色譜技術(shù)在藥物-血漿蛋白相互作用研究中的應(yīng)用進(jìn)展

白 玉, 范玉凡, 葛廣波*, 王方軍

(1.中國醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院, 遼寧 沈陽 110122; 2.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 遼寧 大連 116023; 3.上海中醫(yī)藥大學(xué)交叉科學(xué)研究院, 上海 201203)

大多數(shù)藥物吸收入血后都會與血漿蛋白發(fā)生不同程度的可逆性結(jié)合,這種非共價(jià)相互作用主要包括靜電作用、氫鍵作用、疏水相互作用、范德華力等[1]。人血清白蛋白(HSA)和α1-酸性糖蛋白(AGP)都是血漿中重要的藥物結(jié)合蛋白[2-4]。HSA是血漿中豐度最高的蛋白,由585個(gè)氨基酸殘基組成,包含3個(gè)同源結(jié)構(gòu)域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ);各同源結(jié)構(gòu)域又細(xì)分為兩個(gè)子結(jié)構(gòu)域(A和B),各子結(jié)構(gòu)域分別由4和6個(gè)α-螺旋組成[5,6]。子結(jié)構(gòu)域A和B通過脯氨酸殘基提供的柔性環(huán)相對移動形成多個(gè)疏水空腔,使HSA表現(xiàn)出極強(qiáng)的藥物結(jié)合能力,能與酸性、堿性和中性藥物結(jié)合,進(jìn)一步影響藥物的轉(zhuǎn)運(yùn)、代謝、解毒和失活等過程[7,8]。HSA中已被鑒定的兩個(gè)主要藥物結(jié)合位點(diǎn)(Sudlow位點(diǎn)Ⅰ和Ⅱ)分別位于子結(jié)構(gòu)域ⅡA和ⅢA(見圖1[9]),具有不同的配體結(jié)合親和力[10,11]。其中,位點(diǎn)Ⅰ空腔較大,傾向結(jié)合較大的雜環(huán)化合物和二羧酸,如華法林、吲哚美辛、水楊酸等[12-14]。位點(diǎn)Ⅱ空腔狹小且剛性較大,對芳香族化合物具有較高親和力,如布洛芬、安定等[15]。其他HSA藥物位點(diǎn)還包括它莫西芬位點(diǎn)和洋地黃毒苷位點(diǎn)等[16]。AGP占血漿總蛋白的1%～3%,能夠與多種中性和堿性藥物結(jié)合,具有可飽和與可置換的藥物結(jié)合特性[2]。

圖1 HSA結(jié)構(gòu)及主要藥物結(jié)合位點(diǎn)(以HSA-肉豆蔻酸復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)為例,PDB ID: 1E7G)[9]

藥物與血漿蛋白的結(jié)合與解離通常處于動態(tài)平衡中,蛋白結(jié)合型藥物作為血液中藥物的一種暫時(shí)儲存形式,無法實(shí)現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)。只有游離的藥物分子才能通過被動擴(kuò)散或各種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白跨膜運(yùn)輸,到達(dá)酶或受體等特定藥物靶點(diǎn),發(fā)揮藥理活性[17,18]。因此,藥物血漿蛋白結(jié)合率的高低,能夠顯著影響其藥效學(xué)(PD)與藥動學(xué)(PK)特性,對于藥效發(fā)揮快慢、效價(jià)強(qiáng)度、血漿半衰期及代謝清除等過程有重要影響[19-21]。另一方面,當(dāng)血漿蛋白在外周循環(huán)中與多種藥物結(jié)合時(shí),一種藥物可能被另一種高濃度/強(qiáng)結(jié)合藥物所取代,使其游離型濃度增加,藥理作用或不良反應(yīng)增強(qiáng),最終引發(fā)藥-藥相互作用[3]。例如,磺胺類藥物可在血漿蛋白結(jié)合部位競爭性置換出降血糖藥甲苯磺丁脲,使后者游離型驟增,從而誘發(fā)低血糖[22]。藥物-藥物置換通常為特定結(jié)合位點(diǎn)的直接競爭,但也可能源于一種藥物通過變構(gòu)效應(yīng)改變其他藥物的結(jié)合[16]。綜上所述,針對藥物-血漿蛋白相互作用的研究,對于個(gè)性化精準(zhǔn)用藥、治療藥物監(jiān)測及新藥研發(fā)等都具有重要意義。

