響應面優(yōu)化亞臨界水提取茶色素工藝研究

劉麗辰，黃秀紅，阮懌航，張祿煥，趙璇，林金科

（1.福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學安溪茶學院，福建 泉州 362400）

茶色素[1]（tea pigment，TP）是從茶葉中提取的一類水溶性酚性色素，包括茶黃素（theaflavin，TF）、茶紅素（thearubigin，TR）、茶褐素（theabrownin，TB）等，在茶葉加工過程中，由多酚類物質(zhì)經(jīng)酶促氧化聚合縮合反應形成的水溶性有色氧化產(chǎn)物。茶色素是具有抗氧化性[2-4]、調(diào)節(jié)神經(jīng)功能[5-6]、抗性血管疾病[7-8]、減肥[9]等眾多保健功效的一類茶葉特有的加工過程中形成的色素。隨著科研水平的不斷發(fā)展，天然色素取代人工合成色素已成為趨勢[10]，因此如何從茶葉中高效綠色提取茶色素變得十分重要。

亞臨界水（subcritical water，SW）提取是以亞臨界水為提取溶劑，在一定壓力范圍內(nèi)，將水加熱至100℃～374℃時依然能保持液體狀態(tài)[11]。目前亞臨界條件已廣泛應用于食品加工和植物天然產(chǎn)物提取[12-15]。此技術(shù)具有環(huán)境友好、提取效率高、操作方便等優(yōu)點，因此利用亞臨界水提取茶色素能達到提取過程綠色環(huán)保，且操作方便的目的[16]。本研究以紅茶為對象，通過亞臨界水提取其中的茶色素，通過響應面試驗設計優(yōu)化茶色素提取工藝，為茶葉天然產(chǎn)物提取的產(chǎn)業(yè)鏈提供一個技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

紅茶：福建省安溪縣惜緣茶業(yè)；DPPH、乙酸乙酯、95%乙醇、無水乙醇、正丁醇（均為分析純）：國藥集團上海化學試劑有限公司；超氧陰離子試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 試驗儀器

恒溫水浴鍋（HH-6）：國華電器有限公司；水浴搖床（MQS-30S）：旻泉儀器有限公司；可見分光光度計（721N）：上海精密科學儀器有限公司；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9123A）：上海齊欣科學儀器有限公司；真空冷凍干燥機（LGJ-12）：北京松源華興科技發(fā)展有限公司；AVATAR370型傅里葉紅外光譜儀：美國賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 茶色素的提取

將紅茶樣品粉碎過60目篩，放入-20℃冰箱備用。稱取紅茶粉末3.000 g，加入含有120 mL水的亞臨界反應釜中，料液比為1∶40（g/mL），設置提取條件為100 r/min、160℃、30 min，過濾后得上清液，記為SW組茶色素。以普通沸水提取作為對照，記為BW組茶色素。

1.3.2 總茶色素含量的測定

參照Roberts等[17]的系統(tǒng)分析法，進行茶葉提取液中TF、TR、TB的含量的測定，所有試驗重復3次，結(jié)果取平均值。其中總茶色素含量計算方式如下。

TP/%=TF+TR+TB

式中：TP表示總茶色素含量，%；TF表示茶黃素含量，%；TR表示茶紅素含量，%；TB表示茶褐色含量，%。

1.3.3 單因素試驗

對亞臨界水提法進行響應面優(yōu)化設計，首先進行單因素試驗。分別考察料液比[1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）]、亞臨界提取溫度（120、130、140、150、160 ℃）和亞臨界提取時間（5、10、15、20、25 min）對茶湯中茶色素含量的影響。

1.3.4 亞臨界水提取茶色素的響應面試驗

以總茶色素含量（TP）、茶黃素含量（TF）、茶紅素含量（TR）、茶褐素含量（TB）為響應值。采用三水平三因素的Box-Behnken試驗設計，研究利用亞臨界水提取茶色素的最佳提取參數(shù)。選取A料液比、B提取溫度、C提取時間3個因素，并設置3個水平，以-1、0、+1編碼，具體水平因素設計見表1。

