五味子復(fù)合提取物對(duì)高脂血癥大鼠的血脂調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制

王春梅，田 雨，林程程，莊文越，李 賀，孫靖輝，陳建光，楊 波

(1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林 吉林 132013；2.北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 吉林 132013)

高脂血癥是心腦血管疾病的基礎(chǔ)，發(fā)病率高，危害大[1].由于患者在患病初期沒(méi)有明顯癥狀，其危害往往容易被忽視，高脂血癥也被稱(chēng)為“沉默的殺手”和“多種疾病的源頭”[2].中醫(yī)倡導(dǎo)“預(yù)防為主”“防治一體”的理念，以維護(hù)人類(lèi)健康，因此，早期干預(yù)對(duì)預(yù)防高脂血癥引起的心腦血管疾病具有重要意義.除了控制飲食、定期鍛煉和其他生活方式調(diào)整外，適當(dāng)應(yīng)用中藥調(diào)節(jié)對(duì)于防治高脂血癥來(lái)說(shuō)也是不錯(cuò)的選擇[3].

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為高脂血癥屬于本虛標(biāo)實(shí)之癥，本虛表現(xiàn)為肝脾腎虧虛，標(biāo)實(shí)表現(xiàn)為氣滯、痰濕停聚、血瘀.因此，高脂血癥的治療原則在于調(diào)節(jié)脾腎功能，使水濕在體內(nèi)的運(yùn)轉(zhuǎn)恢復(fù)正常，從根本上消除痰濁來(lái)源，同時(shí)，對(duì)于體內(nèi)已形成之痰濁，應(yīng)輔以利水化濕之法，達(dá)到標(biāo)本兼顧的目的.所以，我們依據(jù)中醫(yī)藥理論，將五味子、葛根、黃芪和山楂組方，研究其調(diào)血脂作用.其中，五味子滋腎斂陰為君藥，以助腎之開(kāi)合；黃芪補(bǔ)氣健脾為臣藥，以行脾之健運(yùn)；山楂消積散瘀為佐藥，以助胃之開(kāi)合；葛根升陽(yáng)退熱為使藥，以消中焦熱邪.現(xiàn)代藥理學(xué)研究[4-7]表明：五味子、葛根、黃芪和山楂均具有顯著的調(diào)節(jié)血脂作用.因此，本研究中將五味子、葛根、黃芪和山楂進(jìn)行科學(xué)配伍，制備五味子復(fù)合提取物(Schisandra compound extract，SCE)，并探討其對(duì)血脂的調(diào)節(jié)作用，通過(guò)檢測(cè)大鼠肝組織中膽固醇代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)量來(lái)進(jìn)一步探討其作用機(jī)制，從而為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)具有脂質(zhì)調(diào)節(jié)功能的保健食品提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器

選取體質(zhì)量190～210 g的32只雄性Wistar大鼠(長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(吉)2018-0003)，在正常光照條件下，大鼠分籠飼養(yǎng)，室溫(20±2)℃，相對(duì)濕度50%～60%.所有程序均經(jīng)北華大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，批準(zhǔn)編號(hào)20180912. 動(dòng)物飼料(長(zhǎng)春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)中維持飼料組成：玉米粉72.7%，酪蛋白23%，維生素1%，礦物質(zhì)3.1%，胱氨酸0.2%；高脂飼料組成：玉米粉53.3%，酪蛋白20%，豬油15%，蔗糖5%，維生素1%，礦物質(zhì)3.5%，胱氨酸0.2%，膽固醇2%.五味子、葛根、黃芪、山楂(河北省安國(guó)藥材市場(chǎng))由北華大學(xué)藥學(xué)院王維教授根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》(2015版)的鑒定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定.

低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、膽固醇(Total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(High-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；GAPDH、PPARα、LXRα、CYP7A1、SREBP2、HMGCR和HRP-羊抗兔IgG抗體(武漢ABclonal有限公司)；HiScript?Ⅱ One Step RT-PCR Kit試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)；總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物制品有限公司)；Infinite M200酶標(biāo)儀(Tecan集團(tuán)公司，瑞士)；PowerPac型Western blot電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad公司，美國(guó))；PS普諾森FluorChem M成像系統(tǒng)(ProteinSimple公司，美國(guó))；Mastercycler gradient 5331型PCR儀(Eppendorf公司，美國(guó)).

1.2 五味子復(fù)合提取物的制備

稱(chēng)取五味子、葛根、黃芪和山楂(10 g∶25 g∶50 g∶20 g)，研磨成粉末，置于圓底燒瓶中，加入45倍體積的蒸餾水，95 ℃加熱回流提取3次，每次3 h，將提取液進(jìn)行過(guò)濾，合并3次濾液.再將濾液濃縮得到棕色浸膏，產(chǎn)率為34.2%.通過(guò)苯酚-硫酸法測(cè)定SCE中多糖含量[8]，通過(guò)高效液相色譜法測(cè)定SCE中葛根素含量，經(jīng)計(jì)算，SCE中每100 g含9.85 g多糖，含0.45 g葛根素.