近年來,藥物-蛋白相互作用分析檢測方法得到了極大發(fā)展,主要包括:液相色譜(LC)[23]、超濾(UF)[24]、平衡透析(ED)[25]、質(zhì)譜(MS)[26]、熒光光譜(FS)[27]、圓二色譜(CD)[28]、表面等離子體共振(SPR)[29]、核磁共振(NMR)[30]、等溫滴定量熱(ITC)[31]、計(jì)算機(jī)模擬[32]等。色譜方法具有分離效率高、應(yīng)用范圍廣、易于自動化、能與多種檢測器兼容等優(yōu)點(diǎn),在藥物-蛋白相互作用研究中發(fā)揮著重要作用。用于表征藥物-蛋白相互作用的色譜技術(shù)主要有高效親和色譜(high performance affinity chromatography, HPAC)和毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis, CE)。本文主要針對這兩種技術(shù)的原理、最新進(jìn)展和應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 高效親和色譜法

HPAC是測定弱到中等強(qiáng)度藥物-蛋白動態(tài)相互作用的有效方法。在HPAC中,蛋白通常被固載在色譜固定相表面,進(jìn)樣到色譜流動相中的藥物分子與固定相上的蛋白發(fā)生相互作用,通過檢測藥物分子保留時(shí)間、洗脫輪廓或峰面積等獲取藥物-蛋白相互作用信息,包括結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量和位置、解離速率常數(shù)等[33,34]。

1.1 HPAC蛋白固定化方法

制備固載目標(biāo)蛋白的色譜固定相是HPAC的首要步驟,固定相載體和蛋白固定化方法對所固載親和蛋白的活性具有重要影響[35]。二氧化硅由于具有較高的機(jī)械強(qiáng)度、熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性,并且粒徑分布均勻,是目前廣泛應(yīng)用的HPAC固定相載體[33,36,37]。共價(jià)偶聯(lián)是蛋白固載的常用策略,利用表面修飾氨基、環(huán)氧基、醛基、羥基、羧酸等功能基團(tuán)的固相載體,與目標(biāo)蛋白上特定氨基酸殘基側(cè)鏈形成共價(jià)連接[38]。Zhang等[39]將刀豆蛋白A和橙黃網(wǎng)胞盤菌凝集素通過還原胺化法固定在二氧化硅上,開發(fā)了一種凝集素親和微柱,用于分離和分析AGP的糖型組分。Liang等[40]利用鹵代烷烴脫鹵酶和氯代烷烴之間的生物正交反應(yīng),將Halotag標(biāo)記的血管緊張素Ⅱ1型受體共價(jià)固定到6-氯己酸衍生物修飾的氨基聚苯乙烯微球上,測定了4種藥物與受體的相互作用。Li等[41]將β2-腎上腺素能受體(β2-AR)共價(jià)固定在N,N-羰基二咪唑活化的聚苯乙烯氨基微球上,比二氧化硅固定相具有更高的生物相容性。共價(jià)偶聯(lián)方法存在多位點(diǎn)連接、蛋白固載取向不均一、蛋白活性降低等問題[42,43]。包埋法也是一種常用的蛋白固載策略,利用輕度氧化糖原作為封蓋劑,通過它與肼活化載體結(jié)合將蛋白包埋于載體中,可保持蛋白質(zhì)在載體中的可溶性和高活性[43,44]。Rodriguez等[44]開發(fā)了一種免疫提取/包埋系統(tǒng),從血清樣本中捕獲HSA,通過包埋法制備親和色譜柱,用于HSA與多種磺酰脲類藥物結(jié)合的研究。

1.2 HPAC常用分析方法

1.2.1前沿色譜法

前沿色譜法是一種常用的親和色譜技術(shù),可用于測定色譜柱容量、藥物-蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)量、各位點(diǎn)的平衡常數(shù)以及整體結(jié)合強(qiáng)度等[13,45]。前沿色譜法基本分析流程為:將藥物溶解于流動相中,以固定流速通過固載目標(biāo)蛋白的親和柱,隨著親和固定相的吸附飽和,藥物流出濃度逐漸增加,最終形成突破曲線(見圖2);改變藥物濃度,突破時(shí)間隨之改變[13,46]。

