銅和強(qiáng)力霉素復(fù)合污染對(duì)土壤微生物與酶活性的影響*

陳欣瑤，肖祖飛，祝妍華，武 劍，華倩雯，張 園?

（1.蘇州科技大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇蘇州 215009；2.蘇州工業(yè)園區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)站，江蘇蘇州 215027；3.蘇州高新區(qū)環(huán)境監(jiān)測(cè)大隊(duì)，江蘇蘇州 215000）

農(nóng)業(yè)土壤污染已成為當(dāng)前亟待解決的問(wèn)題之一，多種污染物在土壤共存并互相作用促使土壤污染趨于多樣化和復(fù)雜化，導(dǎo)致復(fù)合污染逐漸成為土壤污染的研究重點(diǎn)[1-2]。其中重金屬（包括Cu、Zn）和抗生素常被廣泛應(yīng)用為飼料添加劑[3-6]，但二者的施用可能導(dǎo)致特定微生物對(duì)其敏感性降低，減少畜禽對(duì)其他抗菌藥物的易感性[4，6-7]。糞便改良農(nóng)田可能具有加快土壤中抗生素和重金屬共存積累和刺激土壤菌群抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）傳播轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)[2，7-10]，使土壤成為重金屬、抗生素和ARGs的重要儲(chǔ)存庫(kù)之一，進(jìn)而增加農(nóng)作物和蔬菜的潛在健康風(fēng)險(xiǎn)[9-12]。此外，土壤生物活動(dòng)主要由生態(tài)系統(tǒng)最重要組分之一的微生物來(lái)控制，從而導(dǎo)致微生物活性、多樣性、群落結(jié)構(gòu)和酶活性等常被建議作為土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的評(píng)價(jià)指標(biāo)[1，6，13-15]。

相關(guān)研究表明，重金屬污染會(huì)明顯影響土壤微生物、酶的活性，且不同類(lèi)型、濃度重金屬對(duì)土壤微生物多種功能的影響效果也會(huì)顯現(xiàn)出較大差異性[16-17]。低濃度抗生素能促進(jìn)土壤微生物呼吸，而環(huán)境濃度抗生素則不會(huì)顯著影響微生物呼吸[18-19]?？股嘏c重金屬的絡(luò)合、交互可能會(huì)對(duì)土壤微生物造成更大的毒性影響[4，9，11]。劉愛(ài)菊等[20]發(fā)現(xiàn)磺胺甲基嘧啶與 Cu低劑量復(fù)合可能誘導(dǎo)土壤微生物對(duì)二者產(chǎn)生交互抗性，而高劑量復(fù)合污染則可能顯著性地協(xié)同抑制土壤微生物生態(tài)功能。此外，環(huán)境中抗生素和重金屬的釋放均能夠促進(jìn)ARGs豐度增加；重金屬與抗生素耐藥性的傳播間存在一定的聯(lián)系[20-22]。Knapp等[21]對(duì)蘇格蘭土壤分析表明，土壤 Cu濃度與tetM/W、blaOXA、ermB/F豐度有顯著性相關(guān)關(guān)系。Cheng等[22]發(fā)現(xiàn)種植蔬菜、黑麥草土壤中tetARGs豐度與四環(huán)素類(lèi)抗生素濃度顯著相關(guān)。

