DNA胞嘧啶的甲基化與去甲基化進(jìn)展

宋星睿， 凌曉婷， 趙楚斌， 賴瑋毅， 汪海林

(1.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京 100085；2.國(guó)科大杭州高等研究院，浙江杭州 310024)

1 DNA甲基化

表觀遺傳修飾，主要是指研究非DNA序列變化的其他途徑與機(jī)理所引起的可遺傳性的基因表達(dá)改變[1,2]。DNA甲基化是一類較為重要的表觀遺傳修飾，除此外還有組蛋白修飾以及多種小RNA等其他方式[3 - 5]。DNA甲基化一般是由DNA序列中的胞嘧啶、腺嘌呤的C或N上的H被CH3所替代，而形成甲基化修飾[3 - 5]，如5-甲基胞嘧啶(5-Methylcytosine,5mC)、N6-甲基腺嘌呤(N6-Methyladenine,6mA)、N4-甲基胞嘧啶(N4-Methylcytosine,4mC)。5mC是哺乳動(dòng)物基因組DNA中含量最高的甲基化修飾，占總胞嘧啶的3%～5%[6]。DNA 5mC修飾主要發(fā)生在DNA序列上胞嘧啶接著鳥嘌呤出現(xiàn)的位點(diǎn)，稱為CpG位點(diǎn)(CpG sites)。哺乳動(dòng)物DNA C5-胞嘧啶甲基化轉(zhuǎn)移酶有3種：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。在胚胎發(fā)育過程中，DNMT3a和DNMT3b將兩條鏈均不含5mC的DNA甲基化，從頭建立DNA的甲基化，被稱為從頭甲基化酶(denovoMethyltransferase)；而DNMT1則傾向于甲基化雙鏈DNA中半甲基化CpG位點(diǎn)，這一甲基化過程發(fā)生在DNA半保留復(fù)制中，將新鏈甲基化，維持了該DNA原本的甲基化狀態(tài)，因此DNMT1被稱為維持甲基化轉(zhuǎn)移酶(Maintenance Methyltransferase)。此外，在嚙齒動(dòng)物中還存在一種從頭甲基化酶DNMT3c，在精子生成過程介導(dǎo)雄性生殖細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的啟動(dòng)子甲基化[7]。

組織內(nèi)DNA甲基化的分布與豐度，可用于某些疾病的診斷與治療，目前DNA甲基化分析已開始應(yīng)用于臨床診斷。例如，進(jìn)食障礙(Eating Disorders，ED)與內(nèi)穩(wěn)態(tài)通路DNA異常甲基化有密切的聯(lián)系，預(yù)期DNA甲基化的分析和表征有助于發(fā)展更有效的ED的治療方法[8]。在癌癥的診斷上，DNA甲基化也可作為腫瘤診斷及預(yù)后康復(fù)的標(biāo)記物[9]。緊密連接蛋白1(Tight junction protein 1，ZO -1)甲基化檢測(cè)試劑盒可以用于急性白血病的診斷[10]；此外，DNA結(jié)合因子抑制劑4(Inhibitor of DNA binding 4，ID4)和ZO -1的異常甲基化可以作為淋巴瘤診斷的生物標(biāo)記物；尿液中谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶P1(Glutathione S-transferase P1，GSTP1)基因的甲基化產(chǎn)物可用于前列腺癌的診斷[11]等。

2 DNA 5-甲基胞嘧啶去甲基化

DNA去甲基化是將已甲基化堿基轉(zhuǎn)化為不含甲基化修飾堿基的過程，是DNA甲基化的逆過程[12,13]。DNA甲基化和去甲基化在生物體內(nèi)一般處于動(dòng)態(tài)平衡，共同調(diào)控著基因的時(shí)空表達(dá)[14]。目前的研究認(rèn)為，DNA 5mC去甲基化過程復(fù)雜度遠(yuǎn)大于DNA甲基化，大致可分為被動(dòng)去甲基化(Passive DNA demethylation)與主動(dòng)去甲基化(Active DNA demethylation)兩種途徑。被動(dòng)去甲基化主要發(fā)生在DNA復(fù)制過程，復(fù)制產(chǎn)生的新鏈均為非甲基化DNA，如新鏈沒有被維持甲基化轉(zhuǎn)移酶甲基化，則5mC被逐步稀釋，總體水平下降。DNA主動(dòng)去甲基化則是CH3在各種酶的作用下被移除，目前動(dòng)植物DNA主動(dòng)去甲基化已有一定研究，但有關(guān)機(jī)制仍需進(jìn)一步解釋。

