超高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定頸舒顆粒中4種皂苷類成分含量

李天佑，何 羽

（貴州省畢節(jié)市市場(chǎng)監(jiān)督管理局檢驗(yàn)檢測(cè)中心，貴州 畢節(jié)551700）

頸舒顆粒由三七、川芎、當(dāng)歸、紅花、肉桂、天麻、人工牛黃7味中藥組方[1]，具有活血化瘀、溫經(jīng)通竅止痛功效，治療頸椎病效果較好[2－4]。方中三七為君藥，功能散瘀止血、消腫定痛，用于治療出血、瘀滯腫痛、跌打損傷、胸腹刺痛等癥。2015年版《中國(guó)藥典（一部）》收載的頸舒顆粒[1]，含量測(cè)定項(xiàng)下僅對(duì)三七中人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1成分進(jìn)行指標(biāo)控制。超高效液相色譜（UPLC）法靈敏度高，分離效果好，檢測(cè)快速，可快捷、全面控制頸舒顆粒中三七的質(zhì)量。本研究中采用UPLC法同時(shí)測(cè)定頸舒顆粒中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和人參皂苷Rb1的含量[5－9]，可為該制劑的檢測(cè)、開發(fā)及質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters ACQUITY Classs型超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)；Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司)；PS－G60A型超聲波清洗機(jī)（東莞市潔康超聲波設(shè)備有限公司，功率為360 W，頻率為40 kHz）；ATSmol 1850C型超純水機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；MSE3.6P－OCE－DM型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器＜北京＞有限公司，精度為百萬分之一)；AY120型電子天平(日本島津公司，精度為萬分之一)。

1.2 試藥

頸舒顆粒(國(guó)藥集團(tuán)精方＜安徽＞藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)分別為200212，200403，191206)；三七皂苷R1對(duì)照品（批號(hào)為110745－201921，純度為93.1%），人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)為110704－201827，純度為93.1%），人 參 皂 苷Rg1對(duì) 照 品（批 號(hào) 為110703－201933，純度為93.4%），人參皂苷Re對(duì)照品（批號(hào)為110754－201827，純度為93.4%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；肉桂(批號(hào)為170501)，當(dāng)歸(批號(hào)為190403)，紅花(批號(hào)為190701)，天麻(批號(hào)為180601)，川芎(批號(hào)為190401)，均購(gòu)于貴州達(dá)靈藥業(yè)有限公司；人工牛黃（四川菲德力制藥有限公司，批號(hào)為170101）；乙醚、甲醇為分析純，乙腈為色譜純，均購(gòu)于美國(guó)Tedia試劑公司；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WatersBEHC18柱（50mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－水（B），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：0.6 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：1 μL。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution procedure of the mobile phase

2.2 溶液制備

分別取三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Re對(duì)照品2.281，2.737，4.103，1.220 mg，精密稱定，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。取樣品（批號(hào)為200212）1.0 g，混勻，研細(xì)，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，水浴微沸回流提取1 h，濾過，濾紙及藥渣揮干后置同一具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，取甲醇20 mL，分2次洗滌濾渣，濾液置同一蒸發(fā)皿中，蒸干，加水20 mL使殘?jiān)芙猓盟柡偷恼〈颊駬u提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并定容?0 mL容量瓶中，搖勻，濾過，即得供試品溶液。取肉桂、當(dāng)歸、紅花、天麻、川芎、人工牛黃，按頸舒顆粒處方及制備工藝煎煮、濃縮制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶劑(甲醇)及陰性對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣分析，色譜圖見圖1。結(jié)果供試品溶液4個(gè)主成分色譜峰與混合對(duì)照品溶液的4個(gè)主成分色譜峰保留時(shí)間一致，且在10 min內(nèi)完全分離，分離度均大于1.5，陰性對(duì)照無干擾。

圖1 超高效液相色譜圖1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Re 4.ginsenoside Rb1A.Blank solvent（methanol）B.Mixed reference solution C.Negative reference solution D.Test solutionFig.1 UPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.1，0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、各化學(xué)成分含量（X，μg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見表2。

