果好。由表6和圖2：A可知，蒿根放8（HG8）發(fā)酵上清液對指示菌黑曲霉的抑菌圈直徑達(dá)到了2.7 cm;由表6和圖2：B-D可知，蒿根放11（HG11）、蒿根放3（HG3）、蒿莖放12（HJ12）發(fā)酵上清液對指示菌釀酒酵母的抑菌圈直徑分別達(dá)到3.5、2.7、1.6 cm。

2.5 內(nèi)生真菌發(fā)酵上清液抑菌活性檢測結(jié)果

對23株內(nèi)生真菌（3株來自于根段，19株來自于莖段，1株來自于葉）的發(fā)酵上清液進(jìn)行抑菌活性檢測，檢測到8株有抑菌活性，有抑菌活性菌株的比例為35%（表7）。

總體上看，青蒿內(nèi)生真菌中有抑菌活性的菌株比例較低，抑菌效果也較差，特別是對金黃色葡萄球菌和釀酒酵母的抑菌效果差。

3 討論與結(jié)論

從藥用植物中分離、篩選能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似生物活性物質(zhì)的內(nèi)生菌已成為篩選微生物藥物的重要來源，特別是以抗菌、抗腫瘤等指標(biāo)為主的藥物開發(fā)，是植物內(nèi)生微生物研究中最耀眼的亮點(diǎn)（王志偉等，2014）。藥用植物青蒿化學(xué)成分中的揮發(fā)油和青蒿素都具有抗菌作用（文學(xué)，2009;張麗勇等，2011）。青蒿內(nèi)生菌長期與青蒿共存，可能產(chǎn)生青蒿揮發(fā)油或青蒿素，從而使內(nèi)生菌具有抑菌作用。

研究中發(fā)現(xiàn)青蒿不同種類的內(nèi)生菌抗菌譜不同，內(nèi)生細(xì)菌的抗菌譜較廣，內(nèi)生放線菌的抗菌譜較窄，這一結(jié)果與李潔（2010）的研究結(jié)果（31株黃花蒿內(nèi)生放線菌的抗菌活性譜廣）不太一致，這可能與采用不同地區(qū)的青蒿植株分離內(nèi)生菌，青蒿植株代謝產(chǎn)物不同， 導(dǎo)致它們的內(nèi)生菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不同有關(guān)。內(nèi)生放線菌中高抗菌株較多，尤其對釀酒酵母的抑菌效果好，這將為今后從青蒿內(nèi)生菌中篩選具有廣譜和選擇性的抗菌藥物提供依據(jù)。

在研究青蒿內(nèi)生真菌抑菌活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，青蒿的23株內(nèi)生真菌中僅5株有抑細(xì)菌活性，抑菌效果也較差（最大抑菌圈直徑10.8 mm）;而魏寶陽等（2008）的研究顯示13株黃花蒿內(nèi)生真菌中12株有抑細(xì)菌活性，且有兩株抑制病原細(xì)菌的活性較強(qiáng)（抑菌圈直徑>26 mm）。兩項(xiàng)研究中有抑菌活性的菌株比例不同，抑菌活性大小也不同，這可能與內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物處理方法不同有關(guān)。魏寶陽等（2008）研究內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物活性時(shí)，發(fā)酵液經(jīng)過濾、乙酸乙酯萃取和濃縮后用于抑菌活性檢測;而本研究內(nèi)生真菌的發(fā)酵液離心后直接收集上清液檢測抑菌活性，由于發(fā)酵產(chǎn)物未經(jīng)濃縮，可能導(dǎo)致部分抑菌活性較弱的內(nèi)生真菌未被檢測出。

本研究只是對內(nèi)生菌發(fā)酵上清液的抗菌活性進(jìn)行了研究，未對產(chǎn)生抑菌活性的物質(zhì)進(jìn)行分析，因此，今后還需對青蒿內(nèi)生菌進(jìn)一步研究：（1）抑菌效果好的內(nèi)生菌的發(fā)酵條件、抑菌物質(zhì)的提取方法以及化學(xué)結(jié)構(gòu)。（2）具有抑菌活性的內(nèi)生菌是否產(chǎn)青蒿素。以期為內(nèi)生菌發(fā)酵產(chǎn)天然抑菌物質(zhì)或青蒿素提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

CHEN XD， 2012. Endophytic microorganisms are valuable resources worthy to be explored deeply [J]. Microbiol Chin， 39（2）： 282. [陳向東， 2012. 植物內(nèi)生菌是有待深入開發(fā)的資源寶庫 [J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 39（2）： 282.]

HE RQ， 2009. Plant endophyte becomes one of hot topics in the current microbiological study in China [J]. Microbiol Chin， 36（1）： 1. [赫榮喬， 2009. 植物內(nèi)生菌成為我國當(dāng)前微生物研究領(lǐng)域的熱點(diǎn) [J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 36（1）： 1.]