植物體內(nèi)DNA去甲基化過程主要為主動(dòng)去甲基化，由ROS1/DME酶介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)(Base Excision Repair，BER)通路進(jìn)行[15,16]。ROS1突變體的形成可能會(huì)使RD29A基因啟動(dòng)子區(qū)域的基因DNA甲基化水平顯著升高，并最終導(dǎo)致表達(dá)沉默[17]。Gehring等[18]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)種子胚乳中DME突變體產(chǎn)生時(shí)，CG基因DNA甲基化水平同樣顯著升高，預(yù)示著DNE突變體具有與ROS1突變體一致的作用。

哺乳動(dòng)物5mC氧化去甲基化路徑的發(fā)現(xiàn)，對(duì)5mC去甲基化研究意義重大。2009年，Rao研究組發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物腦組織和胚胎干細(xì)胞中，DNA 5mC可通過TET1酶催化氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)[19]，Purkinje細(xì)胞DNA中5hmC占0.59%，顆粒細(xì)胞DNA中5hmC占0.23%等[20 - 22]。一般哺乳動(dòng)物5hmC含量可分為三類：神經(jīng)元組織和胚胎干細(xì)胞中的高表達(dá)(0.3%～0.7%)；腎臟、膀胱、心臟等的中度表達(dá)(0.15%～0.17%)；肝臟和內(nèi)分泌腺的低表達(dá)(0.03%～0.06%)。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，TET蛋白可進(jìn)一步將5hmC氧化為5甲?；奏?5-formylcytosine，5fC)、5-羧基胞嘧啶(5-carboxycytosine，5caC)兩種重要修飾。這兩種修飾可通過堿基修復(fù)機(jī)制除去，使5mC回復(fù)到無修飾胞嘧啶狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)5mC主動(dòng)去甲基化[19,22]。并且TET蛋白催化5mC至5hmC的轉(zhuǎn)化速率遠(yuǎn)快于5hmC至5fC和5fC至5caC的轉(zhuǎn)化速率[23]。

一些小分子物質(zhì)也可改變細(xì)胞內(nèi)5hmC、5fC和5caC水平，如維生素C可作為輔助因子與Tet酶的直接作用，顯著提高Tet蛋白介導(dǎo)的5mC氧化，經(jīng)維生素C處理的小鼠胚胎干細(xì)胞基因組5hmC水平可由0.1% 提高至0.3%，5fC水平由7.7×10-6提高至8.1×10-6，5caC水平則提高了20倍[24]。此外，環(huán)境污染物醌類化合物可增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)TET蛋白活性[25]；而典型環(huán)境內(nèi)分泌干擾物雙酚A、雙酚S均可調(diào)控TET基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，影響細(xì)胞內(nèi)5hmC水平[25]。

在堿基切除修復(fù)通路中，尿嘧啶DNA糖苷酶家族胸腺嘧啶糖苷酶(Thymine DNA Glycosylase,TDG)具有進(jìn)行G/T錯(cuò)配修復(fù)的能力，在堿基切除修復(fù)路徑，發(fā)現(xiàn)TDG具有新的功能，負(fù)責(zé)識(shí)別和切除5fC和5caC修飾。另外，TDG的特殊結(jié)構(gòu)位點(diǎn)使其在AID或載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽(APOBEC) 存在時(shí)通過脫氨反應(yīng)，在Gadd45a的協(xié)助下識(shí)別去除5fC等去甲基化中間產(chǎn)物，最終達(dá)到將5mC∶G修復(fù)成未經(jīng)修飾的C∶G的目的[26]。TDG調(diào)控的DNA去甲基化在胚胎發(fā)育過程中可能發(fā)揮了重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞與人類生殖細(xì)胞的甲基化水平都會(huì)經(jīng)歷高度甲基化-去甲基化-重新甲基化過程[27]。在對(duì)小鼠的TDG基因敲除實(shí)驗(yàn)中，缺失TDG的小鼠胚胎會(huì)在發(fā)育早期(約12a)即出現(xiàn)死亡，并且在死亡胚胎中觀察到了多種發(fā)育障礙[28]。胚胎發(fā)育階段，TDG保護(hù)與調(diào)控發(fā)育相關(guān)的基因啟動(dòng)子，使其不被甲基化而表達(dá)沉默，維持了胚胎細(xì)胞的正常發(fā)育[29]。