目前，國(guó)內(nèi)外針對(duì)抗生素與重金屬?gòu)?fù)合污染的研究所選取的抗生素類(lèi)型多是青霉素、四環(huán)素、土霉素等，對(duì)強(qiáng)力霉素（Doxycycline，DOX）的研究還比較少[23-25]。DOX 作為獸藥因在抗菌效果、口服生物利用度等方面明顯優(yōu)于傳統(tǒng)四環(huán)素類(lèi)抗生素，與 Cu一樣被廣泛應(yīng)用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)，導(dǎo)致其隨畜禽糞便代謝的產(chǎn)物與殘留在糞肥改良周?chē)寥乐写罅坷鄯e[26]。因此，研究DOX和Cu復(fù)合污染對(duì)土壤微生物呼吸、酶（脲酶、蔗糖酶和過(guò)氧化氫酶）活性、ARGs（tetA/C/G/M/W/X）豐度等土壤生態(tài)指標(biāo)的影響，以期為土壤重金屬和抗生素復(fù)合污染的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和微生物預(yù)警體系建立等工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤樣品為南京農(nóng)業(yè)大學(xué)（32°01'46″N，118°50'22″E）采集的非農(nóng)用裸土，隨機(jī)選擇三個(gè)間隔10 m的地塊（范圍0.5 m×0.5 m），去除1 cm表層土，收集1～20 cm土壤，風(fēng)干研磨過(guò)2 mm篩備用[14-15]。土壤 Cu 背景值為 47.71 mg·kg–1，pH 為5.48±0.23，總有機(jī)碳為 18.61±0.57 mg·kg–1，全氮為1.19±0.21 mg·kg–1，碳氮比為 21.48±0.42，CEC 為23.12±0.74 mol·kg–1。pH 采用 PHS-3E 測(cè)定，土水比1︰5（w/v）；全碳、全氮采用元素分析儀測(cè)定；CEC采用乙酸銨交換法測(cè)定[14-15，27]。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

土壤樣品分為三部分，加入并充分混合氯化銅溶液，使土壤中添加的 Cu分別為 0、100和400 mg·kg–1（以下記作 Cu0、Cu100 及 Cu400），土壤含水量調(diào)整為18%，然后在25℃下活化48 h。將三個(gè)上述Cu處理的土壤分為三部分，加入DOX溶液（98%美國(guó)藥典級(jí)）使其濃度分別為 0、8和15 mg·kg–1（以下記作 DOX0、DOX8 及 DOX15），調(diào)整含水量至 25%[15，27]。將處理后土壤樣品放入寬口塑料瓶中，纖維膜密封，確保通風(fēng)，減少水分蒸發(fā)，期間保持25℃和25%含水率恒溫恒濕培養(yǎng)[14-15，27]。分別在培養(yǎng) 1、3、7、15、22、30 d分析土壤微生物指標(biāo)，不添加外源污染物的土壤定義為 CK空白對(duì)照，處理方式及其標(biāo)記見(jiàn)表1。

表1 外源污染物的添加濃度與處理組的標(biāo)記方式Table 1 Concentration of exogenous pollutants added and labeling of the treatments

1.3 微生物呼吸分析

本研究采用底物誘導(dǎo)呼吸速率實(shí)驗(yàn)進(jìn)行土壤樣品培養(yǎng)。在培養(yǎng) 1、3、7、15、22、30 d從各處理組分別稱(chēng)取 12 g土樣于塑料瓶中，加入葡萄糖（30 mg·g–1土樣）與土壤充分混合以促進(jìn)微生物呼吸，隨后放置裝有5 mL 0.2 mol·L–1NaOH的玻璃瓶于塑料瓶中并密封，在28°C恒溫培養(yǎng)12 h，呼吸剩余 NaOH 加入 1.0 mol·L–1BaCl2溶液后，用0.05 mol·L–1HCl 溶液進(jìn)行滴定[14-15，27-28]。分別對(duì)各取樣點(diǎn)土壤進(jìn)行底物誘導(dǎo)呼吸速率實(shí)驗(yàn)，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置無(wú)土壤空白對(duì)照，每組3個(gè)重復(fù)。微生物呼吸強(qiáng)度（mg·12h–1）的計(jì)算公式表示為：

式中，V為HCl溶液的滴定值（L）；C為鹽酸溶液的摩爾濃度（mol·L–1）；n為 NaOH 吸收溶液相對(duì)HCl滴定溶液的濃度倍數(shù)，取值4；M為CO2分子質(zhì)量（mg·mol–1）；t為底物誘導(dǎo)微生物呼吸實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)時(shí)間，12 h。