表2 4種化學(xué)成分線性關(guān)系考察結(jié)果(n＝7)Tab.2 Results of linear relation test of four chemical constituents（n＝7）

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re峰面積的RSD分別為0.29%，0.63%，0.12%，0.83%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，4，6，8，12，16，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參 皂 苷Re峰 面 積 的RSD分 別 為1.08%，1.44%，0.96%，1.87%（n＝7），表明供試品溶液中4種皂苷成分在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為200212）適量，精密稱定，共5份，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人 參 皂 苷Re峰 面 積 的RSD分 別 為0.34%，0.41%，0.19%，0.84%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為200212）1.0 g，精密稱定，共6份，加入混合對(duì)照品溶液（三七皂苷R10.406 mg／mL、人參皂苷Rg10.907 mg／mL、人參皂苷Re 0.229 mg／mL、人參皂苷Rb10.466 mg／mL）3 mL，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

表3 頸舒顆粒中4種皂苷成分的加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of the recovery test of four saponins in Jingshu Granules（n＝6）

2.4 高效液相色譜(HPLC)法比較

取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，按頸舒顆粒含量測(cè)定三七項(xiàng)下的色譜條件[1]進(jìn)樣分析。色譜柱采用CAPCELL PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，3 μm）。結(jié)果供試品溶液中4個(gè)主成分色譜峰與混合對(duì)照品溶液中4個(gè)主成分色譜峰保留時(shí)間一致，且在70 min內(nèi)完全分離，分離度均大于1.5。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖（203 nm）1.notoginsenoside R1 2.ginsenoside Rg1 3.ginsenoside Re 4.ginsenoside Rb1A.Mixed reference solution B.Test solution Fig.2 HPLC chromatograms(203 nm)

2.5 樣品中皂苷類成分含量測(cè)定

取 樣 品3批(批 號(hào) 分 別 為200212，191206，200403)，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下和2.4項(xiàng)下色譜條件測(cè)定樣品中4種皂苷類成分的含量，再與2015年版《中國(guó)藥典（一部）》頸舒顆粒三七含量測(cè)定項(xiàng)下的色譜條件和供試品溶液前處理方法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果見表4。

表4 3種方法測(cè)定頸舒顆粒中4種皂苷類成分的含量（mg）Tab.4 Content determination of four saponins in each bag of Jingshu Granules determined by three methods（mg）

3 討論

原標(biāo)準(zhǔn)中乙醚脫脂靜置12 h時(shí)間過長(zhǎng)。參考文獻(xiàn)[10－16]，曾對(duì)比乙醚靜置、超聲和加熱回流脫脂后甲醇提取方法，綜合考慮采用甲醇超聲處理。結(jié)果人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的提取效率均高于2015年版《中國(guó)藥典（一部）》頸舒顆粒三七含量測(cè)定項(xiàng)下的樣品前處理方法。

用甲醇超聲提取后直接進(jìn)樣分析，在三七皂苷R1峰處和人參皂苷Rb1峰處雜質(zhì)峰太多，影響分離度。將甲醇提取液蒸干，加水溶解，再用水飽和正丁醇提取，蒸干，甲醇溶解后進(jìn)樣分析。結(jié)果在三七皂苷R1峰處和人參皂苷Rb1峰處雜質(zhì)峰均減少，達(dá)到完全分離（R＞1.5）。

HPLC法和UPLC法同時(shí)測(cè)定頸舒顆粒的含量，結(jié)果各成分測(cè)定值的RSD均小于1.5%，故可用UPLC法代替HPLC法測(cè)定頸舒顆粒中4種皂苷類成分的含量。

參考文獻(xiàn)[1]中的方法，人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1完全分離至少需要70 min，采用UPLC法在10 min內(nèi)就可同時(shí)完全分離人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1和人參皂苷Re4種成分，比原標(biāo)準(zhǔn)增加2個(gè)皂苷類成分的質(zhì)量控制，同時(shí)極大地縮短了分析時(shí)間，減少了試藥的用量。