表1 因素與水平設計Table 1 Factors and horizontal design

1.3.5 傅里葉紅外光譜分析

取1 mg干燥的茶色素樣品粉末與100 mg KBr固體粉末一起研磨，壓片機壓片，放入AVATAR370型的傅里葉紅外光譜儀中，在4 000 cm-1～400 cm-1范圍內(nèi)進行掃描，觀察峰譜情況。

1.3.6 總茶色素的體外抗氧化活性研究

采用DPPH·比色法進行測定，參照Yang等[18]方法，檢測DPPH自由基的清除率；利用超氧陰離子試劑盒檢測總茶色素的超氧陰離子的清除率。以普通沸水提取的總茶色素的抗氧化活性做對照，所有試驗重復3次，結(jié)果取平均值。

1.3.7 茶粉物理形態(tài)觀察

取適量經(jīng)亞臨界水處理后經(jīng)冷凍干燥的固態(tài)茶色素粉粒和沸水提取后的茶粉固態(tài)茶色素粉粒，通過陰極噴涂將樣品金覆蓋，在掃描電鏡上放大1 000倍，觀察樣品微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)差異性分析，運用Excel 2010進行表格的繪制，Prism進行圖像繪制，同時利用Design-Expert 10軟件進行回歸模型建立、方差分析及繪制響應曲面圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取劑提取茶色素的含量比較

茶色素在不同提取劑中的溶解性不同，得到的色素溶液顏色也不同。以沸水提取得到的茶色素溶液顏色為深棕色，而在亞臨界條件下水提取得到的色素顏色稍淺為棕色，但溶液較濃且不黏稠。檢測其TF、TR、TB、TP含量結(jié)果如圖1所示。

圖1 不同提取劑提取的茶色素含量Fig.1 The content of tea pigment extracted by different extraction agent

由圖1可知，SW組4種茶色素含量高于普通沸水提取法，且TF、TR、TB的含量增加較為明顯。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對茶色素含量的影響

不同料液比提取對茶色素含量的影響見圖2。

圖2 不同料液比提取的茶色素含量Fig.2 The content of tea pigment extracted by different solidliquid ratio

由圖2可知，反應前期，隨著溶劑增加，茶黃素有增大的趨勢，在料液比為 1∶20（g/mL）～1∶30（g/mL）時有降低的趨勢，而后繼續(xù)上升，在料液比為1∶50（g/mL）時，茶黃素含量達最高為2.9%。茶紅素和茶褐素的含量也隨溶劑增加而逐漸增大，在料液比1∶40（g/mL）時含量分別達到12.49%、16.22%。這可能是由于在溶劑較少時，茶色素溶解較少，使得各種茶色素提取率變化不大；隨著溶劑增加，茶粉與溶劑的接觸面積增大，茶色素的溶解量增加，從而所得到的各種茶色素含量升高。繼續(xù)增加溶劑，部分茶色素降解，導致提取率降低。所以最適料液比為1：40（g/mL），此時總茶色素含量為30.04%。

2.2.2 亞臨界水提取溫度對茶色素含量的影響

提取溫度的改變可以通過影響原料黏度和溶解速度來影響提取率，不同提取溫度提取的茶色素含量見圖3。

圖3 不同提取溫度提取的茶色素含量Fig.3 The content of tea pigment extracted by the different temperature of extraction

由圖3可知，在120℃～160℃之間，隨著溫度的升高茶黃素含量先減小后增大又減小，在150℃時達到2.39%。隨著溫度升高茶紅素含量有略微升高再下降的趨勢，在130℃時達到15.94%。茶褐素含量在120℃～140℃時變化不大，在溫度大于140℃后含量明顯下降，猜測其變化原因是由于非提取成分形成泡沫包裹在原料的表面，降低提取率，將溫度調(diào)至合適的范圍可以加速分子的運動從而提高溶解度，或者由于茶色素不耐高熱，開始降解所致。因此選擇140℃為最適提取溫度。