1.3 高脂血癥大鼠模型的制備、分組及給藥方式

將32只Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為4組，空白對(duì)照組(Control)、高脂模型組(Model)、低劑量SCE組(100 mg/kg)和高劑量SCE組(200 mg/kg)，每組8只.除空白對(duì)照組外，其余3組大鼠均采用高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)高脂血癥大鼠模型，SCE低、高劑量組均在給予高脂飼料時(shí)即開(kāi)始灌胃干預(yù)，每組大鼠給藥量均為5 mL/kg，空白對(duì)照組和模型組給予等體積的蒸餾水，1次/d，持續(xù)8周.檢測(cè)大鼠血脂水平，以TG、TC、LDL-C水平明顯升高作為造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[9-10]，同時(shí)每周檢測(cè)大鼠體質(zhì)量.

1.4 樣本采集

最后一次給藥12 h后，乙醚麻醉大鼠，進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，4 ℃分離血清(3 500 r/min，10 min)，-20 ℃保存待用.采血后快速取出大鼠肝臟，用4 ℃預(yù)冷的生理鹽水洗滌，濾紙吸干后稱(chēng)取肝質(zhì)量，并計(jì)算肝指數(shù)：肝指數(shù)=肝質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%.其中一部分保存在-80 ℃冰箱中，另一部分用于組織病理學(xué)檢查.

1.5 各組大鼠血清生化指標(biāo)檢測(cè)

采用酶學(xué)方法檢測(cè)大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平，具體操作嚴(yán)格參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.

1.6 各組大鼠肝組織中TC、TG含量檢測(cè)

取100 mg肝組織溶于試劑盒的裂解液中，制成10%肝勻漿，具體操作步驟參照TC、TG水平檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū).

1.7 各組大鼠組織病理學(xué)觀察

將肝組織標(biāo)本置入10%中性福爾馬林溶液中固定后，流水沖洗，經(jīng)過(guò)梯度酒精洗脫，浸蠟包埋，制成5 μm石蠟切片，用蘇木精-伊紅進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察大鼠肝細(xì)胞病理形態(tài)(放大倍數(shù)，×200和×400).

1.8 RT-PCR法檢測(cè)大鼠肝組織中PPARα、LXRα、CYP7A1 HMGCR和SREBP2 mRNA的表達(dá)

采用高純總RNA快速提取方法，提取各組大鼠肝臟組織總RNA.按照HiScript?Ⅱ One Step RT-PCR Kit試劑盒對(duì)每個(gè)樣品的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增反應(yīng).擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度：PPARα、CYP7A1和 GAPDH為55 ℃，HMGCR和SREBP2為58 ℃，LXRα為56 ℃)，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min后4 ℃下保存.

引物序列：PPARα上游引物5′-GGACTCGA GGAGGTCAAGAA-3′，下游引物5′-GGGAGTGGTC ATCCATCACA-3′；LXRα上游引物5′- GAGTCATC CGAGCCTACAGC-3′，下游引物5′-AAGAATCCCTT GCAGCCCTC-3′；CYP7A1上游引物5′-TTTGGGG AATTGCCGTGTTG-3′，下游引物5′-ACGGAATCAA CCCGTTCTCC-3′；SREBP2上游引物5′-CCGAACTG GGCGATGGATG-3′，下游引物5′-CTGGCTGAAT GACCGCTGTA-3′；HMGCR上游引物5′-GCGGCA GCTTGAGATCAT-3′，下游引物5′-AGCTCAGC CATTTTGCCAG-3′；GAPDH上游引物5′-GGCAAG TTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-GCCAGTAGA CTCCACGACAT-3′.取PCR產(chǎn)物(10 μL)進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠圖像系統(tǒng)所得到的目標(biāo)條帶進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算各組基因與內(nèi)參GAPDH的相對(duì)表達(dá)值.

1.9 Western blotting檢測(cè)大鼠肝組織中PPARα、LXRα、CYP7A1、HMGCR和SREBP2蛋白表達(dá)

從-80 ℃冰箱中取出50 mg大鼠肝臟組織，加入450 μL組織蛋白裂解緩沖液，勻漿器勻漿后冰上裂解1 h.離心10 min(12 000 r/min，4 ℃)，收集上清，通過(guò)BCA法測(cè)定上清液中的組織蛋白濃度.將蛋白質(zhì)樣品沸水浴加熱10 min使其變性，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離后轉(zhuǎn)移到PVDF膜.于5%脫脂奶粉中搖床封閉2 h，分別加入PPARα(1∶1 500稀釋)、LXRα(1∶1 500稀釋)、CYP7A1(1∶1 000稀釋)、SREBP2(1∶2 000稀釋)和HMGCR(1∶2 000稀釋)第一抗體，4 ℃孵育過(guò)夜.將膜用TBST洗滌3次，10 min/次，然后在室溫下進(jìn)行二抗(1∶5 000稀釋)溫育1 h.用ECL顯影液進(jìn)行顯色曝光，并使用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)拍攝圖像.蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量用目標(biāo)蛋白/GAPDH表示.

