超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定毒蕈中6種鵝膏毒肽類和鬼筆毒肽類毒素

薛康 胡江濤 俞凌云 劉菲 馬麗 龔婷婷 華燚 陳佳玥

摘要 [目的]建立一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）快速測(cè)定野生毒蕈中6種鵝膏毒肽和鬼筆毒肽類毒素的分析方法。[方法]將采集的四川野生毒蕈子實(shí)體低溫烘干，用甲醇超聲提取，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，加水復(fù)溶，Oasis HLB固相萃取小柱凈化，經(jīng)Waters HSS T3色譜柱分離，ESI正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式分析。[結(jié)果]6種毒肽在50～1 000 μg/kg具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99，方法檢出限為30 μg/kg。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、羧基三羥鬼筆毒肽在低、中、高3個(gè)濃度的平均回收率在93.1%～117.5%，變異系數(shù)（CV）在1.49%～7.77%。[結(jié)論]該方法能準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定野生毒蕈中6種毒肽，適用于野生菌中毒肽毒素的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 野生毒蕈;鵝膏毒肽;鬼筆毒肽;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

中圖分類號(hào) R155.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）17-0182-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.048

Abstract [Objective]To establish a method for rapid determination of 6 kinds of amanitins and phallotoxins in wild poisonous mushrooms by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry（UPLC-MS/MS）.[Method]The wild mushrooms samples collected in Sichuan were dried at low temperature， the amanitins and phallotoxins in samples were extracted with methanol by ultrasonic extraction， then 40 ℃ rotary evaporation drying ，water redissolution， purified by HLB solid phase extraction column and separated on Waters HSS T3 column，lastly detected by electrospray（ESI+） in MRM mode. [Result] The 6 kinds of amanitins and phallotoxins had good linear relationships in the range of concentration 50-1000 μg/kg with the correlation coefficient value greater than 0.99.The detection limits of 6 kinds of amanitins and phallotoxins were 30 μg/kg.The average recovery rates of α-amanitin， β-amanitin，γ-amanitin， phalloidin， phallacidin and phallisacin at 3 spiked levels were 93.1%-117.5%. The coefficients of variation were 1.49%-7.77%. [Conclusion]The method can accurately and sensitively determine 6 kinds of amanitins and phallotoxins in poisonous mushrooms， which is suitable for the detection of amanitins and phallotoxins in wild mushrooms.

Key words Wild poisonous mushrooms;Amanitins;Phallotoxins;UPLC-MS/MS

毒蕈即日常所說(shuō)的毒蘑菇，是指不同類型的含有毒素的大型野生真菌，由于有些毒蕈在外觀上與食用菌沒(méi)有明顯區(qū)別，導(dǎo)致誤食毒蕈而引發(fā)中毒的事件時(shí)有發(fā)生，且在群體性食物中毒中，毒蕈中毒的致死率極高，其中肝損傷型毒蕈中毒致死率高達(dá)90%～100%[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)毒蕈中毒事件中，95%是由鵝膏菌屬引起的[2]。因?yàn)轾Z膏菌中含有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且毒性極強(qiáng)的鵝膏多肽類毒素，該類毒肽耐高溫、干燥和酸堿環(huán)境，一般的烹調(diào)加工不會(huì)破壞其毒性，不幸誤食后，毒肽就會(huì)通過(guò)消化系統(tǒng)進(jìn)入肝臟，對(duì)肝臟造成嚴(yán)重的損傷，最終引發(fā)多器官功能衰竭而死亡[3-5]?，F(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外一般采用高效液相色譜法、高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)毒肽毒素[6-11]，我國(guó)還沒(méi)有檢測(cè)毒肽毒素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此，該研究建立了一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定野生毒蕈中6種毒肽毒素的檢測(cè)方法，以期為野生菌毒素檢測(cè)提供一種高效的檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 儀器

UPLC lclass-XEVOTQ-XS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)Waters公司）;3H20RI離心機(jī)（中國(guó)赫西）;AE240電子天平（瑞士梅特勒）;XW-80A旋渦混合器（中國(guó)HUXI）;B8510E-DTH超聲波清洗器（美國(guó)必能信）;Mili-Q Integral 3超純水儀（美國(guó)Millipore公司）;ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，美國(guó)Waters公司）。

1.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨、氯仿，HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher公司。標(biāo)準(zhǔn)品：α-鵝膏毒肽（α-amanitin，純度≥90%，瑞士Alex）;β-鵝膏毒肽（β-amanitin，純度≥90%，瑞士Alex）;γ-鵝膏毒肽（γ-amaniyin，純度≥90%，瑞士Alex）;羧基三羥鬼筆毒肽（phallisacin，50 μg/mL，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司）;羧基二羥鬼筆毒肽（phallacidin，純度≥95%，瑞士Alex）;二羥鬼筆毒肽（phalloidin，純度≥90%，瑞士Alex）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

1.3.1.1 α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。 分別精確稱取α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1 mg，精確至萬(wàn)分之一，甲醇定容至10 mL，濃度為100 μg/mL。-20 ℃存儲(chǔ)。

1.3.1.2 鵝膏毒肽和鬼筆毒肽混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制。分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽儲(chǔ)備液以及2.0 mL羧基三羥鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，濃度為10 mg/L。

1.3.1.3 6種毒肽混合標(biāo)準(zhǔn)系列的配制。分別吸取50、100、200、400、600、1 000 μL，用初始流動(dòng)相定容至10 mL，配制成濃度為50、100、200、400、600、1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