1.4 土壤酶活性分析

通過(guò) 3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定蔗糖酶活性，以通過(guò)每克干土24 h內(nèi)產(chǎn)生的葡萄糖（mg）的量來(lái)表示[28-30]。通過(guò)苯酚鈉比色法測(cè)定脲酶活性，表示為每克土壤24 h后殘留NH3-N的質(zhì)量（mg）[29]。通過(guò)高錳酸鉀滴定檢測(cè)過(guò)氧化氫酶活性，表示為每克干土1 h內(nèi)小消耗KMnO4體積（mL）[30]。

1.5 DNA提取和定量實(shí)時(shí)PCR（qPCR）分析

對(duì)培養(yǎng) 1、7、15、30 d的土壤樣品提取 DNA進(jìn)行ARGs及微生物群落結(jié)構(gòu)的測(cè)定。取約0.5 g土壤樣品，根據(jù) FastDNA?Spin Kit（MP Biomedical，Santa Ana，California，USA）提供的實(shí)驗(yàn)操作流程提取土壤微生物DNA。提取的DNA用1% 的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，檢測(cè)提取效果。并用紫外分光光度計(jì)ND-1000（Nano-Drop，美國(guó)）測(cè)定所提取DNA濃度及純度[7，31-32]。提取所得到的有效DNA儲(chǔ)存于–20℃冰箱，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

本次研究ARGs的測(cè)序采樣HT-qPCR，選用7對(duì)引物，包含 6對(duì) ARGs引物（tetA/C[33]、tetG/M/W/X[26]）和1對(duì)16S rRNA gene引物（515F和907R）[32]。本實(shí)驗(yàn)采用 SmartChip Real-time PCR Systems（WaferGen，美國(guó)）高通量熒光定量的反應(yīng)平臺(tái)。PCR定量體系為100 nL（1×LightCycler 480 SYBR Green I Master、1 mg·mL–1牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、500 nmol·L–1引物以及 5 ng·μL–1DNA 樣品）。混合好的 PCR 體系由SmartChip 納米分配器分加到一個(gè)待用的SmartChip中，將密封SmartChip裝到SmartChip 循環(huán)儀中運(yùn)行。ARGs定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；94℃變性40 s，退火溫度對(duì)應(yīng)上述順序分別為 58、54、68、55、64及 57℃延伸 30 s，40個(gè)循環(huán)，72℃再延伸 10 min，4℃保存[26]。16S rRNA gene定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 20 s（40 個(gè)循環(huán)）；72℃ 4 min；4℃保存[7]。程序自動(dòng)升溫進(jìn)行熔解曲線分析根據(jù)SmartChip Real-Time System的檢測(cè)限和靈敏度。

將同一樣本的PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物混合后用2% 瓊脂糖凝膠做電泳檢測(cè)，使用 DNA凝膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）切膠回收 PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物，洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)。提取的質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，按10倍濃度梯度稀釋系列（拷貝數(shù)從n×1010系列稀釋至n×102），以拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)（C1）計(jì)算公式如下：

耐藥基因拷貝數(shù)（copies·g–1）的方法如下：

式中，C1為標(biāo)曲計(jì)算所得基因拷貝數(shù)（copies·μL–1）；L為阿弗加德羅常數(shù)（6.02×1023）；C為質(zhì)粒 DNA濃度（ng·μL–1）；N為目標(biāo)基因的模板長(zhǎng)度（bp）；M為每對(duì)DNA的平均分子量 660；M1為土壤干重（g）；V為洗脫DNA體積（μL）。

