微流控磁載酶級(jí)聯(lián)傳感器檢測(cè)唾液中葡萄糖的研究

夏 凌， 張麗松， 楊佳妮， 肖小華， 李攻科

(中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣東廣州 510275)

糖尿病是以高血糖為特征的全球性的公共健康問(wèn)題，目前并無(wú)有效治療方法，主要通過(guò)對(duì)患者血糖水平進(jìn)行持續(xù)、準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)而加以控制[1]。常規(guī)的血糖監(jiān)測(cè)方法依賴于血液的侵入性提取，如靜脈穿刺、手指穿刺等[2]。然而，采血過(guò)程是創(chuàng)傷性的，采集時(shí)會(huì)給患者帶來(lái)疼痛與不適，此外也存在潛在的交叉感染風(fēng)險(xiǎn)[3]。近年來(lái)，對(duì)尿液、汗液、唾液、淚液等體液中葡萄糖的非侵入性檢測(cè)的研究逐漸興起。唾液是由唾液腺分泌的生物液體，由多種物質(zhì)跨細(xì)胞或亞細(xì)胞途徑從血液中滲透而成。相比于其他體液，唾液樣本易采集，組成相對(duì)簡(jiǎn)單，干擾分析相對(duì)較小[4]，為監(jiān)測(cè)人體激素、營(yíng)養(yǎng)和代謝狀態(tài)提供了一種非侵入性血液分析途徑。已有研究表明，在健康受試者中，血糖含量和唾液葡萄糖含量間相關(guān)性較小，因?yàn)楫?dāng)血糖含量超過(guò)一定限度時(shí)，胰島β細(xì)胞將釋放胰島素進(jìn)入血液，使血糖水平正?；痆5]；而糖尿病患者唾液中葡萄糖含量明顯高于正常人，且與血糖含量成正相關(guān)關(guān)系。因此，檢測(cè)唾液中葡萄糖含量可作為有效的糖尿病篩查方法，也可作為糖尿病患者監(jiān)測(cè)血糖含量變化的分析手段[6]。

人體唾液中葡萄糖含量極低，僅為血糖的1/100～1/50(3.6～36 mg/L)[7]，干擾組分也較血液更多，對(duì)分析方法的選擇性、靈敏度、樣品用量、響應(yīng)時(shí)間等都提出更嚴(yán)苛的要求。基于酶催化反應(yīng)的葡萄糖生物傳感器具有簡(jiǎn)便、快速、選擇性好的特點(diǎn)，是檢測(cè)葡萄糖的常用方法。盡管酶的活性會(huì)受到反應(yīng)條件的諸多限制，但因酶催化的高度選擇性和專(zhuān)一性，酶仍是最適當(dāng)?shù)钠咸烟莻鞲衅魃镒R(shí)別元件[8]。而多酶參與的級(jí)聯(lián)催化，能將前一種酶催化形成的產(chǎn)物作為后續(xù)酶反應(yīng)的底物，不僅減少中間產(chǎn)物的積累，還能利用多酶的協(xié)同作用提升整體酶反應(yīng)的效率[9,10]。微型化、集成化、智能化是生物傳感器的發(fā)展的重要方向，而微流控芯片技術(shù)的引入正迎合了這種需求[11]。我們團(tuán)隊(duì)已發(fā)展了一種集分離富集檢測(cè)于一體的微流控磁載免疫分析技術(shù)[12]，該技術(shù)能有效提高基于酶反應(yīng)的免疫檢測(cè)靈敏度，有望應(yīng)用于復(fù)雜樣品中痕量葡萄糖糖的酶催化傳感識(shí)別。

本文通過(guò)戊二醛交聯(lián)法在氨基化磁性微球上固定葡萄糖氧化酶(GOx)和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，利用微流控磁載技術(shù)將磁性微球富集在微通道中，為GOx/HRP酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)提供限域環(huán)境，基于此構(gòu)建了高靈敏熒光增強(qiáng)的葡萄糖傳感器，實(shí)現(xiàn)了唾液樣品中葡萄糖含量的測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器及試劑