2.2.3 亞臨界水提取時間對茶色素含量的影響

不同提取時間提取的茶色素含量見圖4。

圖4 不同提取時間提取的茶色素含量Fig.4 The content of tea pigment extracted by different extraction time

由圖4可以看出，隨著提取時間延長，茶黃素的含量呈先升高后降低趨勢，在提取時間為20 min時茶黃素含量為2.05%。隨著提取時間延長茶紅素和茶褐素也是呈先升高后降低的波動變化趨勢。在10 min～15 min之間茶紅素和茶褐素含量變化起伏不大。推測在提取15 min左右提取環(huán)境達到固液相平衡，在平衡前適當?shù)匮娱L提取時間有利于更多成分析出；而隨著時間逐漸延長，茶色素開始降解，導致提取率下降。因此選擇15 min為最適提取時間。

2.3 亞臨界水提取茶色素的響應面試驗結(jié)果

采用三因素三水平的Box-Behnken試驗設計，以料液比、提取溫度、提取時間為獨立變量，以TF、TR、TB、TP的含量為響應變量的17個試驗，結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計與茶色素含量Table 2 Response surface experiment design and tea pigment content

2.3.1 茶黃素及茶紅素的Box-Behnken試驗

通過對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到茶黃素（TF）和茶紅素（TR）含量的二階方程式如下。

YTF=1.08-0.52A+0.081B-0.077C+0.3AB+0.26AC+0.063BC+0.29A2-0.28B2-0.17C2。

YTR=11.12-2.13A+0.31B-0.086C+0.98AB+0.80AC+0.36BC+1.33A2-1.18B2-0.97C2。

方差分析常被用于評估獨立變量和響應變量之間的關(guān)系以及提取方法的最佳條件，茶黃素和茶紅素的結(jié)果見表3。

表3 茶黃素及茶紅素含量方差分析Table 3 Variance analysis of theaflavin and thearubigin contents

由表3可知，茶黃素的模型P值達到極顯著水平且R2為0.968 7，說明該試驗設計成功。對茶紅素而言，模型的F值為25.14，P<0.01說明模型達到極顯著水平，具有統(tǒng)計學意義。茶紅素的失擬項P值為0.156為不顯著，R2為0.97，進一步表明該模型選擇合適。在TR方差分析中，各項的P值表明該因素對響應值的影響程度，從表中可以看出一次項A料液比和交互項AB的P值都達到極顯著水平，說明其對茶紅素含量影響較大。

響應面3D圖能直觀的看出各個因素對響應值的交互作用，各因素對茶黃素和茶紅素響應面3D圖見圖5。

圖5 各因素對茶黃素和茶紅素響應面3D圖Fig.5 Theaflavin and thearubigin response surface 3D diagram

由圖5a～圖5c中看出，當茶粉成分越低時，茶黃素的含量逐漸升高，各項因子對茶黃素提取的作用影響：料液比>提取溫度>提取時間。在此體系茶黃素最優(yōu)提取條件：料液比 1∶50（g/mL），提取溫度 144.3 ℃，提取時間11.46 min。

由圖5d～圖5f可知，隨著溶劑的增加，茶紅素的含量逐漸升高，這可能是由于提取溶劑太少時，茶粉與提取溶劑接觸不充分、不均勻，影響TR析出。各項因子對茶紅素含量的影響順序為料液比>提取溫度>提取時間，與茶黃素趨勢大致相同。提取時間對提取率影響最小，與前人結(jié)果相似[19-20]。在此體系中茶紅素最優(yōu)提取條件：料液比1∶50（g/mL），提取溫度132.72℃，提取時間9.74 min。

2.3.2 茶褐素及總茶色素的Box-Behnken試驗

通過對試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到茶褐素（TB）和總茶色素（TP）含量的二階方程式如下。