1.6 數(shù)據(jù)處理

本研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（M±SE）表示，運(yùn)用Excel 2016及SPSS 24.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，影響率=（處理組–CK）/CK×100%。采用方差分析（One-way ANOVA with LSD 多重方差分析，Kruskal-Wallis test）進(jìn)行差異顯著性分析，采用Pearson系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析，顯著水平P值設(shè)為0.05，極顯著水平P值設(shè)為0.01。運(yùn)用Origin 2017進(jìn)行圖像處理。

2 結(jié) 果

2.1 銅和強(qiáng)力霉素污染對(duì)土壤微生物呼吸的影響

本研究通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定 DOX、Cu單一及復(fù)合脅迫下土壤微生物呼吸強(qiáng)度，以此定量表征微生物活性。土壤微生物呼吸強(qiáng)度波動(dòng)范圍為0.61～16.21 mg·kg–1（圖1）。研究結(jié)果表明不同濃度DOX與Cu單一及復(fù)合污染在培養(yǎng)期內(nèi)均會(huì)顯著抑制土壤微生物呼吸強(qiáng)度（P<0.05），且對(duì)微生物呼吸的抑制作用均在培養(yǎng)15/22 d最弱。此外，對(duì)于同一污染類(lèi)型，微生物在培養(yǎng)初期（1 d）的呼吸強(qiáng)度均大于其在培養(yǎng)終期（30 d）的呼吸強(qiáng)度。

DOX單一污染在培養(yǎng)期會(huì)始終抑制對(duì)土壤微生物呼吸，抑制率在培養(yǎng)1 d最大。對(duì)于Cu單一污染，結(jié)果表明Cu400處理下微生物呼吸始終保持在較低水平，而Cu100處理下微生物呼吸強(qiáng)度在培養(yǎng)期內(nèi)雖均低于CK，但隨培養(yǎng)時(shí)間不斷恢復(fù)增強(qiáng)。

對(duì)于Cu、DOX復(fù)合污染（見(jiàn)圖1），DOX8/15（+Cu100）單一/聯(lián)合作用時(shí)的抑制率均在 1 d達(dá)到最大，抑制率范圍為81.47%～95.04%，且抑制強(qiáng)度均隨時(shí)間先降低后加劇，DOX存在會(huì)加劇 Cu100脅迫對(duì)微生物呼吸的抑制，且該抑制作用隨 DOX濃度升高增強(qiáng)。當(dāng) DOX8/15+Cu400作用時(shí)，其在培養(yǎng)期間對(duì)土壤微生物呼吸維持較高的抑制作用，抑制率始終高于45%，且DOX8會(huì)加大Cu400對(duì)微生物呼吸的抑制作用，而DOX15培養(yǎng)期內(nèi)一度緩解Cu400的該毒性作用。

2.2 銅和強(qiáng)力霉素污染對(duì)土壤酶活性的影響

土壤酶活性常被用來(lái)衡量土壤中各種生化反應(yīng)的動(dòng)力和強(qiáng)度，是土壤肥力大小的重要標(biāo)志[33]。土壤酶活性的改變一定程度可用來(lái)判斷土壤受污染程度[26]。由上述污染對(duì)土壤微生物呼吸的影響可知，培養(yǎng)3 d多為微生物呼吸某一變化趨勢(shì)的中間節(jié)點(diǎn)，故本研究通過(guò)在培養(yǎng)1、7、15、22、30 d測(cè)定脲酶、蔗糖酶及過(guò)氧化氫酶活性來(lái)比較處理間的效果差異。