圖2 HPAC前沿色譜法進(jìn)行藥物-蛋白相互作用研究的示意圖

當(dāng)藥物分子與固載蛋白為單一位點(diǎn)結(jié)合時(shí),親和柱飽和吸附量mL, app與藥物濃度[A]的關(guān)系為[47]:

(1)

其中Ka為結(jié)合平衡常數(shù),mL為蛋白柱包含的結(jié)合位點(diǎn)總數(shù)。

當(dāng)親和蛋白中存在多種類型結(jié)合位點(diǎn)時(shí),吸附譜圖將表現(xiàn)出與線性響應(yīng)的負(fù)偏差,需要采用非線性結(jié)合模型和方程進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合[48]。前沿色譜法已被應(yīng)用于HSA糖化對磺酰脲類藥物格列齊特、格列本脲、格列吡嗪、氯丙胺等結(jié)合影響機(jī)制的研究[4,33,49,50];以及手性藥物與蛋白的相互作用研究,例如普萘諾爾與低密度脂蛋白(LDL)的立體選擇性結(jié)合、甲磺酸伊馬替尼與牛血清白蛋白(BSA)的結(jié)合[51,52]等。

He等[13]在前沿色譜的基礎(chǔ)上發(fā)展了多步前沿色譜法,通過采用一系列由低到高濃度的藥物溶液形成多個(gè)吸附階梯平臺,測得了HSA和AGP與模型藥物的結(jié)合常數(shù)。與常規(guī)前沿色譜法相比,該方法只需要在最后進(jìn)行親和色譜柱沖洗,簡化了改變藥物濃度所產(chǎn)生的多次沖洗和平衡過程,也減少了樣品消耗量。此外,多步前沿色譜法與細(xì)胞膜色譜法(CMC)結(jié)合也被用于研究藥物與膜受體相互作用的平衡解離常數(shù)[53,54]。Li等[41]發(fā)展了一種前沿親和色譜-質(zhì)譜(FAC-MS)與吸附能分布計(jì)算結(jié)合的方法,用于分析β2-AR-藥物相互作用。該方法先采用FAC-MS測定沙丁胺醇、特布他林和偽麻黃堿在β2-AR上的原始吸附數(shù)據(jù);再利用吸附能分布計(jì)算優(yōu)化選擇了3種藥物與β2-AR結(jié)合的最佳吸附模式,分析準(zhǔn)確度和精密度顯著提高。2019年,Sun等[55]將前沿親和色譜與吸附能分布計(jì)算結(jié)合,并用于研究華法林、L-色氨酸和麻黃堿在固載BSA表面的非均相吸附。

1.2.2競爭置換洗脫法

競爭洗脫法可用于測定藥物在目標(biāo)蛋白上特定位點(diǎn)的結(jié)合[56]。該方法將藥物溶解于流動相中,并進(jìn)樣一定量的特異性位點(diǎn)探針,如果藥物和探針在固載蛋白上存在相同結(jié)合位點(diǎn),探針的保留時(shí)間將隨所添加藥物濃度的改變而變化,由此獲得藥物在特定位點(diǎn)的相互作用信息(見圖3)[12,56]。

圖3 HPAC競爭洗脫法進(jìn)行藥物-蛋白相互作用研究的示意圖

特異性位點(diǎn)探針的保留因子(k)計(jì)算公式為:

(2)

其中tR為探針保留時(shí)間,t0為死時(shí)間。k和流動相中藥物濃度[I]的關(guān)系如下[57,58]:

(3)

其中mL為探針與藥物在固定配體上共同結(jié)合位點(diǎn)的物質(zhì)的量,Vm為柱的空隙體積,KA和KI分別是探針和藥物在同一競爭位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)。當(dāng)探針與藥物為單位點(diǎn)競爭時(shí),1/k與[I]為線性關(guān)系,可通過斜率和截距的比值得出藥物在該位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)(即KI);如果存在多位點(diǎn)結(jié)合或其他相互作用,則會與預(yù)測線性關(guān)系存在偏差,這時(shí)可測得藥物和蛋白的整體親和力[12,57]。