YTB=12.14-2.23A+0.099B+0.21C-0.23AB+0.10AC-0.29BC+0.98A2-1.91B2-0.44C2。

YTP=23.80-4.38A+0.50B-0.13C+1.07AB+1.05AC+0.54BC+2.94A2-2.71B2-1.30C2。

茶褐素和總茶色素的方差分析結(jié)果見表4。

表4 茶褐素及總茶色素含量的方差分析Table 4 Variance analysis of theabrownin and total tea pigment contents

茶褐素模型的F值為8.86，P<0.01且失擬項P值為0.084 6不顯著，R2值為0.919 3，表明該模型擬合成功。從表中得到一次項A料液比和二次項B2都存在極顯著差異。其中料液比、提取溫度、提取時間3者的交互作用對茶褐素含量影響不大。總茶色素（TP）模型的F值為16.49，P<0.001，模型達到極顯著水平，失擬項P值為0.056 7不顯著，R2為0.955，該模型擬合成功。其中一次項A料液比和二次項A2、B2，都達到極顯著水平，說明其影響趨勢與茶褐素相似。

各因素對茶褐素和總茶色素的響應面3D圖見圖6。

圖6 各因素對茶褐素和總茶色素的響應面3D圖Fig.6 Theabrownin and total tea pigment response surface 3D diagram

由圖6可知，由于TB含量的變化影響了TP含量的變化，因此TP圖形的變化趨勢與TB相似。隨著提取溫度的增加，TB含量和TP含量都有逐漸降低的趨勢，可能因為溫度過高茶色素熱敏導致茶色素溶解減少。各項因子對TB含量和TP含量的影響為料液比>提取溫度>提取時間。響應面試驗選擇提取茶褐素的最佳提取條件為料液比為1∶50（g/mL），提取溫度為140℃，提取時間為11.57 min；而Box-Behnken試驗選擇提取總茶色素的最佳提取條件：料液比為1∶50（g/mL），提取溫度為136.96℃，提取時間為10.16 min。

根據(jù)本研究目的，提取3種茶色素的含量最大化和最大限度的得到總茶色素，響應面試驗選擇TF、TR、TB和TP的最大值，軟件分析得到的提取條件：料液比1∶50（g/mL），提取溫度 138.1 ℃，提取時間 9.87 min。

2.3.3 結(jié)果驗證

通過響應面試驗，以篩選出來的提取條件進行茶色素提取，預測能得到的TF含量為1.23%、TR含量為14.85%、TB含量為14.91%、TP含量為30.98%。通過實際提取后對提取液進行檢測得到TF含量為1.31%、TR含量為14.37%、TB含量為13.34%、TP含量為29.02%。與模型預測值大致相同，說明模型擬合成功。

2.4 總茶色素的紅外光譜結(jié)果

2.4.1 普通沸水提取總茶色素得紅外光譜掃描結(jié)果

總茶色素在4 000 cm-1～0范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，結(jié)果見圖7。

圖7 BW組總茶色素紅外光譜圖Fig7 Infrared spectra of BW total tea pigment

由圖7可知，3 361 cm-1處有吸收峰，說明是由OH的伸縮振動引起的；1 704 cm-1處有吸收峰，說明是由-C=O 的伸縮振動引起的；1 656、1 583、1 458 cm-1有吸收峰，表明結(jié)構(gòu)中可能含苯環(huán)結(jié)構(gòu)；1 337 cm-1處有吸收峰，為O-H鍵的面內(nèi)彎曲振動；1 166 cm-1處有吸收峰，說明有=C-OH的存在，表明結(jié)構(gòu)中含有含有=C-OH結(jié)構(gòu)。

2.4.2 亞臨界水提總茶色素的紅外光譜掃描結(jié)果

總茶色素在4 000 cm-1～0范圍內(nèi)進行紅外光譜掃描，結(jié)果見圖8。

圖8 SW組總茶色素紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectra of SW total tea pigment