由圖2可知，DOX單一污染培養(yǎng)期內(nèi)均能明顯促進(jìn)土壤脲酶活性，激活率隨時(shí)間逐漸升高，但兩者濃度不同造成的激活率差異性不大。Cu100單一作用能促進(jìn)脲酶活性；而Cu400單一作用對(duì)脲酶活性有抑制作用，抑制率在1 d達(dá)到最大，但脲酶活性隨時(shí)間能夠基本恢復(fù)。對(duì)于Cu、DOX復(fù)合污染，其在 1 d對(duì)脲酶活性為弱抑制作用，其中Cu100+DOX8/15與 Cu400+DOX8復(fù)合在培養(yǎng)后期對(duì)脲酶活性轉(zhuǎn)化為激活作用，但 Cu400+DOX15處理后期仍表現(xiàn)出抑制作用。故上述類(lèi)型污染對(duì)脲酶活性在培養(yǎng)期（1～30 d）均主要表現(xiàn)為促進(jìn)作用，除 Cu400+DOX15復(fù)合脅迫時(shí)在培養(yǎng)期對(duì)脲酶活性表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制作用，這可能是因?yàn)閮烧吒邼舛券B加所帶來(lái)的毒性危害。

DOX、Cu單一及復(fù)合污染對(duì)土壤蔗糖酶活性的影響見(jiàn)圖2。Cu、DOX單一及復(fù)合污染對(duì)蔗糖酶在培養(yǎng)期內(nèi)主要為抑制作用，抑制強(qiáng)度隨時(shí)間推移逐漸減弱，30 d基本恢復(fù)至初始水平。DOX單一處理對(duì)蔗糖酶活性整體呈抑制作用，DOX8對(duì)蔗糖酶活性的抑制率隨時(shí)間逐漸增大；DOX15前期抑制酶活性，終期（30 d）激活蔗糖酶活性。單一Cu脅迫及其與DOX復(fù)合脅迫對(duì)蔗糖酶活性均呈現(xiàn)“抑制-激活”趨勢(shì)。研究還發(fā)現(xiàn) Cu100+DOX8/15復(fù)合作用的修復(fù)轉(zhuǎn)折點(diǎn)是22 d，而Cu400+DOX8/15復(fù)合作用修復(fù)轉(zhuǎn)折點(diǎn)提前，為15 d。

培養(yǎng)期內(nèi)，Cu、DOX單一及復(fù)合污染對(duì)過(guò)氧化氫酶活性主要表現(xiàn)為抑制作用，但該抑制強(qiáng)度要明顯大于蔗糖酶（圖2），抑制強(qiáng)度隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸減弱，且30 d基本均恢復(fù)至初始水平，即其能在30 d內(nèi)恢復(fù)DOX、Cu單一及復(fù)合污染。培養(yǎng)期各處理方式下土壤過(guò)氧化氫酶活性的差異性并不顯著，單一 Cu脅迫使過(guò)氧化氫酶活性先降低后增加，激活轉(zhuǎn)折點(diǎn)為7d，且激活強(qiáng)度相對(duì)較弱。復(fù)合污染處理中，僅Cu400+DOX15在30 d仍保持抑制作用，即DOX與Cu高濃度復(fù)合給過(guò)氧化氫酶活性帶來(lái)不可逆毒性影響。

2.3 銅和強(qiáng)力霉素污染對(duì)抗生素抗性基因相對(duì)豐度的影響

由于本研究對(duì)土壤系統(tǒng)中ARGs豐度的探究更強(qiáng)調(diào) Cu、DOX復(fù)合污染添加前后對(duì)其的影響差異性，但為確保該差異性的產(chǎn)生具有一定的合理性和過(guò)渡性，本研究又在培養(yǎng)前期和中期各增加一個(gè)檢測(cè)點(diǎn)，即在培養(yǎng)1、7、15、30 d檢測(cè)并計(jì)算各處理中的6種tetARGs的相對(duì)豐度。本研究共檢出tetA、tetC、tetG及tetW 4種ARGs（見(jiàn)圖3）。