LI J， 2010.Resources of endophytic actinobacteria associated with Artemisia annua and their influences on the growth and artemisinin biosynthesis of host plant [D]. Kunming： Yunnan University： 5. [李潔， 2010. 黃花蒿內(nèi)生放線菌資源及其對黃花蒿生長和青蒿素生物合成的影響 [D]. 昆明： 云南大學(xué)： 5.]

LI LL， LI QA， YI HX， et al.， 2019. Isolation of endophytes from Ginkgo biloba and screening of their antimicrobial activity [J]. Biotic Res， 41（3）： 249-254. [李玲玲， 李青愛， 易回香， 等， 2019. 銀杏內(nèi)生菌的分離及其抑菌活性篩選 [J]. 生物資源， 41（3）： 249-254.]

LI LL， LUO HC， ZHANG XS， 2015. Identification of endophytic fungi in Bupleurum and screening of antimicrobial activities [J]. Biotechnol Bull， 31（10）： 165-170. [李玲玲， 羅合春， 張先淑， 2015. 柴胡內(nèi)生真菌鑒定與抑菌活性篩選 [J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 31（10）： 165-170.]

LIU JH， WU LF， ZHANG HW， 2011. Isolation and preliminary identification of endophytes from Artemisia annua Linn [J]. Amino Acid Biotic Resour， 33（4）： 27-30. [劉金花， 吳玲芳， 章華偉， 2011. 黃花蒿內(nèi)生菌的分離與初步鑒定 [J]. 氨基酸和生物資源， 33（4）： 27-30.]

QIAN YX， KANG JC， GENG K， et al.， 2014. Study on antitumor and antioxidant activities of the endophytic fungi isolated from Artemisia annua [J]. J Fungal Res， 12（1）： 44-50. [錢一鑫， 康冀川， 耿坤， 等， 2014. 青蒿內(nèi)生真菌的抗腫瘤抗氧化活性 [J]. 菌物研究， 12（1）： 44-50.]

SHENG Q， KE X， JI HJ， et al.， 2011. Biodiversity， bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria [J]. Appl Microbiol Biotechnol， 89（3）： 457-473.

TIAN XM， WU YF， ZHANG Y， 2008. Isolation and screening of endophytes from Artemisia annua and their antagonistic activity to plant pathogens [J]. Acta Agric Boreal-Occident Sin， 17（4）： 186-196. [田小曼， 吳玉鋒， 張鈺， 等， 2008. 青蒿內(nèi)生菌的分離及抗病活性物質(zhì)的篩選 [J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 17（4）： 186-196.]

WANG Y， DAI CC， 2011. Endophytes： A potential resource for biosynthesis， biotransformation， and biodegradation [J]. Ann Microbiol， 61（2）： 207-215.

WANG ZW， CHEN YG， WANG QC， et al.， 2014. Progresses and perspectives of studies on plant endophytic microbes in China [J]. Microbiol Chin， 41（3）： 482-496. [王志偉， 陳永敢， 王慶璨， 等， 2014. 中國植物內(nèi)生微生物研究的發(fā)展和展望 [J]. 微生物學(xué)通報(bào)， 41（3）： 482-496.]

WEI BY， HUANG HY， LI SX， et al.， 2008. Screening of antifungal activity of endophytic fungi from Artemisia annua [J]. Hunan Agric Sci， （4）： 100-101. [魏寶陽， 黃紅英， 李順祥， 等， 2008. 黃花蒿內(nèi)生真菌的抑菌活性篩選 [J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)， （4）： 100-101.]

WEN X， 2009. Antibacterial effect of artemisinin-based [J]. J Ginseng Res， 21（4）： 38-39. [文學(xué)， 2009. 青蒿素抗菌作用研究 [J]. 人參研究， 21（4）： 38-39.]

ZHANG LY， LIN XM， ZHAN Y， et al.， 2011. Antimicrobial activity and GC-MS analysis of the volatile oil of Artemisia annua [J]. Chin J Exp Trad Med Form， 17（22）： 60-63. [張麗勇， 林秀梅， 戰(zhàn)月， 等， 2011. 不同方法提取青蒿揮發(fā)油成分分析及抗菌活性比較 [J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 17（22）： 60-63.]

ZHANG TJ， WANG YF， LIU D， et al.， 2016. Historical story on natural medicinal chemistry： Artemisinin—A milestone of traditional Chinese medicine study [J]. Chin Trad Herb Drugs， 47（19）： 3351-3361. [張鐵軍， 王于方， 劉丹， 等， 2016. 天然藥物化學(xué)史話： 青蒿素——中藥研究的豐碑 [J]. 中草藥， 47（19）： 3351-3361.]

（責(zé)任編輯 周翠鳴）