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠體質(zhì)量明顯升高(P<0.01)，肝指數(shù)明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，低、高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)明顯降低(P<0.05).見(jiàn)表1.

表1 各組大鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)Tab.1 Body weight and liver index of rats in each group

2.2 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明顯升高(P<0.01)，HDL-C水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，低、高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，HDL-C水平明顯升高(P<0.05)；與低劑量五味子復(fù)合提取物組比較，高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠血清中TC、TG和LDL-C水平明顯降低(P<0.05)，HDL-C水平明顯升高(P<0.05).見(jiàn)表2.

表2 各組大鼠血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C水平Tab.2 Serum TC，TG，LDL-C and HDL-C levels of rats in each group

2.3 各組大鼠肝組織中TC、TG含量檢測(cè)

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟組織中TC和TG含量明顯增加(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，低、高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠肝組織中TC和TG含量明顯降低(P<0.01或P<0.05)；與低劑量五味子復(fù)合提取物組比較，高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠肝組織中TC含量明顯降低(P<0.05).見(jiàn)表3.

表3 各組大鼠肝臟中TC、TG水平Tab.3 TC and TG levels in the liver of rats in each group

2.4 各組大鼠肝臟病理形態(tài)表現(xiàn)

空白對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)規(guī)則，肝細(xì)胞條索狀排列；模型組大鼠幾乎所有肝細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)空泡，肝血竇腔受壓變窄，肝組織損傷嚴(yán)重；低、高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠肝細(xì)胞胞漿內(nèi)空泡數(shù)量減少，肝血竇清晰可見(jiàn)，大鼠肝臟病變得到明顯緩解.見(jiàn)圖1.

2.5 各組大鼠肝臟組織中PPARα、LXRα、CYP7A1的mRNA和蛋白表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟組織中PPARα、LXRα和CYP7A1的表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，低、高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠肝臟組織中PPARα、LXRα、CYP7A1的表達(dá)水平均明顯增加(P<0.05或P<0.01).與低劑量五味子復(fù)合提取物組比較，高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠肝臟組織中PPARα mRNA表達(dá)明顯增加(P<0.05).見(jiàn)圖2、表4.

A.Control group；B.Model group；C.low dose of SCE group；D.high dose of SCE group；第1行為HE，×200，第2行為HE，×400.圖1 各組大鼠肝臟病理形態(tài)表現(xiàn)Fig.1Pathological morphology of rat liver in each group

1.Control group；2.Model group；3.low dose of SCE group；4.high dose of SCE group；A.mRNA expression electropherogram；B.Proteins expression electropherogram.圖2 RT-PCR法和Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中PPARα、LXRα、CYP7A1的mRNA和蛋白表達(dá)電泳Fig.2Electrophoresis of protein expression of PPARα，LXRα and CYP7A1 mRNA in liver of rats in each group detected by RT-PCR method and Western blotting method

表4 各組大鼠肝臟組織PPARα、LXRα 、CYP7A1的mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.4 Expression levels of PPARα，LXRα and CYP7A1 mRNA and proteins in liver tissue of rats in each group

2.6 各組大鼠肝臟組織中 SREBP2、HMGCR的mRNA和蛋白表達(dá)水平

與空白對(duì)照組比較，模型組大鼠肝臟組織中SREBP2和HMGCR的表達(dá)水平明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，低、高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠肝臟組織中SREBP2、HMGCR的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與低劑量五味子復(fù)合提取物組比較，高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠肝臟組織中SREBP2、HMGCR mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05).見(jiàn)圖3、表5.

1.Control group；2.Model group；3.low dose of SCE group；4.high dose of SCE group；A.mRNA expression electropherogram； B.Proteins expression electropherogram.圖3 RT-PCR法和Western blotting 法檢測(cè)各組大鼠肝臟組織中SREBP2、HMGCR的mRNA和蛋白表達(dá)電泳Fig.3Electrophoresis of protein expression of SREBP2 and HMGCR mRNA in liver of rats in each group detected by RT-PCR method and Western blotting method

表5 各組大鼠肝臟組織中SREBP2、HMGCR的mRNA和蛋白表達(dá)水平Tab.5 Protein expression levels of SREBP2 and HMGCR mRNA in liver tissue of rats in each group