哺乳動(dòng)物中DNA去甲基化不僅可以影響胚胎發(fā)育、分化等發(fā)育過程，還會(huì)對(duì)生物體正常生理代謝活動(dòng)起到調(diào)控作用。例如，DNA去甲基化可能影響哺乳動(dòng)物脂肪沉積。Melzner等人[30]通過對(duì)前脂肪細(xì)胞分化時(shí)Leptin基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化程度進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了脂肪細(xì)胞進(jìn)行分化期間，該基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)也呈顯著下降狀態(tài)，即從前脂肪細(xì)胞向分化末期的成熟脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，Leptin基因啟動(dòng)子區(qū)從高度甲基化向高度去甲基化轉(zhuǎn)變。當(dāng)人工干預(yù)年輕細(xì)胞體基因組DNA去甲基化后，細(xì)胞體在連續(xù)傳代后更容易出現(xiàn)如DNA合成能力下降等衰老的特征，提示了DNA去甲基化對(duì)細(xì)胞衰老的影響[31]。后續(xù)相關(guān)研究表明，DNA去甲基化會(huì)引起人二倍體成纖維細(xì)胞端?？s短，從而加速人體細(xì)胞衰老[32]?？傮w而言，DNA去甲基化會(huì)對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞體生長(zhǎng)發(fā)育、分化、生命代謝活動(dòng)等多方面起到調(diào)控作用。

3 疾病中的甲基化與去甲基化

DNA胞嘧啶異常甲基化包括基因組整體低甲基化和基因特定區(qū)域高甲基化，在各種形式的癌癥中都很常見，與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，而DNA去甲基化異常也會(huì)對(duì)機(jī)體正常代謝產(chǎn)生不利影響[33]。因此，DNA甲基化去甲基化與疾病的關(guān)系、甲基化去甲基化作為疾病標(biāo)記物、干涉甲基化去甲基化過程治療疾病的研究受到廣泛關(guān)注。目前已有相關(guān)實(shí)驗(yàn)或流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)的與DNA甲基化與去甲基化異常有直接關(guān)聯(lián)的疾病有惡性腫瘤(癌癥)、阿爾茨海默氏病、心血管疾病(如冠心病等)、肺纖維病變和進(jìn)食障礙等。

3.1 基于DNA 5mC去甲基化中間產(chǎn)物的癌癥診斷

腫瘤發(fā)生過程中，一些關(guān)鍵基因的胞嘧啶甲基化狀態(tài)發(fā)生改變，因此機(jī)體DNA甲基化模式和水平變化的分析對(duì)腫瘤的早期診斷及預(yù)后評(píng)估是尤為重要的[34,35]。其中，DNA去甲基化的中間產(chǎn)物5hmC也與腫瘤細(xì)胞的發(fā)展密切相關(guān)。因此，5hmC水平的變化可以預(yù)示某些腫瘤的發(fā)生，并在臨床中作為可靠的腫瘤診斷標(biāo)記物[4]。例如，5hmC和5fC在肝癌組織中均顯著下降，5fC水平可區(qū)分肝癌的發(fā)展階段，肝癌基因組5hmC和5fC整體水平下降與肝癌患者預(yù)后不良有關(guān)；5hmC水平的降低對(duì)于診斷結(jié)腸癌也有重要的參考意義，可基于此進(jìn)行前腺癌的診斷[36]。在circulating tumor DNA、循環(huán)瘤DNA(ctDNA)中，同樣可基于5hmC水平變化進(jìn)行臨床癌癥診斷及5hmC作為預(yù)后標(biāo)記物。在不同的癌癥和癌癥不同分期階段，ctDNA中5hmC水平會(huì)呈現(xiàn)顯著差別[37]。因此，可根據(jù)不同患者特定組織細(xì)胞體DNA甲基化水平的特點(diǎn)，對(duì)其患癌的可能性及類型進(jìn)行合理預(yù)判和分析，甚至存在用血液樣本分析癌癥的可能性[38]。

TDG介導(dǎo)的DNA 5mC去甲基化同樣與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有密切聯(lián)系。例如在胰腺癌[39]、食道癌[40]和直腸癌[10]等惡性腫瘤疾病中均可發(fā)現(xiàn)TDG的異常性表達(dá)。未來研究腫瘤發(fā)展與TDG介導(dǎo)的DNA去甲基化的相關(guān)性，可能有助于我們理解腫瘤發(fā)生發(fā)展的內(nèi)在機(jī)理。