前沿分析法需要向色譜柱中連續(xù)輸入樣品,與競爭洗脫法相比通常需要更大的樣品用量以及更長的分析時(shí)間。但是前沿色譜分析中各結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合常數(shù)測定之間沒有相互干擾,具有更高的精確度,且能夠同時(shí)確定親和蛋白中結(jié)合位點(diǎn)數(shù)目和各個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)信息[46,47,60]。在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí),一般先采用前沿色譜分析法測定藥物與蛋白質(zhì)的整體結(jié)合強(qiáng)度,再通過特異性競爭置換洗脫確定特定位點(diǎn)的相互作用信息,如直接競爭、正或負(fù)變構(gòu)效應(yīng)、無競爭等[33]。

1.2.3超快親和提取法

超快親和提取是一種檢測藥物游離組分的色譜方法,可直接在溶液體系中檢測藥物和蛋白的結(jié)合情況[63,64]。該方法將含有藥物/蛋白混合物的樣品上樣到含有固載目標(biāo)蛋白的親和微柱上[64]。當(dāng)流速足夠高時(shí),藥物-蛋白復(fù)合物和可溶性蛋白被洗脫為非保留峰,此時(shí)可以測定原始樣品中游離藥物組分并計(jì)算結(jié)合常數(shù)[65]。當(dāng)采用低至中等流速,樣品流過色譜柱時(shí),一些與可溶性蛋白結(jié)合的藥物會從中解離,增加游離藥物濃度,此時(shí)可測定兩者的解離速率常數(shù)[66]。近幾年,除單柱體系外,結(jié)合超快親和萃取和雙柱系統(tǒng)的方法也被用于測定血清等復(fù)雜樣品中藥物的游離組分,估算藥物與蛋白的整體親和常數(shù)[20,67-69]。2018年,Yang等[70]優(yōu)化了超快親和提取技術(shù),分別采用單柱和雙柱系統(tǒng)測定了幾種磺酰脲類藥物與正常及糖化HSA的整體親和常數(shù)和解離速率常數(shù),并對兩種系統(tǒng)的優(yōu)勢和局限性進(jìn)行了比較;結(jié)果表明雙柱系統(tǒng)可以使用更小的游離藥物組分和臨床相關(guān)藥物/蛋白濃度,但單柱系統(tǒng)操作更簡單,需要的蛋白質(zhì)量更少,精密度更高,且可用于估計(jì)藥物-蛋白相互作用的解離速率常數(shù)。

1.2.4峰值分析法

峰值分析法通常是以單流速或多流速注入藥物,在線性洗脫條件下,測定對照柱和親和柱上藥物的保留時(shí)間和峰值方差(即譜帶展寬),以此計(jì)算藥物和固載蛋白的解離速率常數(shù)[60,65,71,72]。該方法已被用于確定HSA與L-色氨酸、卡馬西平、丙咪嗪等配體的解離速率常數(shù)[73,74];也被用于同時(shí)測定苯妥因的兩種手性代謝物與HSA的解離情況[71]。2018年,Liang等[75]通過峰值分析法測定了5種藥物沙丁胺醇、特布他林、甲氧苯胺、鹽酸異丙腎上腺素和鹽酸麻黃堿與β2-AR的解離速率常數(shù)。2020年,該方法被用于測定阿齊沙坦、坎地沙坦、纈沙坦和奧美沙坦與血管緊張素II型受體的解離速率常數(shù)[40]。

1.2.5峰衰減分析法

峰衰減分析法首先采用含有藥物的樣品溶液使固載目標(biāo)蛋白的親和色譜柱達(dá)到飽和吸附,隨后采用空白流動相進(jìn)行洗脫,隨時(shí)間推移檢測藥物的釋放情況,產(chǎn)生一階衰減曲線,可根據(jù)斜率測得藥物的解離速率常數(shù)[47,60,76]。為了防止藥物釋放后與親和固定相重新結(jié)合,峰衰減分析法通常使用短微柱、高流速[77,78]。與其他測量解離速率常數(shù)的親和色譜方法相比,非競爭性的峰衰減分析法不需要測定塔板高度[79],是高通量分析藥物-蛋白解離的有效工具[17]。2018年,Anguizola等[80]通過峰衰減分析法研究了流速和洗脫pH值對幾種免疫球蛋白G從親和微柱中解離的影響。