3 討 論

高脂血癥是體內(nèi)脂質(zhì)紊亂導(dǎo)致血脂水平增高的代謝性疾病.隨著生活水平的提高，人們飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣發(fā)生改變，富含脂類(lèi)和蛋白類(lèi)的高脂肪高熱量食物已經(jīng)取代了原本的粗纖維食物，同時(shí)由于體力勞動(dòng)和運(yùn)動(dòng)的時(shí)間、強(qiáng)度逐漸減少，導(dǎo)致肥胖者居多，血脂普遍偏高.現(xiàn)代藥理學(xué)研究[11-12]表明：五味子多糖可以顯著減輕非酒精性脂肪性肝病和高脂飲食誘導(dǎo)的2型糖尿病動(dòng)物模型中的脂質(zhì)代謝紊亂.黃芪多糖可以改善小鼠的高脂血癥，其作用與辛伐他汀相似[13]，葛根素主要存在于豆科植物野葛根部，具有生津止渴、降血壓的功效.通過(guò)增加高膽固醇血癥大鼠肝臟中CYP7A1的表達(dá)來(lái)降低膽固醇含量，對(duì)高血糖和高脂血癥有明顯的預(yù)防作用[14].本研究結(jié)果顯示：高脂飲食喂養(yǎng)8周可導(dǎo)致大鼠發(fā)生脂代謝紊亂，血脂水平升高，經(jīng)不同劑量五味子復(fù)合提取物治療后，大鼠血清中TC、TG、LDL-C水平明顯降低，肝臟脂質(zhì)沉積減輕.

肝臟是維持膽固醇穩(wěn)態(tài)的重要器官，膽固醇的水平受許多因素的影響，例如吸收、合成、排泄和分解.HMGCR是肝臟中膽固醇合成的限速酶，其活性大小直接影響著膽固醇合成的速度，影響著體內(nèi)膽固醇的含量[15].SREBP2是調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成和代謝的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)膽固醇降低時(shí)，SREBP2促進(jìn)HMGCR的表達(dá)，從而增加膽固醇的生物合成[16-18].有研究[19]表明，高膽固醇飲食的大鼠體內(nèi)HMGCR和SREBP2的表達(dá)增加，而在給予藥物治療后其表達(dá)被抑制，與上述報(bào)道一致.本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠肝組織中SREBP2和HMGCR的表達(dá)水平明顯高于空白對(duì)照組；與模型組比較，低、高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠肝組織中SREBP2和HMGCR的表達(dá)水平明顯下降，表明五味子復(fù)合提取物可通過(guò)降低SREBP2的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)HMGCR的轉(zhuǎn)錄，從而抑制膽固醇的合成，降低高脂血癥大鼠體內(nèi)膽固醇水平.

膽固醇在肝臟中轉(zhuǎn)化為膽汁酸是降低血清膽固醇水平、維持機(jī)體膽固醇平衡的另一條重要途徑之一，而CYP7A1是膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的關(guān)鍵酶[20].有研究[21-22]表明：通過(guò)增加CYP7A1的表達(dá)，能夠促進(jìn)膽固醇和膽汁酸的排泄，進(jìn)而降低膽固醇水平.CYP7A1的活性受肝X受體-α(LXRα)的調(diào)控，在整體水平上直接作用于小鼠LXR的配體，激活LXRα，CYP7A1基因的表達(dá)也明顯增強(qiáng)[23].過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體-α(PPARα)作為配體活化的轉(zhuǎn)錄因子，可與靶基因上的LXR調(diào)節(jié)元件(PPRE)結(jié)合，進(jìn)而上調(diào)LXR基因的轉(zhuǎn)錄，增加CYP7A1的活性[24].有研究[25-27]顯示：高脂飲食誘導(dǎo)的高脂血癥大鼠及小鼠模型肝組織中PPARα、LXRα和CYP7A1的表達(dá)均顯著降低.本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠肝組織PPARα、LXRα、CYP7A1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平均低于空白對(duì)照組；與模型組比較，低、高劑量五味子復(fù)合提取物組大鼠肝組織中PPARα、LXRα、CYP7A1的mRNA和蛋白的表達(dá)水平增加，表明五味子復(fù)合提取物可通過(guò)激活PPARα上調(diào)LXRα來(lái)促進(jìn)CYP7A1的表達(dá)，進(jìn)而增加膽汁酸的生成，降低體內(nèi)膽固醇的水平.

綜上所述，五味子復(fù)合提取物可有效降低高脂血癥大鼠體質(zhì)量，調(diào)節(jié)血脂水平，減輕肝臟脂質(zhì)沉積，并可能通過(guò)調(diào)節(jié)PPARα/LXRα/CYP7A1和HMGCR/SREBP2信號(hào)通路的表達(dá)促進(jìn)膽固醇的排泄，抑制膽固醇的合成，進(jìn)而達(dá)到改善高脂血癥的目的.