圖3表明，DOX、Cu單一及復(fù)合污染處理下，tetA相對(duì)豐度隨時(shí)間基本呈先降低后增加的趨勢(shì)，相對(duì)豐度最高值出現(xiàn)在培養(yǎng)1 d的CK空白對(duì)照組，復(fù)合污染在培養(yǎng)7 d、15 d對(duì)tetA相對(duì)豐度的抑制大于其余污染組。復(fù)合污染處理下，tetW 相對(duì)豐度隨時(shí)間先增加后降低，且該基因相對(duì)豐度的整體水平偏低于其他基因。此外，研究發(fā)現(xiàn) Cu400+DOX15在培養(yǎng)15 d其tetA、tetW相對(duì)豐度上升約2個(gè)數(shù)量級(jí)，上升幅度遠(yuǎn)高于該時(shí)間點(diǎn)其余處理組。

對(duì)于檢出的4種ARGs的總相對(duì)豐度（圖4），除 DOX8與 Cu100外，其余處理隨培養(yǎng)時(shí)間的變化趨勢(shì)為“降低-升高”，且ARGs總相對(duì)豐度在培養(yǎng)1 d的水平基本均高于其在培養(yǎng)30 d的水平，僅Cu400+DOX15復(fù)合在培養(yǎng)30 d的ARGs總相對(duì)豐度略高于1 d；而對(duì)DOX8、Cu100兩種單一污染，ARGs總相對(duì)豐度隨時(shí)間的變化趨勢(shì)為“升高-降低-升高”。上述現(xiàn)象說(shuō)明 Cu、DOX 單一及復(fù)合污染在培養(yǎng)中-后期均有一定的可能性會(huì)提高該tetARGs的總相對(duì)豐度。所有處理中，Cu400+DOX15復(fù)合污染處理能在培養(yǎng)15 d、30 d顯著提高ARGs的總豐度，且該豐度水平遠(yuǎn)高于其余處理。此外，研究發(fā)現(xiàn)tetA豐度對(duì)檢出ARGs總相對(duì)豐度的貢獻(xiàn)率遠(yuǎn)大于其他ARGs（圖3，圖4）。

3 討 論

3.1 銅和強(qiáng)力霉素對(duì)土壤微生物呼吸的作用

目前，DOX和Cu廣泛應(yīng)用于治療各種感染病導(dǎo)致其在畜禽糞便大量累積，且隨著畜禽糞便作為有機(jī)肥料施用轉(zhuǎn)移至農(nóng)業(yè)土壤[20，26]。本研究中，強(qiáng)力霉素和銅單一和復(fù)合污染在培養(yǎng)期內(nèi)均會(huì)顯著抑制土壤微生物呼吸（P<0.05）（圖1），其對(duì)微生物呼吸的抑制作用均在培養(yǎng)15/22 d表現(xiàn)最弱，且對(duì)于同一污染類(lèi)型，微生物在培養(yǎng)末期的呼吸強(qiáng)度大于初期，這可能是土壤微生物在接受外源污染物時(shí)需要15 d以上的時(shí)間才能逐步適應(yīng)變化并削弱污染物的負(fù)面影響，以在培養(yǎng)后期維持土壤生態(tài)系統(tǒng)的功能穩(wěn)定[14-15]。

研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于單一污染，復(fù)合污染在培養(yǎng)期間對(duì)微生物呼吸具有更強(qiáng)的抑制作用，且Cu400+DOX8/15復(fù)合污染對(duì)土壤微生物呼吸的抑制強(qiáng)度大于 Cu100+DOX8/15（圖1），這與前人的相關(guān)研究結(jié)果類(lèi)似[8，19，34]。這可能是由于復(fù)合污染條件下DOX能通過(guò)官能團(tuán)與Cu2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，導(dǎo)致Cu、DOX與其形成的絡(luò)合物能加大對(duì)土壤微生物的毒性作用，促使微生物的數(shù)量隨著Cu100/400的添加而降低，降低幅度隨Cu濃度增加而增大。另有相關(guān)研究表明土霉素、恩諾沙星、磺胺嘧啶與Cu復(fù)合能明顯抑制細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量，且微生物數(shù)量隨著Cu濃度增加逐漸減少，能有效支撐上述研究結(jié)果[24]。此外，Cu400+DOX8復(fù)合污染對(duì)土壤培養(yǎng)期間總微生物呼吸的抑制效應(yīng)大于Cu400+DOX15，這可能是由于Cu400和DOX15的高濃度疊加會(huì)使微生物積極維持甚至刺激其呼吸作用，從而抵御高毒性或高濃度外源污染物的復(fù)合污染[23，35]。