2 毛細(xì)管電泳

CE作為一種高效、高靈敏的分離檢測技術(shù),可以在接近生理的條件下進(jìn)行,不需要高度純化的樣品,不需要固載和標(biāo)記相互作用的組分,在藥物-蛋白相互作用研究中極具吸引力[81-84]。CE的缺點(diǎn)是樣品中的蛋白容易吸附于毛細(xì)管壁上,穩(wěn)定性較低,在分析之前需要采用NaOH、HCl或十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液清洗內(nèi)壁[85,86]。

用于藥物-蛋白相互作用研究的CE方法主要包括親和毛細(xì)管電泳(ACE)[87]和毛細(xì)管電泳-前沿分析(CE-FA)[88],其他方法還包括Hummel Dreyer法(HD)[89]、空位峰法(VP)[90]和空位親和毛細(xì)管電泳法(VACE)[91]等。在這些方法中,CE-FA、HD、VP等方法需要采用外標(biāo)或內(nèi)標(biāo)進(jìn)行校準(zhǔn),而ACE和VACE法中結(jié)合參數(shù)根據(jù)藥物的有效遷移率進(jìn)行測定[92]。Michalcová等[85]采用ACE、CE-FA、HD法對BSA和水楊酸的相互作用進(jìn)行了研究,結(jié)果表明最佳的電泳分析方法為CE-FA,它具有通量高、自動化程度高、消耗樣品量少、分析時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。

2.1 親和毛細(xì)管電泳法

在ACE法中,采用含有不同濃度蛋白的緩沖液作為背景電解質(zhì)(BGE)充滿毛細(xì)管柱,再將藥物進(jìn)樣到毛細(xì)管內(nèi),在管內(nèi)建立藥物-蛋白結(jié)合動態(tài)平衡,藥物的電泳遷移率在與蛋白結(jié)合后發(fā)生改變[93,94]。實(shí)驗(yàn)中常加入電滲流(EOF)標(biāo)記物對藥物的遷移率進(jìn)行校準(zhǔn),抵消不同蛋白濃度下BGE黏度改變所產(chǎn)生的影響[95]。藥物的有效遷移率取決于BGE中的蛋白濃度。ACE在藥物-蛋白相互作用研究方面應(yīng)用廣泛,已被用于表征4種兒茶素與HSA和BSA的結(jié)合[96],評估HSA的翻譯后修飾(N-和S-同型半胱氨酸化)對HSA與兒茶素相互作用的影響并測定結(jié)合常數(shù)等[97]。此外,ACE也被用于手性藥物與蛋白的結(jié)合研究,通常以HSA、AGP等作為固載蛋白,在實(shí)現(xiàn)藥物對映體基線分離的同時(shí),測定對映體與蛋白的結(jié)合常數(shù)[1,98]。

Li等[99]通過ACE法測定了10種酚類化合物與凝血酶的結(jié)合常數(shù),進(jìn)一步利用分子對接模擬確定結(jié)合位點(diǎn),解析了化合物與酶活性中心的相互作用機(jī)制。olínová等[100]發(fā)展了部分填充親和毛細(xì)管電泳法(PF-ACE),測定了人胰島素六聚體與血清素、多巴胺、精氨酸和苯酚的結(jié)合常數(shù)。PF-ACE的優(yōu)點(diǎn)是避免蛋白溶液隨藥物進(jìn)入檢測器,克服蛋白溶液產(chǎn)生的高背景信號干擾[101]。CE過程中蛋白結(jié)構(gòu)和活性的穩(wěn)定性一直是一個(gè)挑戰(zhàn)。近年來,離子液體雙水相體系(ILATPS)結(jié)合了雙水相體系(ATPSs)和短鏈親水性離子液體(ILs)的優(yōu)點(diǎn),可以增強(qiáng)ACE中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,從而提高ACE方法的測量精度[102-104]。2018年,El-Hady等[95]采用親水咪唑ILATPS作為運(yùn)行緩沖液,提高了ACE分析過程中AGP蛋白的穩(wěn)定性,精確測定了AGP與普萘洛爾、甲氨蝶呤、和長春堿的結(jié)合常數(shù)。

