高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定射麻口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量

申麗莎，楊巧虹，楊 帆，鄧開英，楊△

（1.重慶市中藥研究院，重慶400061；2.重慶醫(yī)療器械質(zhì)量檢驗(yàn)中心，重慶401147；3.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院·重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶401121）

射麻口服液由麻黃、膽南星、射干、黃芩、醋五味子等10味藥材經(jīng)提取制成，具有清肺化痰、止咳平喘功效，臨床主要用于外邪犯肺、入里化熱所致的咳嗽、痰多稠黏，胸悶憋氣，氣促作喘，喉中痰鳴，發(fā)熱或不發(fā)熱，舌苔黃或黃白，或舌質(zhì)紅，脈弦滑或滑數(shù)等證[1]1469。方中麻黃為君藥，發(fā)汗散寒，宣肺平喘，利水消腫[1]333。鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿為麻黃的主要有效成分，與射麻口服液療效直接相關(guān)。射麻口服液原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·新藥轉(zhuǎn)正標(biāo)準(zhǔn)（第十四冊(cè)）》[2]，僅對(duì)方中麻黃進(jìn)行了含量控制，方法缺乏專屬性，操作煩瑣，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。參考文獻(xiàn)[3－14]，本研究中建立了同時(shí)測(cè)定射麻口服液中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量的高效液相色譜（HPLC）法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695型高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世儀器有限公司）；BP211S型電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司，精度為十萬(wàn)分之一）；Simplicity－185型超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）。

1.2 試藥

鹽酸麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)為171241－201508，含量為99.8%），鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品（批號(hào)為171237－201510，含量為99.8%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；射麻口服液（海南中盛合美生物制藥有限公司，批號(hào)分別為20180101，20180102，20180103，規(guī)格為每支10 mL）；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液（含0.2%三乙胺和0.2%磷酸）－乙腈（97∶3，V／V）；流速：1.2 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取鹽酸麻黃堿對(duì)照品0.012 77 g、鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品0.010 84 g，精密稱定，分別置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，精密量取上述鹽酸麻黃堿溶液5 mL、鹽酸偽麻黃堿溶液3 mL，置同一25 mL容量瓶中，加甲醇－濃氨試液（95∶5，V／V）混合溶液稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。取樣品適量，混勻，精密量取5 mL，置50 mL容量瓶中，加0.1 mol／L鹽酸溶液定容，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液5 mL，加在依次用甲醇、水各6 mL預(yù)洗的Waters OSIS MCX固相小柱[以混合型陽(yáng)離子交換反相吸附劑為填充劑的固相萃取柱（規(guī)格為6 mL／150 mg，30 μm）]上，依次用0.1 mol／L鹽酸溶液、甲醇各6 mL洗滌，棄去洗滌液，繼續(xù)用新鮮配制的甲醇－濃氨試液（95∶5，V／V）混合溶液6 mL洗脫，收集洗脫液，置5 mL容量瓶中定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例和制備工藝制備不含麻黃的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，理論板數(shù)按鹽酸麻黃堿色譜峰計(jì)均不低于5 000。色譜圖見圖1。供試品溶液色譜中，鹽酸麻黃堿、鹽酸偽麻黃堿色譜峰均能達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，分離度良好，陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專屬性良好。

圖1 高效液相色譜圖1.ephedrine hydrochloride 2.pseudoephedrine hydrochlorideA.Mixed Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：分別精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2，5，10，15，20，25 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y麻＝2×106X麻－14 789（r＝0.999 9），Y偽＝2×106X偽－22 777（r＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果表明，鹽酸麻黃堿與鹽酸偽麻黃堿進(jìn)樣量分別在0.101 9～1.274 5 μg、0.051 92～0.649 0 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為0.89%和0.86%（n＝5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取新制備的同一供試品溶液，分別于室溫下放置0，2，4，8，12 h時(shí)進(jìn)樣10 μL，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿峰面積的RSD分別為1.17%和0.96%（n＝5），表明供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20180102）樣品適量，混勻，分別按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共5份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿含量的RSD分別為2.29%和2.42%（n＝5），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為20180102）3 mL，共6份，分別置50 mL容量瓶中，加入混合對(duì)照品溶液，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of the recovery test（n＝6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取3批（批號(hào)分別為20180101，20180102，20180103）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定2次，計(jì)算含量，取平均值。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg／mL，n＝2）Tab.2 Results of content determination of ephedrine hydrochloride and pseudoephedrine hydrochloride in the samples（mg／mL，n＝2）

3 討論

對(duì)測(cè)定麻黃堿常用流動(dòng)相（1）乙腈－0.1%磷酸溶液、流動(dòng)相（2）乙腈－0.1%磷酸溶液（含0.1%三乙胺）和流動(dòng)相（3）乙腈－0.02 mol／L磷酸二氫鉀溶液（含0.2%三乙胺和0.2%磷酸）進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)[3－14]，結(jié)果均能使射麻口服液樣品中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜峰達(dá)到基線分離，陰性對(duì)照無(wú)干擾，但流動(dòng)相（1）峰形拖尾嚴(yán)重；流動(dòng)相（2）因三乙胺的加入，峰形尖銳對(duì)稱，保留時(shí)間不穩(wěn)定，隨檢測(cè)時(shí)間的延長(zhǎng)會(huì)越來越快；流動(dòng)相（3）不僅峰形尖銳對(duì)稱，且保留時(shí)間穩(wěn)定，故最終選定流動(dòng)相（3）。

參照2015年版《中國(guó)藥典（一部）》麻黃藥材含量測(cè)定項(xiàng)下檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，同時(shí)記錄214 nm波長(zhǎng)下色譜峰情況，結(jié)果2個(gè)波長(zhǎng)下鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿響應(yīng)均良好，色譜峰峰形對(duì)稱，陰性對(duì)照無(wú)干擾，但210 nm波長(zhǎng)處響應(yīng)更靈敏，故選擇210 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)，樣品中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜峰分別與鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿對(duì)照品紫外可見分光光譜圖一致。

采用以混合型陽(yáng)離子交換反相吸附劑為填充劑的固相萃取柱（Waters OSIS MCX）對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理來制備供試品溶液，簡(jiǎn)單快速，有機(jī)溶劑消耗少，利于環(huán)保和批量檢測(cè)。研究過程中對(duì)固相柱吸附目標(biāo)檢測(cè)成分的能力、0.1 mol／L鹽酸和甲醇洗滌情況及甲醇－濃氨溶液（95∶5，V／V）混合液洗脫能力進(jìn)行了考察，確定了供試品溶液的制備方法。

曾將樣品加氨水堿化（pH 11.5）后用乙醚提取，合并乙醚提取液，再用0.1 mol／L鹽酸溶液提取，合并鹽酸提取液，加0.1 mol／L鹽酸溶液定容后作為供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果樣品中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜峰達(dá)到基線分離，峰型尖銳對(duì)稱，陰性對(duì)照無(wú)干擾，但供試品溶液制備方法煩瑣，乙醚用量較多，液液提取過程中乳化嚴(yán)重，需高速離心分層，故未采用。

采用3支不同品牌的色譜柱和2個(gè)不同廠家的液相色譜儀對(duì)供試品溶液進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果樣品中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿色譜峰均達(dá)到基線分離，色譜效果和含量測(cè)定結(jié)果一致，方法耐用性良好。