倒置熒光顯微鏡(Axio Observer Z1，卡爾·蔡司股份公司)；注射泵(LSP10-1B，保定蘭格恒流泵有限公司)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(TGL-20M，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；電動(dòng)攪拌器(D2004W，上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司)。

Affimag PSC磁性微球(天津市倍思樂(lè)色譜技術(shù)開(kāi)發(fā)中心)；戊二醛(50%，生工生物工程股份有限公司)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，Sigma-Aldrich)；牛血清白蛋白(BSA，≥98.0%，廣州賽國(guó)生物科技有限公司)；辣根過(guò)氧化物酶(HRP，酶活：>300 U/mg，上海阿拉丁生化科技有限公司)；葡萄糖氧化酶(GOx，酶活：244 U/mg，北京索萊寶科技有限公司)；熒光探針Ampliflu Red(AR，≥98.0%，Sigma-Aldrich)；聚二甲基硅氧烷(PDMS，Midland-Michigan)；麥芽糖(生化試劑BR，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；葡萄糖、蔗糖(分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠)；NaOH、KCl(分析純，廣州化學(xué)試劑廠)；果糖、抗壞血酸(99%，上海阿拉丁生化科技有限公司)；檸檬酸鈉(99.0%，天津市福晨化學(xué)試劑廠)。水為超純水。

1.2 GOx/HRP雙酶磁珠的制備

通過(guò)戊二醛交聯(lián)法在氨基化磁珠表面固定GOx和HRP，如圖1(A)所示。于1支10 mL離心管中，加入0.25 mL 5 mg/mL核殼型磁性微球懸浮液和3.5 mL 2.5%戊二醛溶液，混合均勻，封口，室溫?fù)u晃3 h 后在磁鐵作用下進(jìn)行磁性分離，移去上清液；用超純水洗滌三次，加入0.6 mL 5 mg/mL的GOx以及0.3 mL 10 mg/mL的HRP，混合均勻，封口，室溫?fù)u晃12 h，使磁珠充分懸浮，保證酶均勻固定上去；磁性分離，移去上清液，用PBS充分洗滌除去未固定上的HRP和GOx后，加入1 mL 10 mg/mL BSA封閉表面可能未反應(yīng)的醛基結(jié)合位點(diǎn)，混合均勻，封口，室溫?fù)u晃3 h后磁性分離，移去上清液，加入1 mL PBS緩沖溶液，將反應(yīng)得到的GOx/HRP雙酶磁珠(濃度為1.25 mg/mL)在4 ℃保存待用。

圖1 微流控磁載酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)葡萄糖檢測(cè)示意圖。(A)戊二醛交聯(lián)法制備GOx/HRP雙酶磁珠；(B)微流控磁載檢測(cè)步驟示意圖；(C)GOx/HRP酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)。Fig.1 Schematic of microfluidic magnetic enzyme cascade sensor delivery technique for glucose detection.(A) GOx-HRP bienzyme magnetic beads preparation via glutaraldehyde cross-linking method;(B) Operation of microfluidic magnetic enzyme cascade sensor delivery technique;(C) GOx/HRP enzyme cascade reaction.

1.3 微流控檢測(cè)芯片加工

用于葡萄糖檢測(cè)的微流控芯片是由PDMS通過(guò)軟光刻技術(shù)制作[13]。使用定制掩模版，在硅片上利用光刻膠構(gòu)建微通道模板。采用最簡(jiǎn)單的通道設(shè)計(jì)，通道尺寸為2 cm長(zhǎng)、200 μm寬、40 μm深。通過(guò)PDMS澆注固化、脫模、打孔、等離子鍵合等步驟，構(gòu)建PDMS-玻璃檢測(cè)芯片。

1.4 葡萄糖檢測(cè)步驟

檢測(cè)前，先在PDMS微通道上放置尺寸為30 mm×9.1 mm×2.7 mm的釹鐵硼磁鐵，如圖1(B)所示。再將GOx/HRP雙酶磁珠加入葡萄糖與酶底物AR的預(yù)混溶液，并置于進(jìn)樣孔中。在注射泵抽取模式下，以16 μL/min的流速?gòu)倪M(jìn)樣孔連續(xù)抽取10 μL樣品溶液灌注進(jìn)微通道。當(dāng)樣品溶液流經(jīng)微通道時(shí)，磁珠被捕獲而富集在磁鐵下方。一旦進(jìn)樣孔中所有樣品溶液都進(jìn)入微通道，移除芯片和注射泵之間的連接管，并用膠帶密封住進(jìn)樣孔和出樣孔。