2.2 毛細(xì)管電泳前沿分析法

CE-FA具有操作簡便、分析時(shí)間短,能夠分析高親和體系和多重平衡等優(yōu)點(diǎn)[83,105]。CE-FA用于研究藥物-蛋白相互作用時(shí),需要游離藥物和藥物-蛋白復(fù)合物具有不同的電泳遷移率,且游離蛋白和藥物-蛋白復(fù)合物的遷移率相近[106]。在CE-FA分析中,將已知濃度的藥物和目標(biāo)蛋白預(yù)先混合,隨后進(jìn)樣到充滿緩沖溶液的毛細(xì)管柱中,在電泳過程中將產(chǎn)生一個(gè)方形峰,根據(jù)峰高可獲得游離藥物濃度(需繪制無蛋白時(shí)的藥物濃度與峰高的校準(zhǔn)曲線)[107,108]。由于平臺峰的高度很少受到藥物遷移時(shí)間、電滲流(EOF)、毛細(xì)管長度和施加電壓的影響,CE-FA方法的穩(wěn)定性較好[108]。藥物在目標(biāo)蛋白上的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)和結(jié)合常數(shù)(Kb)計(jì)算公式[109,110]為:

(4)

其中r為結(jié)合藥物濃度和總蛋白濃度之比,[Dbound]和[Dfree]分別代表結(jié)合藥物濃度和游離藥物濃度,[Ptotal]為總蛋白濃度,m為蛋白上各種類型藥物結(jié)合位點(diǎn)的總數(shù),ni為蛋白質(zhì)上等效結(jié)合位點(diǎn)的最大數(shù)目,Kbi為相關(guān)結(jié)合常數(shù)。

CE-FA法已被用于評估正常HSA和糖化HSA與第一代磺酰脲類降糖藥之間的親和力[83],以及檢測常用抗凝劑華法林與HSA和BSA的高階相互作用等研究中[111]。為了減少蛋白在毛細(xì)管內(nèi)壁的吸附,Du等[112]將星形共聚物聚乙烯亞胺-接枝-聚(2-甲基-2-惡唑啉)(PEI-g-PMOXA)與聚多巴胺(PDA)共沉積于熔融石英毛細(xì)管內(nèi)壁,制備了一種PEI-g-PMOXA/PDA包覆的抗蛋白吸附毛細(xì)管,通過CE-FA研究了對乙酰氨基酚與BSA的相互作用,比常規(guī)毛細(xì)管具有更好的分析準(zhǔn)確度,與熒光光譜法結(jié)果相當(dāng)。Nevídalová等[113]利用CE-FA法研究了雙氯芬酸、布洛芬、氯丙胺和托爾布他米對HSA與L-色氨酸和利多卡因結(jié)合的影響,并測定了這些藥物與HSA的結(jié)合常數(shù)。Michalcová等[114]基于層流廓線的橫向擴(kuò)散(TDLFP)和電泳介導(dǎo)微分析(EMMA)的原理發(fā)展了藥物和蛋白混合樣品在線CE-FA法,樣品混合、孵化、分離的過程全部實(shí)現(xiàn)自動化,測定了BSA與普萘諾爾、利多卡因和酸性藥物苯丁他松的結(jié)合參數(shù),顯著增加了分析通量,減少了試劑的消耗及人工操作引起的實(shí)驗(yàn)誤差。

3 小結(jié)

本文所述的各種色譜方法與技術(shù)不僅可以用于藥物-血漿蛋白相互作用研究,對于蛋白-蛋白、蛋白-核酸、蛋白-多糖等生物分子相互作用也具有普適性。而色譜技術(shù)在藥物-血漿蛋白相互作用研究中的局限性主要包括:HPAC法需要將目標(biāo)蛋白固載于色譜固定相,可能改變蛋白的構(gòu)象及其藥物結(jié)合性質(zhì)[115];在CE過程中存在蛋白在毛細(xì)管壁上的非特異性吸附、蛋白穩(wěn)定性下降等情況。針對這些問題,發(fā)展更簡單、高效的色譜分析方法,進(jìn)一步提高藥物-蛋白相互作用分析的靈敏度、準(zhǔn)確度和通量仍然是未來研究的重點(diǎn)。近年來,隨著各種色譜分析方法與技術(shù)的推陳出新和不斷完善,以及高性能色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等分析儀器的進(jìn)步,為藥物-血漿蛋白相互作用研究提供了更多的選擇和多種技術(shù)組合,有望進(jìn)一步提高分析的準(zhǔn)確性并提供更多維度的藥物-蛋白相互作用信息。