3.2 銅和強(qiáng)力霉素對(duì)土壤酶活性的作用

本研究發(fā)現(xiàn)，Cu、DOX單一污染在培養(yǎng)期內(nèi)對(duì)脲酶活性主要為促進(jìn)作用，Cu添加濃度與脲酶活性極顯著正相關(guān)（P<0.01）。李曉陽(yáng)[26]施用含DOX糞肥改良土壤發(fā)現(xiàn)DOX能促進(jìn)脲酶活性增高，孟慶峰等[28]發(fā)現(xiàn)低濃度 Cd、Pb對(duì)脲酶活性有促進(jìn)作用，一定程度能支持上述結(jié)果。Cu、DOX單一污染對(duì)蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶活性主要為抑制作用，抑制作用隨時(shí)間減弱甚至轉(zhuǎn)為激活作用，Cu添加濃度與過(guò)氧化氫酶、蔗糖酶活性均顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05，P<0.01）。這與閆雷等[23]發(fā)現(xiàn)土壤培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中Cd對(duì)蔗糖酶活性的抑制率隨時(shí)間先增大后減小，且Cu、Cd、Zn及Pb對(duì)蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶活性多表現(xiàn)為抑制作用的結(jié)果相似[36-37]。此外，有研究發(fā)現(xiàn) OTC、SNR、SM2及ENR等抗生素單一污染對(duì)蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶活性均表現(xiàn)出抑制作用[36，38]，支持了本研究DOX污染能抑制蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶活性的結(jié)論。

整體而言，復(fù)合污染物對(duì)于土壤酶活性的污染效應(yīng)較單一污染物高（圖2），這可能與DOX能通過(guò)官能團(tuán)與Cu2+發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，互相影響并改變其存在形態(tài)，從而使 DOX、Cu復(fù)合時(shí)能對(duì)土壤酶活性產(chǎn)生協(xié)同促進(jìn)/抑制作用[36]。研究發(fā)現(xiàn) Cu、DOX復(fù)合污染對(duì)脲酶活性多表現(xiàn)為先抑制后促進(jìn)，但Cu400+DOX15復(fù)合脅迫對(duì)脲酶活性始終表現(xiàn)出強(qiáng)抑制作用，這可能是因?yàn)閮烧吒邼舛券B加會(huì)降低土壤脲酶專(zhuān)性微生物的數(shù)量、有機(jī)質(zhì)含量等，導(dǎo)致脲酶難以修復(fù)該污染毒性。Cu、DOX復(fù)合污染對(duì)蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶活性表現(xiàn)出抑制作用，這與前人通過(guò)土壤培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)土霉素與Cd復(fù)合污染以及OTC、SNR、SM2與 Cu復(fù)合污染對(duì)蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶活性均表現(xiàn)出抑制作用，且抑制強(qiáng)度相較于抗生素單一污染更大的研究結(jié)果類(lèi)似[23，36]。但DOX和Cu對(duì)土壤酶活性的復(fù)合污染效應(yīng)，不管是協(xié)同作用還是拮抗作用，都并非各單一污染物毒性作用的加和，而是在各污染物間存在著復(fù)雜的交互作用，因此復(fù)合污染產(chǎn)生的抑制作用強(qiáng)弱還應(yīng)與二者的交互作用類(lèi)型有關(guān)，具體的影響機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