完成進(jìn)樣后，在室溫下進(jìn)行雙酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如圖1(C)所示。通過(guò)倒置熒光顯微鏡監(jiān)控芯片檢測(cè)區(qū)的熒光變化。通過(guò)CCD相機(jī)獲得熒光圖像，每2 min拍攝一次，并用ImageJ軟件對(duì)圖像灰度值進(jìn)行分析。

1.5 唾液樣品制備

3名受試者用清水漱口3次，取其在空腹、無(wú)刺激狀態(tài)下自然分泌的唾液3～4 mL。采集的唾液經(jīng)離心機(jī)在5 000 r/min下離心20 min，取上清液，于-20 ℃保存待用。

2 結(jié)果與討論

2.1 傳感機(jī)理與可行性分析

該微流控磁載酶級(jí)聯(lián)傳感器的傳感機(jī)理是在葡萄糖存在下通過(guò)兩步酶催化反應(yīng)，氧化酶底物AR，生成強(qiáng)熒光發(fā)射的試鹵靈。為驗(yàn)證GOx/HRP酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)在葡萄糖檢測(cè)中的可行性，雙酶磁珠和單酶磁珠混合物中，分別加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預(yù)混溶液，灌注進(jìn)檢測(cè)芯片，并在外加磁場(chǎng)的作用下富集于在微流控通道的檢測(cè)區(qū)域，記錄微流控通道中不同酶反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。經(jīng)過(guò)4、6、8、10、12和14 min的酶反應(yīng)，GOx/HRP雙酶磁珠參與組具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)，如圖2(A)所示；而HRP磁珠和GOx磁珠混合物參與組的熒光信號(hào)較弱，如圖2(B)所示。圖2(A)和2(B)磁鐵中心位置(dm=)的熒光信號(hào)強(qiáng)度與反應(yīng)時(shí)間呈良好的線性關(guān)系，如圖2(C)所示。線性擬合方程的斜率可用于表征熒光信號(hào)產(chǎn)生的速率，即酶反應(yīng)速率。由于GOx/HRP雙酶磁珠參與組、HRP磁珠和GOx磁珠混合物參與組的線性擬合方程的斜率分別為6.20和0.480，雙酶磁珠的酶反應(yīng)速率為單酶磁珠混合物的12.92倍。磁珠上同時(shí)固定GOx和HRP時(shí)可促發(fā)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)，在GOx催化葡萄糖生成葡萄糖酸和H2O2的同時(shí)，HRP消耗H2O2并催化氧化酶底物AR生成熒光信號(hào)分子。酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)增大了酶的催化性能，使催化效率得到提高，縮短反應(yīng)時(shí)間。

圖2 GOx/HRP雙酶磁珠參與組(A)與HRP磁珠和GOx磁珠混合物參與組(B)的不同酶反應(yīng)時(shí)間的熒光照片，dm為微通道長(zhǎng)度方向上距離磁鐵中心位置的距離，雙酶磁珠濃度為19.53 μg/mL，HRP磁珠和GOx磁珠濃度均為9.77 μg/mL。(C)磁鐵中心位置(dm=0)熒光強(qiáng)度與酶反應(yīng)時(shí)間的定量關(guān)系。其中，曲線a為GOx/HRP雙酶磁珠參與組，線性擬合方程為y=6.20x-18.998(R2=0.9906)；曲線b為HRP磁珠和GOx磁珠混合物參與組，線性擬合方程為y=0.480x+4.737(R2=0.9545)。Fig.2 Fluorescence images of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads involved assays(A) and mixture of HRP labeled magnetic beads and GOx labeled magnetic beads involved assays(B) after different enzyme reaction periods.The dm refers to the distance measured from the middle of the magnet at length direction of microchannel.The concentration of bienzyme labeled magnetic beads,HRP labeled magnetic beads and HRP labeled magnetic beads were 19.53 μg/mL,9.77 μg/mL and 9.77 μg/mL,respectively.(C)The calibration curve describing the relationship between the fluorescence intensity at dm=0 and the reaction time.Line a represents the equations of linearity of y=6.20x-18.998(R2=0.9906) for GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads involved assays,while line b represents the equations of linearity of y=0.480x+4.737(R2=0.9545) for mixture of HRP labeled magnetic beads and GOx labeled magnetic beads involved assays.