圖8中3384cm-1處有吸收峰，說明是由O-H的伸縮振動引起的；1 704 cm-1處有吸收峰，說明是由-C=O的伸縮振動引起的；1 655、1 581、1 458 cm-1有吸收峰，表明結(jié)構(gòu)中可能含苯環(huán)結(jié)構(gòu)；1 371 cm-1處有吸收峰，為O-H鍵的面內(nèi)彎曲振動；1 151 cm-1處有吸收峰，說明有=C-OH的存在，表明結(jié)構(gòu)中含有含有=C-OH結(jié)構(gòu)。

2.5 總茶色素的體外抗氧化性研究結(jié)果

2.5.1 總茶色素對DPPH自由基清除率的測定結(jié)果

體內(nèi)過多的自由基積累會造成細胞衰老和組織損傷[21-22]。茶色素為多酚氧化物，具有較強的抗氧化能力[23-24]。總茶色素對DPPH自由基清除率見圖9。

圖9 總茶色素對DPPH自由基的清除率Fig.9 The clearance of DPPH free radicals by total tea pigment

由圖9可知，總茶色素對DPPH自由基的清除率呈正相關(guān)，即隨著總茶色素濃度的升高，其DPPH自由基的清除率也隨之升高。當總茶色素濃度達到5 g/mL時，BW茶色素對DPPH自由基清除率達到55.90%，此時SW的清除率為88.10%。當總茶色素濃度為最小值0.5 g/mL時，SW組茶色素的DPPH自由基清除率已超過50%，此時BW組對DPPH自由基的清除率為12.66%。說明SW組提取得到的總茶色素對DPPH自由基具有較好的清除效果，且優(yōu)于普通沸水提取的茶色素。

2.5.2 總茶色素對O2-自由基清除率的測定結(jié)果

O2-·是生物體內(nèi)氧分子受單一電子還原產(chǎn)物，性質(zhì)活潑，具有很強的氧化性和還原性。其不發(fā)生化學改變對生物體沒有危害，但與羥基結(jié)和后的產(chǎn)物會導致細胞DNA損壞破壞機體功能?？偛枭貙Τ蹶庪x子自由基的清除率見圖10。

圖10 總茶色素對超氧陰離子自由基的清除率Fig.10 The clearance of super oxide anion free radicals by total tea pigment

由圖10可知，兩組色素對O2-自由基的清除效果較為一致。當色素濃度為5 g/mL時SW組對O2-自由基的清除率達到39.69%。兩組色素對O2-自由基的最大清除率都未超過50%。茶色素是茶多酚氧化聚合形成的酚性水溶性色素，其酚羥基活性較之茶多酚有所下降，因此對O2-自由基的清除率較低，與邢珂慧等[25]研究結(jié)果相似。

2.6 電鏡掃描結(jié)果

沸水提取的總茶色素粉粒和亞臨界水提取的總茶色素粉粒表觀形態(tài)圖如圖11所示。

圖11 不同提取方式提取后的茶粉電鏡掃描結(jié)果Fig.11 SEM results of tea powder extracted by different extraction methods

沸水提取的茶色素為平滑的片狀表面，表面凹凸不平，顆粒之間緊密聚集，而通過亞臨界水提取得到的茶色素粉粒，為不規(guī)則的微孔結(jié)構(gòu)，自身出現(xiàn)空隙，產(chǎn)物疊堆變得疏松，結(jié)構(gòu)變得更疏松，空隙更大色素粉粒分布更均勻。

3 結(jié)論

本研究探索了通過亞臨界水處理得到茶色素的提取方法，并評估其抗氧化活性，且與沸水提取得到的茶色素生物活性進行比較。研究發(fā)現(xiàn)利用亞臨界水能高效綠色的提取得到茶色素成品。通過響應面試驗進行亞臨界水提取茶色素工藝的優(yōu)化，最終篩選確定亞臨界水提取的最佳條件：料液比為 1∶50（g/mL），提取溫度為138.1℃，提取時間為9.87 min。SW提取的總茶色素對的DPPH自由基清除率顯著高于BW組，表現(xiàn)出良好的抗氧化活性。利用亞臨界水提取茶色素表現(xiàn)優(yōu)勢明顯，亞臨界水在天然產(chǎn)物的提取方面有巨大的潛力。