1.3.2 樣品前處理。

1.3.2.1 提取。將新鮮野生菌樣品烘干（烘干溫度小于50 ℃）并打成粉末，精密稱取干燥粉末0.2 g，置于50 mL離心管中，加入甲醇10 mL，振蕩渦旋1 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心10 min后，移取上清液于另一離心管中。殘?jiān)性偌尤?0 mL甲醇，渦旋混合均勻，再次超聲提取10 min后以10 000 r/min離心，合并上清液。40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干，加2 mL水溶解，洗滌3次，得提取液。

1.3.2.2 凈化。分別用2 mL甲醇和純水淋洗活化Prime Oasis HLB固相萃取柱（3 mL，60 mg），再將以上提取液過(guò)柱，用2 mL含5%甲醇的水溶液淋洗2次，最后用2 mL甲醇-乙腈混合溶液（V∶V=3∶2）洗脫。將洗脫液在40 ℃水浴中氮吹近干，用1 mL初始流動(dòng)相[甲醇-5 mmol/L 乙酸銨（0.1%甲酸）=90∶10]溶解定容，溶液過(guò)0.2 μm濾膜后，待上機(jī)測(cè)定。

1.3.3 分析條件。

1.3.3.1 色譜條件。色譜柱為HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm，Waters公司）;流動(dòng)相 A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液， B為甲醇溶液;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量1.0 μL;洗脫程序見表1。

1.3.3.2 質(zhì)譜條件。電噴霧ESI正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）;離子源溫度150 ℃;毛細(xì)管電壓2.83 kV;脫溶劑溫度550 ℃;脫溶劑氣流量1 000 L/h;其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

鵝膏毒肽屬雙環(huán)八肽，鬼筆毒肽是一類環(huán)狀七肽，其支鏈上有較多的羥基和甲基，容易接受電子而被離子化，故常采用正離子模式進(jìn)行分析[6，12]。分別將6種毒肽的標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇稀釋成500 ng/mL，質(zhì)譜儀直接進(jìn)樣，在ESI正離子MS1Scan模式下，發(fā)現(xiàn)6種毒肽都有較強(qiáng)的M+1離子峰的出現(xiàn)，因此選定M+1為母離子，在Daughter Scan模式下，分別找到每種毒肽的2個(gè)最佳子離子。最后優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能、脫溶劑氣流量、脫溶劑氣溫度等質(zhì)譜參數(shù)，使離子化效率更高、離子強(qiáng)度最大。具體6種毒肽的母離子和子離子見表2。

2.2 色譜條件的優(yōu)化 試驗(yàn)選擇了UPLC HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），此色譜柱是與100%水相相兼容的C18柱，對(duì)保留和分離極性有機(jī)小分子具有較為理想的效果。該試驗(yàn)選擇研究了4組流動(dòng)相（A組水-乙腈;B組水-甲醇;C組0.1%甲酸水-甲醇;D組5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）-甲醇）的分離效果，試驗(yàn)表明，甲醇的分離效果比乙腈好，且使用5 mmol/L乙酸銨（0.1%甲酸）作為水相時(shí)，目標(biāo)物的離子峰強(qiáng)度較高，峰形較好。6種毒肽的標(biāo)準(zhǔn)提取離子圖詳見圖1。

2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

由于野生菌中成分復(fù)雜，脂肪、磷脂、肽類等雜質(zhì)含量較高，該試驗(yàn)采用了先溶劑提取、再固相萃取柱凈化的方法，先后比較了甲醇、水、乙腈3種溶劑的提取效果，結(jié)果表明，甲醇的提取效果較好，回收率高。

試驗(yàn)考察了在使用HLB固相萃取柱凈化過(guò)程中，5%甲醇-氯仿和5%甲醇-水淋洗液的淋洗效果，結(jié)果表明，5%甲醇-氯仿淋洗液對(duì)HLB小柱中吸附的脂肪、磷脂等雜質(zhì)具有較好的洗脫效果，但回收率較差。綜合考慮，該試驗(yàn)采用5%甲醇-水作為淋洗液。

2.4 線性范圍與檢出限 6種毒肽的線性方程、線性范圍和線性相關(guān)系數(shù)見表3。以3倍信噪比（S/N≥3）估算檢出限（LOD），6種毒肽的檢出限為30 μg/kg。

2.5 方法回收率和精密度

取1份樣品，分別對(duì)6種毒肽進(jìn)行低（50 μg/kg）、中（200 μg/kg）、高（600 μg/kg）濃度加標(biāo)試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4），平均回收率分別為α-鵝膏毒肽99.5%～

117.5%，β-鵝膏毒肽93.4%～107.0%，γ-鵝膏毒肽94.2%～110.1%，二羥鬼筆毒肽108.5%～119.8%，羧基二羥鬼筆毒肽 93.5%～109.7%，羧基三羥鬼筆毒肽93.1%～106.5%;6次平行測(cè)定，變異系數(shù)（CV）在1.49%～7.77%。

2.6 野生菌樣品檢測(cè) 按上述方法對(duì)采集到的10個(gè)四川野生菌樣品進(jìn)行前處理和檢測(cè)。在4號(hào)和6號(hào)樣品中檢出了α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和二羥鬼筆毒肽3種毒蕈毒素，具體結(jié)果見表5，譜圖見圖2和圖3。

3 結(jié)論

該研究基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（UPLC-MS/MS），采用甲醇提取， HLB固相萃取柱凈化，HSS T3 色譜柱分離，電噴霧ESI正離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方

式對(duì)6種毒蕈毒素的目標(biāo)離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，外標(biāo)法定量，建立了6種毒蕈毒素的快速、準(zhǔn)確、選擇性好的測(cè)定方法。該方法與傳統(tǒng)的色譜法的檢測(cè)時(shí)間（20 min）相比，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)具備更高的準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性，適用于野生菌中毒肽毒素的測(cè)定。

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