在葡萄糖檢測(cè)過(guò)程中，微流控磁載技術(shù)不僅能將GOx/HRP雙酶磁珠輸送到微通道的檢測(cè)區(qū)域，還能通過(guò)外加磁場(chǎng)富集磁珠以增大酶在檢測(cè)區(qū)域的濃度。為評(píng)估磁富集對(duì)葡萄糖檢測(cè)性能的貢獻(xiàn)，不同濃度的GOx/HRP雙酶磁珠加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預(yù)混溶液，灌注進(jìn)檢測(cè)芯片，在外加磁場(chǎng)和無(wú)磁場(chǎng)兩種情況下進(jìn)行檢測(cè)，記錄微流控通道中不同酶反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度。微流控磁載GOx/HRP酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)結(jié)果如圖3(A)所示，無(wú)外加磁場(chǎng)的結(jié)果如圖3(B)所示。熒光信號(hào)產(chǎn)生的速率(SI)與GOx/HRP雙酶磁珠濃度(cMBs)的關(guān)系如圖3(C)所示。與無(wú)磁場(chǎng)檢測(cè)相比，微流控磁載技術(shù)的磁富集可實(shí)現(xiàn)40倍的熒光信號(hào)放大。

圖3 (A)微流控磁載酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)不同時(shí)間檢測(cè)區(qū)的熒光信號(hào)，GOx/HRP雙酶磁珠濃度為0.49、0.98、1.95、3.91、7.81和15.6 μg/mL；(B)無(wú)磁場(chǎng)酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)不同時(shí)間檢測(cè)區(qū)的熒光信號(hào)，GOx/HRP雙酶磁珠濃度為15.6、31.3、62.5、125和250 μg/mL；(C)有磁場(chǎng)和無(wú)磁場(chǎng)環(huán)境下熒光信號(hào)產(chǎn)生的速率(SI)與GOx/HRP雙酶磁珠濃度(cMBs)的定量關(guān)系，誤差棒為3次平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。其中，曲線a為磁富集組，線性擬合方程為SI=0.6242cMBs-0.0423(R2=0.9978)；曲線b為無(wú)磁場(chǎng)環(huán)境組，線性擬合方程為SI=0.0156cMBs-0.2515(R2=0.9960)。Fig.3 (A) Temporal variation in the measured fluorescence at the detection point for the microfluidic magnetic enzyme cascade reaction with samples containing different concentrations of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads:0.49,0.98,1.95,3.91,7.81 and 15.6 μg/mL;(B) Temporal variation in the measured fluorescence at the detection point for enzyme cascade reaction without magnetic field with samples containing different concentrations of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads:15.6,31.3,62.5,125 and 250 μg/mL;(C) The calibration curves describing the relationship between the fluorescence signal generation rate(SI) and the concentrations of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads(cMBs).The error bars represent the standard deviation of three measurements.Line a represents the equations of linearity of SI=0.6242cMBs-0.0423(R2=0.9978) for assays with magnetic preconcentration,while line b represents the equations of linearity of SI=0.0156cMBs-0.2515(R2=0.9960) for assays with magnetic field.