3.2 阿爾茨海默氏病

阿爾茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)是一種以認(rèn)知、記憶和語言功能等漸進(jìn)性減弱，或產(chǎn)生障礙為主要癥狀的神經(jīng)退化性疾病，該疾病由遺傳因素與非遺傳因素所共同作用，其中約70%發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)為遺傳性因素[41]。對(duì)小鼠的AD模型研究發(fā)現(xiàn)，小鼠模型的大腦皮質(zhì)基因組5mC含量在不同階段分別產(chǎn)生了不同波動(dòng)，提示DNA甲基化與去甲基化在AD形成過程中可能起到了直接作用[42]。針對(duì)AD患者死后大腦中APOE基因DNA甲基化分析研究表明，AD患者腦中的非神經(jīng)元細(xì)胞主要由神經(jīng)膠質(zhì)組成，AD患者腦中APOE基因DNA甲基化程度顯著降低[43]，說明APOE的異常去甲基化可能是影響AD風(fēng)險(xiǎn)的主要因素。在正常健康和AD患者腦組織中，HSPA8和HSPA9的啟動(dòng)子DNA甲基化水平差異明顯，表明相關(guān)基因及其甲基化修飾是AD發(fā)病機(jī)制的一部分[44]。另外，DNA去甲基化過程的中間產(chǎn)物如5hmC及miRNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體等標(biāo)志物，對(duì)維持動(dòng)物體神經(jīng)細(xì)胞正常運(yùn)行具有重要作用。理解對(duì)DNA去甲基化有關(guān)的表觀遺傳因素與非遺傳因素的相互作用，有助于對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的理解，并有望用于研究新型診斷性生物標(biāo)志物或藥物并投入使用。

3.3 心血管疾病

心血管疾病(Cardiovascular Diseases，CVD)是全球負(fù)擔(dān)最重的慢性疾病之一。根據(jù)2016年全球疾病負(fù)擔(dān)顯示，CVD所造成的居民死亡人數(shù)已超越癌癥，成為了全球居民死亡首位因素[45]。

冠心病是由多基因遺傳和環(huán)境誘發(fā)等因素共同作用產(chǎn)生的疾病，目前心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)在于對(duì)表觀遺傳修飾的研究，即環(huán)境與基因之間的相關(guān)作用可以通過表觀遺傳學(xué)中某些機(jī)理進(jìn)行解釋，冠心病類疾病的產(chǎn)生與惡化與相關(guān)DNA的異常甲基化關(guān)系密切[46,47]。研究發(fā)現(xiàn)，相關(guān)基因中5hmC水平程度與低氧環(huán)境下血管生成密切相關(guān)，5hmC作為DNA去甲基化中間產(chǎn)物，根據(jù)其水平可活化凋亡基因和被抑制基因，基因中5hmC水平的下降則會(huì)導(dǎo)致相關(guān)基因缺乏保護(hù)，從而導(dǎo)致心腦血管疾病的發(fā)生[48]。相信隨著檢測(cè)技術(shù)的改進(jìn)與相關(guān)研究的深入，5hmC有可能成為人類心血管疾病早期診斷與預(yù)后診斷的新的表觀遺傳標(biāo)志。

PM2.5是大氣中重要的環(huán)境污染物，是造成心血管疾病的可控的環(huán)境危險(xiǎn)因素。PM2.5進(jìn)入人體后可通過影響機(jī)體DNA甲基化水平途徑影響CVD的發(fā)生[49]。在CVD病變出現(xiàn)前就有DNA甲基化的改變，因此DNA甲基化可為CVD臨床早期診斷提供依據(jù)[50]。PM2.5暴露量與特定基因位點(diǎn)甲基化與去甲基化的作用，主要影響參與人體系統(tǒng)炎癥因子反應(yīng)、血管延舒收縮和凝血系統(tǒng)啟動(dòng)活性等，這些功能的受損均與CVD的發(fā)病機(jī)理相關(guān)[49]。