3.3 銅和強(qiáng)力霉素污染條件下土壤微生物對(duì)污染物的適應(yīng)性

本研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物在應(yīng)對(duì) DOX、Cu單一與復(fù)合外源脅迫時(shí)可能需要7～15 d的老化適應(yīng)才能增強(qiáng)土壤微生物誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性的能力，促使 4種檢出 ARGs總相對(duì)豐度整體呈先降低后升高的趨勢(shì)（圖4）。此外，研究中tetARGs總豐度最高值出現(xiàn)在CK-1d（圖4），這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)初期DOX與Cu的添加帶來(lái)的環(huán)境選擇壓力會(huì)使土壤微生物的數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使抗性基因的潛在宿主減少[39]，從而導(dǎo)致污染處理組ARGs的豐度在培養(yǎng)初期出現(xiàn)短暫降低。

在復(fù)合污染中，Cu400+DOX15復(fù)合對(duì)tetARGs豐度的影響遠(yuǎn)大于其余處理（圖4），高濃度Cu的添加在培養(yǎng)中后期具有增強(qiáng) DOX誘導(dǎo)產(chǎn)生 ARGs以提高其相對(duì)豐度的潛在能力，這可能是由于重金屬在培養(yǎng)中后期適應(yīng)環(huán)境后，可以促進(jìn)金屬和抗生素之間的金屬橋接功能，使其能以存在共選擇作用等方式降低外源抗生素的選擇壓力和豐度，并刺激ARG 的增加[9，40]。de la Iglesia 等[41]研究發(fā)現(xiàn) As、Cu等重金屬和抗生素的復(fù)合污染可以增加環(huán)境中ARGs的豐度。張佳奇等[35]總結(jié)發(fā)現(xiàn)重金屬污染地區(qū)的ARGs豐度隨著重金屬污染水平增加而增加。Wang等[42]類(lèi)似研究表明恩諾沙星和Cd復(fù)合污染對(duì)氨氧化細(xì)菌amoA基因數(shù)的抑制率明顯存在時(shí)間—效應(yīng)關(guān)系，且復(fù)合污染具有更高的抑制率。Lin等[43]表明施肥土壤中 ARGs豐度上升可能與 Cu、Zn的積累密切相關(guān)。以上研究均有效支撐本文上述結(jié)果。

研究還發(fā)現(xiàn)，tetA和另三種tet基因（tetC、tetG和tetW）的相對(duì)豐度存在顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.05），表明tetA豐度變化在一定程度上可以表征其余三種抗性因的變化趨勢(shì)。tetC豐度和tetW豐度、tetG豐度和tetARGs總豐度存在極顯著強(qiáng)正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），其相關(guān)系數(shù)分別為0.985和0.999，表明上述兩兩基因類(lèi)型在某種程度上可以互相表達(dá)其豐度水平，但這些基因之間是否存在確切的指代關(guān)系仍需更多的研究來(lái)證明。

4 結(jié) 論

土壤培養(yǎng)條件下，Cu與DOX單一及復(fù)合污染會(huì)顯著抑制土壤微生物呼吸（P<0.05），其對(duì)脲酶活性主要為促進(jìn)作用，對(duì)蔗糖酶、過(guò)氧化氫酶活性主要表現(xiàn)為抑制作用。相對(duì)于單一污染，復(fù)合污染對(duì)土壤微生物呼吸、酶活性及抗性基因豐度的影響程度更明顯，其中Cu400+DOX8復(fù)合對(duì)酶活性的影響程度更為明顯。此外，外源 DOX、Cu添加帶來(lái)的環(huán)境變化在培養(yǎng)初期會(huì)使土壤微生物數(shù)量和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，使抗性基因的潛在宿主減少，從而導(dǎo)致培養(yǎng)初期抗性基因豐度會(huì)出現(xiàn)短暫降低，且添加高濃度Cu會(huì)潛在提高DOX在培養(yǎng)終期誘導(dǎo)產(chǎn)生ARGs的能力水平，提高tet基因的相對(duì)豐度。