2.2 檢測(cè)靈敏度優(yōu)化

在使用該微流控磁載酶級(jí)聯(lián)傳感器對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量分析前，先對(duì)各檢測(cè)靈敏度影響因素進(jìn)行優(yōu)化，包括磁珠粒徑、磁珠濃度和進(jìn)樣流速。

2.2.1 磁珠粒徑為了考察磁珠粒徑對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，通過(guò)戊二醛交聯(lián)法分別在粒徑為0.5、4.5、6.5 μm的氨基化磁珠表面固定GOx和HRP，將GOx/HRP雙酶磁珠稀釋至12.5 μg/mL，然后加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預(yù)混溶液，灌注進(jìn)檢測(cè)芯片，記錄微流控通道檢測(cè)區(qū)中熒光信號(hào)的產(chǎn)生速率。如圖4(A)所示，不同粒徑的GOx/HRP雙酶磁珠都能催化氧化酶底物AR生成熒光分子；而磁珠粒徑越小，熒光分子試鹵靈的生成速率越大。在交聯(lián)反應(yīng)中磁珠用量相同時(shí)，磁珠粒徑越小，則比表面積越大，因此GOx和HRP在0.5 μm磁珠表面固定得多且充分。此外，磁珠粒徑越小，越易被磁富集于檢測(cè)區(qū)并參與酶催化反應(yīng)。故，在所考察的3種粒徑磁珠中，0.5 μm的性能最優(yōu)，后續(xù)實(shí)驗(yàn)均使用粒徑為0.5 μm的GOx/HRP雙酶磁珠。

2.2.2 GOx/HRP雙酶磁珠濃度為了考察磁珠濃度對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響，將濃度為0.61、1.22、2.44、4.88、9.77、19.53、39.06 μg/mL的GOx/HRP雙酶磁珠分別加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預(yù)混溶液，灌注進(jìn)檢測(cè)芯片，記錄微流控通道檢測(cè)區(qū)中熒光信號(hào)的產(chǎn)生速率。如圖4(B)所示，當(dāng)GOx/HRP雙酶磁珠濃度(cMBs)低于19.53 μg/mL時(shí)，熒光信號(hào)產(chǎn)生速率(SI)與cMBs成正比；當(dāng)cMBs繼續(xù)增大時(shí)，SI無(wú)明顯增加。另一方面，高濃度磁珠灌注芯片容易引起微通道的堵塞，故選用19.53 μg/mL為最優(yōu)磁珠濃度。

2.2.3 進(jìn)樣流速進(jìn)樣時(shí)，樣品溶液的流速會(huì)影響磁場(chǎng)捕獲磁珠的效果，所以考察了進(jìn)樣流速對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響。將19.53 μg/mL GOx/HRP雙酶磁珠加入100 μmol/L葡萄糖與50 μmol/L酶底物AR的預(yù)混溶液，灌注進(jìn)檢測(cè)芯片，并通過(guò)注射泵控制進(jìn)樣速度為8、12、16、32、64、128、256 μL/min，完成進(jìn)樣后記錄微流控通道檢測(cè)區(qū)中熒光信號(hào)的產(chǎn)生速率。如圖4(C)所示，當(dāng)進(jìn)樣流速(Qinj)小于16 μL/min時(shí)SI變化不明顯；當(dāng)Qinj大于16 μL/min時(shí)SI逐漸減小。所以后續(xù)實(shí)驗(yàn)均選用16 μL/min為最優(yōu)進(jìn)樣流速。

圖4 檢測(cè)靈敏度優(yōu)化。(A)磁珠粒徑；(B)GOx/HRP雙酶磁珠濃度；(C)進(jìn)樣流速。誤差棒為3次平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Fig.4 Detection sensitivity optimization.(A) diameter of magnetic beads,dMBs;(B) concentration of GOx/HRP bienzyme labeled magnetic beads,cMBs;(C) sample injection flow rate,Qinj.The error bars represent the standard deviation of three measurements.

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，將GOx/HRP雙酶磁珠加入不同濃度葡萄糖與酶底物AR的預(yù)混溶液，分別灌注進(jìn)檢測(cè)芯片，記錄微流控通道中不同酶反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)果如圖5(A)所示。各種葡萄糖濃度下，熒光信號(hào)強(qiáng)度都與反應(yīng)時(shí)間呈良好的線性關(guān)系。圖5(B)中熒光信號(hào)產(chǎn)生的速率(SI)隨著葡萄糖濃度的增大而增加，在0.01～100 μmol/L范圍呈良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：SI=0.0992cglucose+0.384，R2為0.9977，檢出限(S/N=3)為3.2 nmol/L。與文獻(xiàn)報(bào)道的其他方法[13 - 17]相比，微流控磁載酶級(jí)聯(lián)傳感方法樣品用量少、響應(yīng)時(shí)間短、靈敏度高、線性響應(yīng)范圍寬。