3.4 塵肺病等肺纖維病變

塵肺病是以肺部纖維化病變?yōu)橹饕卣鞯募膊?，主要發(fā)生于易長(zhǎng)期吸入微粒粉塵的職業(yè)從業(yè)者中。在疾病發(fā)生過程中，細(xì)胞因子基因活性可通過DNA甲基化過程而被調(diào)節(jié)或改變，從而影響相關(guān)因子的轉(zhuǎn)錄成功率[51,52]。有研究對(duì)矽肺病病例血液樣本進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)其血液中O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基轉(zhuǎn)移酶基因、死亡相關(guān)蛋白激酶基因等均產(chǎn)生甲基化失衡，表現(xiàn)出高甲基化狀態(tài)[51]。有學(xué)者通過對(duì)塵肺病患者相關(guān)基因表達(dá)及其甲基化狀態(tài)進(jìn)行研究，研究發(fā)現(xiàn)基因啟動(dòng)子可通過高甲基化進(jìn)行基因沉默，使其喪失轉(zhuǎn)錄活性，同樣可通過去甲基化促進(jìn)基因的表達(dá)，而相關(guān)從業(yè)者長(zhǎng)期大量的稀土粉塵的吸入，會(huì)使其IFN-γ基因啟動(dòng)子甲基化率高于正常人群，而IL-10基因啟動(dòng)子去甲基化率高于正常人群。該研究表明，稀土粉塵的長(zhǎng)期高攝入量對(duì)從業(yè)者肺部相關(guān)基因表達(dá)造成了明顯影響，DNA甲基化與去甲基化平衡被打破，造成相關(guān)基因啟動(dòng)子失衡[53]。

3.5 進(jìn)食障礙

進(jìn)食障礙(Eating Disorders，ED)，作為人類精神疾病中死亡率最高的疾病之一，該疾病的產(chǎn)生現(xiàn)已被證明與表觀遺傳修飾具有深刻的聯(lián)系[8,54]。ED的產(chǎn)生目前已被發(fā)現(xiàn)與內(nèi)穩(wěn)態(tài)通路DNA異常甲基化有密切的聯(lián)系。神經(jīng)性厭食癥(Anorexia Nervosa，AN)患者呈現(xiàn)整體水平DNA低甲基化。有研究對(duì)AN患者進(jìn)行高通量DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)，無論是臨床急性發(fā)作的AN患者還是體質(zhì)量正常的AN患者，其機(jī)體甲基化程度均異于正常人群對(duì)照組[55]。通過研究ED的整體甲基化模式，建立小鼠進(jìn)食成癮行為模型，發(fā)現(xiàn)成癮樣小鼠前額皮質(zhì)相同腦區(qū)蛋白表達(dá)上調(diào)，其基因啟動(dòng)子DNA甲基化顯著降低[56]。

4 總結(jié)與展望

在植物體和動(dòng)物體的生命活動(dòng)過程中，作為DNA胞嘧啶甲基化沉默基因表達(dá)的逆過程，DNA去甲基化扮演著重要角色。目前對(duì)動(dòng)植物DNA主動(dòng)去甲基化已有一定的理論支持，在植物機(jī)體內(nèi)，以ROS1/DME酶介導(dǎo)的堿基切除修復(fù)去甲基化過程已被證實(shí)，但哺乳動(dòng)物中是否存在直接5mC去甲基化酶還尚未定論。

DNA 5mC甲基化異常及去甲基化異常均會(huì)對(duì)機(jī)體正常生命活動(dòng)產(chǎn)生不利影響，與DNA甲基化相比，DNA去甲基化似乎是一個(gè)更為敏感的標(biāo)志物，對(duì)DNA去甲基化功能的理解對(duì)于解釋在癌癥等疾病中觀察到的甲基化含量變化是必要的。通過對(duì)惡性腫瘤、阿爾茲海默癥、心血管疾病、肺纖維病變、進(jìn)食障礙等進(jìn)行的研究，均表明了DNA去甲基化在疾病臨床診斷和預(yù)后康復(fù)的巨大潛力。因此，研究DNA去甲基化及其對(duì)于生物體機(jī)理的改變，對(duì)于臨床醫(yī)學(xué)具有深遠(yuǎn)的意義。

真核生物6mA修飾是近年研究的熱點(diǎn)。自2015年，發(fā)現(xiàn)果蠅、線蟲和綠藻基因組DNA中存在6mA修飾后[57,58]，引起了廣泛關(guān)注。但6mA是否存在于哺乳動(dòng)物基因組中一直存在爭(zhēng)議[59]。目前已發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)6mA可來源于聚合酶依賴的摻入[60]，而是否存在甲基化轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的N6-腺嘌呤甲基化，以及6mA修飾在細(xì)胞中可能具有什么功能依然有待探索。