圖5 (A)微流控磁載酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)不同時(shí)間檢測(cè)區(qū)的熒光信號(hào)，葡萄糖濃度為0、0.01、0.1、1.0、10、25、50和100 μmol/L；(B)熒光信號(hào)產(chǎn)生的速率(SI)與葡萄糖濃度(cglucose)的校正曲線。誤差棒為3次平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Fig.5 (A) Temporal variation in the measured fluorescence at the detection point for the microfluidic magnetic enzyme cascade reaction with samples containing different concentrations of glucose:0,0.01,0.1,1.0,10,25,50 and 100 μmol/L;(B) The calibration curves describing the relationship between the fluorescence signal generation rate(SI) and the concentrations of glucose(cglucose).The error bars represent the standard deviation of three measurements.

2.4 特異性和重現(xiàn)性

實(shí)驗(yàn)采用乳糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、KCl、NaCl、抗壞血酸、檸檬酸鈉作為干擾物質(zhì)，評(píng)價(jià)微流控磁載酶級(jí)聯(lián)傳感方法的特異性。結(jié)果如圖6(A)所示，上述干擾物質(zhì)濃度為10倍葡萄糖濃度時(shí)，所產(chǎn)生的響應(yīng)信號(hào)很小，且在血液、唾液等實(shí)際樣品中，上述干擾物質(zhì)的濃度要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于測(cè)試濃度10 mmol/L。因此在檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí)，可忽略上述物質(zhì)產(chǎn)生的干擾，即該傳感器對(duì)葡萄糖的檢測(cè)具有良好的特異性。另一方面，方法的重現(xiàn)性考察結(jié)果如圖6(B)所示。當(dāng)葡萄糖濃度為10 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L時(shí)，檢測(cè)所得SI平均值分別為0.191、0.700、1.333，計(jì)算得相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為3.4%、3.1%、3.7%，表明該傳感器對(duì)葡萄糖檢測(cè)的重現(xiàn)性較好。

圖6 微流控磁載酶級(jí)聯(lián)傳感器的特異性(A)和重現(xiàn)性(B)。誤差棒為3次平行實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。Fig.6 Selectivity(A) and reproducibility(B) of the proposed microfluidic magnetic enzyme cascade sensor.The error bars represent the standard deviation of three measurements.

2.5 唾液中葡萄糖濃度測(cè)定

利用所構(gòu)建的微流控磁載酶級(jí)聯(lián)傳感器對(duì)唾液中葡萄糖濃度進(jìn)行測(cè)定。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，將制備好的唾液樣品稀釋2倍后，與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和酶底物AR混合，加入GOx/HRP雙酶磁珠，灌注進(jìn)檢測(cè)芯片，測(cè)定熒光信號(hào)產(chǎn)生的速率SI，計(jì)算得到人體唾液樣品中的葡萄糖濃度，如表1所示。測(cè)得3個(gè)唾液樣品中葡萄糖濃度為56.1、55.5和27.5 μmol/L，加標(biāo)回收率為95.3%～103.1%，RSD小于4.5%，表明所構(gòu)建的微流控磁載酶級(jí)聯(lián)傳感器對(duì)葡萄糖檢測(cè)的可靠性較高。

表1 人體唾液中葡萄糖濃度檢測(cè)結(jié)果Table 1 Determination results of glucose in human saliva

3 結(jié)論

本文通過(guò)戊二醛交聯(lián)法在氨基化磁性微球上固定了GOx和HRP用于酶級(jí)聯(lián)催化反應(yīng)。所制備的GOx/HRP雙酶磁珠通過(guò)催化氧化葡萄糖產(chǎn)生檢測(cè)信號(hào)，該檢測(cè)信號(hào)可通過(guò)微流控磁載技術(shù)進(jìn)一步放大。所構(gòu)建的高靈敏熒光增強(qiáng)的葡萄糖傳感器樣品用量少、響應(yīng)時(shí)間短、檢出限低、線性范圍寬、特異性高、重現(xiàn)性好，適用于人體唾液中葡萄糖含量的快速測(cè)定。